PTEN誘導激酶1抵抗胃癌細胞凋亡并誘導奧沙利鉑耐藥

吳珍珍 劉志宏 楊楠彥 吳晶晶 梁俊廣 孫麗

南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院腫瘤內(nèi)科（廣州510515）

PTEN誘導激酶1（PTEN-induced kinas 1，PINK1）是一種線粒體相關(guān)蛋白。研究報道，PINK1 可參與多種線粒體相關(guān)信號通路的調(diào)控，在帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有重要作用［1-3］。研究顯示，在氧化應(yīng)激條件下，PINK1 可通過上調(diào)抗凋亡相關(guān)基因，如Bcl-xL 等，并參與PI3K/Akt/mTOR 信號通路，起到保護神經(jīng)元的作用［4-6］。近年來研究［7-11］發(fā)現(xiàn)，PINK1 在多種腫瘤組織中均顯著高表達，且參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及耐藥。氧化應(yīng)激所激活的信號轉(zhuǎn)導通路亦是腫瘤進展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一［12］。進一步對PINK1 是否通過氧化應(yīng)激參與腫瘤進展進行了探索，發(fā)現(xiàn)PINK1 可對腫瘤細胞線粒體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）平衡產(chǎn)生影響，通過改變ROS 產(chǎn)量激活下游代謝相關(guān)通路［13］。目前關(guān)于PINK1 在腫瘤中的作用研究尚處于起步階段，其在胃癌中的具體作用機制尚未見相關(guān)文獻報道。PINK1 在氧化應(yīng)激過度刺激的胃癌細胞中如何起作用，PINK1 是否可通過調(diào)控氧化應(yīng)激參與胃癌的發(fā)生及發(fā)展，上述問題亦未見相關(guān)研究。本研究擬在細胞水平初步探討PINK1 在胃癌細胞中的作用，以及其對于化療敏感性的影響，為開發(fā)胃癌新的治療靶點提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞人永生化胃上皮細胞株GES-1、人胃癌細胞株BGC803、BGC823、MKN45、MGC803、SGC7901 來自于南方醫(yī)院腫瘤科實驗室。

1.1.2 組織標本76 例接受奧沙利鉑為基礎(chǔ)的術(shù)后輔助治療的胃癌石蠟病理標本來自于南方醫(yī)院，應(yīng)用世界衛(wèi)生組織胃癌病理標準進行組織學分類及分級，術(shù)后臨床及病理分期均采用國際抗癌聯(lián)盟和美國癌癥聯(lián)合委員會（UICC/AJCC）制定的第七版胃癌分期標準。入組標準：（1）接受胃癌標準D2 根治術(shù)；（2）術(shù)后病理明確為胃腺癌；（3）術(shù)前均未接受新輔助放化療；（4）術(shù)后接受含奧沙利鉑的mFOLFOX6 方案或CapeOX 方案輔助化療，但未接受放療。所需的患者數(shù)據(jù)信息均通過查閱患者手術(shù)前以及手術(shù)后的病歷資料獲得，且所有病例隨訪資料齊全。本研究均已通過南方醫(yī)科大學倫理委員會的申請。

1.1.3 主要試劑PINK1 小干擾RNA（干擾片段序列詳見表1）、基因引物購于上海生工生物工程股份有限公司；PINK1、GAPDH 抗體購于Abcam公司。

表1 PINK1 干擾片段序列列表Tab.1 Interference fragment sequence of PINK1

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR檢測細胞株中PINK1及凋亡相關(guān)基因表達RNA 提取和qRT-PCR：按照Trizol 說明書使用試劑盒提取細胞的總RNA，再使用紫外分光光度儀檢測RNA 濃度及純度，并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將所提RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用定量即時聚合酶鏈鎖反應(yīng)（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）的方法檢測細胞中PINK1的表達量，GAPDH 作為內(nèi)參來標定并測算出相對定量值（RQ 值）（表2）。

1.2.2 小干擾RNA瞬時轉(zhuǎn)染胃癌MKN45細胞于六孔板中每孔接種5 × 105個MKN45 細胞，嚴格按照Lipofectamine 2000 說明書進行轉(zhuǎn)染，48 h 后通過qRT-PCR、Western blot 實驗來驗證轉(zhuǎn)染效果。

表2 引物序列列表Tab.2 Primer sequence list

1.2.3 Western blot 檢測轉(zhuǎn)染后MKN45 細胞中PINK1 的表達瞬時轉(zhuǎn)染RNA 干擾片段24 h 后，在冰上使用蛋白裂解液分離提取MKN45 細胞中的總蛋白，高溫變性后將蛋白樣本加入聚丙烯酰胺分離凝膠中，將蛋白電泳分離開后進行轉(zhuǎn)膜，隨后采用5%脫脂牛奶封閉1 h，4 ℃一抗孵育過夜，洗滌后用熒光二抗室溫孵育1 h，TBST 清洗3 次后使用紅外激光成像分析系統(tǒng)（雙色odyssey）顯示得到PINK1 和GAPDH 的蛋白顯影條帶。

1.2.4 MTT 法實驗檢測胃癌細胞增殖能力的改變將細胞接種在96 孔板中（1 × 105/孔），并設(shè)置平行孔，相應(yīng)處理后予5 mg/mL 四甲基偶氮唑鹽（3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT），即0.5%MTT 溶液孵育4 h，隨后取出加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μL 進行室溫溶解，震蕩10 min，多功能酶標儀490 nm 波長檢測吸光度值。

1.2.5 細胞劃痕實驗檢測PINK1 對于胃癌細胞遷移能力的影響將轉(zhuǎn)染小干擾RNA 的MKN45 細胞種于24 孔板中（5 × 105/孔），24 h 后待細胞貼壁長滿用100 μL 槍頭比著直尺垂直于24 孔板進行劃痕，PBS 洗滌3 次后拍照，孵箱培養(yǎng)24 h 后再次拍照。

1.2.6 Transwell 侵襲實驗檢測PINK1 對于胃癌細胞侵襲能力的影響將200 μL 轉(zhuǎn)染siRNA 的MKN45 細胞混懸液置于Transwell 小室上室中，同時下室加入700 μL 含10%胎牛血清1640 培基，孵育24 h 后甲醇固定10 min、結(jié)晶紫染色30 min，置于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照、計數(shù)。

1.2.7 免疫組化將石蠟病理標本切成4 μm 厚度切片，脫蠟至水、抗原修復后，PINK1 一抗4 ℃孵育過夜，洗滌后二抗孵育1 h，二抗室溫孵育1 h，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色1 min，蘇木素復染3 min，梯度脫水、透明，封片，鏡下觀察。染色評分分別由3 位病理專家結(jié)合臨床病理參數(shù)進行。結(jié)果根據(jù)其表達強弱分為0 ～6 分，0 分為陰性表達，1 ～5分為陽性表達，6分為強陽性表達。

1.2.8 統(tǒng)計學方法采用GraphPad Prism 7.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；兩組以上組間比較采用方差分析。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為組間差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建并驗證PINK1 沉默的胃癌細胞株采用qRT-PCR 技術(shù)檢測不同胃癌細胞（BGC803、BGC823、MKN45、MGC803 和SGC7901）及永生化的上皮細胞（GES-1）中PINK1 的表達情況，發(fā)現(xiàn)PINK1 在胃癌細胞中顯著高表達，其中在MKN45的表達最高（圖1A）。然后構(gòu)建3 條siRNA 沉默序列，分別針對PINK1 序列的555（siPINK1-1）、1030（siPINK1-2）、1728（siPINK1-3）位點，瞬轉(zhuǎn)至MKN45后PCR 驗證其沉默效率，發(fā)現(xiàn)siPINK1-1 沉默效果最佳（圖1B），因此隨后的實驗均采用此沉默序列。同時，進一步的蛋白實驗也證實，siPINK1-1干擾片段可以顯著抑制MKN45 細胞PINK1 的表達（圖1C、1D）。

圖1 構(gòu)建并驗證PINK1 沉默的胃癌細胞株Fig.1 Construction and verification of PINK1 knock-down gastric cancer cell lines

2.2 PINK1 下調(diào)可抑制胃癌細胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移MTT檢測PINK1下調(diào)對胃癌細胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示沉默PINK1表達之后，胃癌細胞的增殖能力有下調(diào)趨勢，存活細胞顯著減少（圖2A）。該結(jié)果從增殖層面證實PINK1 可能對于胃癌細胞存活有重要意義。Transwell、劃痕實驗結(jié)果顯示，相較于對照組，沉默PINK1后可顯著下調(diào)胃癌細胞的遷移能力（圖2B、圖2C，P＜0.001）及侵襲能力（圖2D、圖2E），結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義。以上結(jié)果顯示，PINK1 可促進胃癌細胞的增殖、侵襲及遷移能力，下調(diào)PINK1的表達可部分逆轉(zhuǎn)胃癌細胞的惡性生物學行為。

2.3 PINK1 促進胃癌細胞凋亡既往研究［14-18］證實，胃癌中存在高水平的氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激與胃癌的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系密切；同時PINK1 作為線粒體相關(guān)蛋白，在多個層面參與了氧化應(yīng)激［4-6，13］。PINK1 可能影響了胃癌細胞的氧化應(yīng)激水平，從而發(fā)揮其促癌作用。利用ROS（活性氧）試劑盒，檢測了MKN45 細胞ROS 的變化，發(fā)現(xiàn)沉默PINK1可促進ROS 的產(chǎn)生（圖3A、圖3B，P＜0.001）。

檢測凋亡相關(guān)基因的表達結(jié)果顯示，相較于對照組，下調(diào)PINK1可顯著抑制MKN45細胞中Bcl-2的表達（圖3C），而Caspases-3表達無顯著差異（圖3D）。這可能與Caspases-3 作為細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，主要以磷酸化的形式產(chǎn)生作用有關(guān)，需進一步探討其蛋白水平的改變。以上結(jié)果提示在氧化應(yīng)激的環(huán)境下，PINK1可抵消部分升高的ROS，從而使細胞內(nèi)的ROS 在一個較為適合腫瘤細胞生存的水平，誘導腫瘤抗凋亡基因表達的上調(diào)，促進腫瘤細胞的存活。

圖2 PINK1 誘導胃癌細胞增殖及遷移Fig.2 PINK1 induces proliferation and migration of gastric cancer cells

圖3 PINK1 促進胃癌細胞凋亡Fig.3 PINK1 promotes apoptosis of gastric cancer cells

2.4 下調(diào)PINK1 可誘導胃癌細胞化療增敏考慮到藥物耐藥與氧化應(yīng)激適應(yīng)密切相關(guān)［19-20］。隨后檢測了PINK1 是否可影響胃癌細胞的藥物敏感性。不同濃度的奧沙利鉑處理MKN45 細胞24 h，發(fā)現(xiàn)下調(diào)PINK1 表達可顯著改善胃癌細胞對于奧沙利鉑的敏感性，細胞增殖受到顯著抑制（圖4A）。同時檢測了野生型胃癌細胞MKN45 在不同濃度的奧沙利鉑的刺激下PINK1 的表達情況，在40 μmol/L 的刺激下PINK1的表達明顯增加（圖4B）。臨床數(shù)據(jù)顯示，76 例接受奧沙利鉑為基礎(chǔ)的術(shù)后輔助治療的胃癌患者石蠟病理標本進行PINK1 蛋白免疫組化檢測，其中2 例由于脫片嚴重，無法評估免疫組化結(jié)果，在后續(xù)分析中剔除。臨床數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)PINK1 高表達的患者，含奧沙利鉑術(shù)后輔助治療的患者復發(fā)風險增加（圖4C）。

圖4 PINK1 影響胃癌奧沙利鉑藥物敏感性Fig.4 PINK1 influences oxaliplatin sensibility of gastric cancer cells

3 討論

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，患者在現(xiàn)有治療手段干預下尚無法獲得滿意的總體生存率，因此尋找新的治療策略迫在眉睫［21-22］。氧化應(yīng)激是機體活性氧成分與抗氧化系統(tǒng)之間平衡失調(diào)引起的一系列適應(yīng)性的反應(yīng)，而氧化應(yīng)激所激活的促癌信號轉(zhuǎn)導通路則是腫瘤進展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［14-18］。尋找并阻斷氧化應(yīng)激刺激下腫瘤細胞中的促癌信號轉(zhuǎn)導通路，可能成為治療胃癌的新靶點［17］。

PINK1 是一種線粒體相關(guān)蛋白，可調(diào)控線粒體穩(wěn)態(tài)，具有促進細胞生存、抵抗凋亡以及細胞保護等細胞生物學功能，對線粒體內(nèi)ROS 的平衡具有重要作用［4-6，13］。PINK1被報道參與調(diào)控多個腫瘤生物學過程，通過影響線粒體自噬、腫瘤免疫、腫瘤干性等方面誘導腫瘤的惡性生物學行為［7-11］。然而PINK1 在胃癌中的作用目前鮮有報道。本研究首次發(fā)現(xiàn)PINK1 在胃癌細胞中高表達，參與調(diào)控胃癌細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學行為并促進胃癌細胞存活，初步闡明了PINK1 的致癌作用；進一步的機制探討，發(fā)現(xiàn)PINK1 可抑制胃癌細胞ROS 的產(chǎn)生，促進抗凋亡基因的表達，誘導胃癌細胞的存活。

奧沙利鉑是胃癌治療的最有效藥物之一，通過與DNA 的相互作用，阻斷DNA 復制，引起細胞周期阻滯和細胞死亡［23］。另一方面，奧沙利鉑還可以通過氧化應(yīng)激反應(yīng)生成過氧化氫等活性氧自由基（ROS）產(chǎn)生細胞毒性，導致DNA 氧化損傷［24］。氧化應(yīng)激水平的改變、ROS 產(chǎn)生抵消均可能是導致奧沙利鉑耐受的重要原因。本研究結(jié)果顯示，奧沙利鉑可上調(diào)胃癌細胞PINK1 的表達，下調(diào)PINK1 的表達可顯著改善腫瘤細胞對于奧沙利鉑的敏感性；同時PINK1 還可以下調(diào)胃癌細胞ROS的產(chǎn)生。初步推測PINK1 可能是導致奧沙利鉑治療失敗的原因，而進一步的臨床數(shù)據(jù)也提示在接受奧沙利鉑輔助治療的胃癌患者中PINK1 高表達者復發(fā)風險增加。

綜上所述，本研究初步在胃癌細胞水平探索了PINK1 的促腫瘤作用，發(fā)現(xiàn)PINK1 通過誘導抗凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，保護氧化應(yīng)激下胃癌細胞存活，并誘導奧沙利鉑耐藥。然而，本研究僅在細胞水平和臨床數(shù)據(jù)上對PINK1 在胃癌中的作用進行了初步探討，在進一步闡明具體機制關(guān)鍵環(huán)節(jié)仍需要進一步補充。PINK1 在胃癌中除了氧化應(yīng)激途徑是否參與其他信號通路而對胃癌的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響也有待更為深入的研究。目前已有研究報道將PINK1 與腫瘤免疫調(diào)節(jié)相聯(lián)系［25］。隨著腫瘤免疫治療的興起，PINK1 在腫瘤微環(huán)境與腫瘤相關(guān)免疫中的作用可能成為下一步研究關(guān)注的方向。