基于流式細(xì)胞儀對(duì)杏屬植物基因組大小的測(cè)定

張俊環(huán)，楊 麗，姜鳳超，張美玲，孫浩元，王玉柱

(1.北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院，北京 100093；2.國(guó)家林業(yè)和草原局杏工程技術(shù)研究中心，北京 100093)

基因組大小(或稱C-值)是指單倍體細(xì)胞中全套染色體的DNA總量，以質(zhì)量pg(Picogram)或堿基對(duì)數(shù)目Mb(Million base pair)為單位[1]，而1 pg相當(dāng)于978 Mb[2]。流式細(xì)胞儀法由于方法簡(jiǎn)便、快捷、靈敏度高、檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠，已成為測(cè)量植物基因組大小的主要手段[3-5]。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞DNA含量，通常采用特異的熒光染料碘化丙啶(Propidium iodide，PI)對(duì)其進(jìn)行染色，PI通過均勻地插入雙鏈DNA的堿基對(duì)中，對(duì)細(xì)胞核DNA進(jìn)行特異性染色，熒光分子結(jié)合DNA的量與細(xì)胞內(nèi)DNA含量呈正比，通過檢測(cè)被激發(fā)的染色細(xì)胞發(fā)射的熒光強(qiáng)度，并與內(nèi)參比較可換算出被測(cè)樣品的DNA含量[1]。近年來，多種植物在進(jìn)行高通量測(cè)序之前，先通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行基因組大小的測(cè)定，以期為高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建和基因組組裝提供數(shù)據(jù)參考[6-8]。

杏(Prunusarmeniaca)是原產(chǎn)我國(guó)的特色果樹，我國(guó)杏栽培面積和產(chǎn)量均居世界首位。杏屬于薔薇科(Rosaceae)李屬(PrunusL.)李亞屬(Prunophora)杏組/屬(Armeniaca)植物，杏屬植物共有6～12個(gè)種[9]，其中普通杏(P.armeniaca)、西伯利亞杏(P.sibirica)、遼杏(P.mandshurica)和紫杏(P.dasycarpa)這4個(gè)種是杏生產(chǎn)中常見并得到公認(rèn)的種類。另外，仁用杏(又稱大扁杏)被認(rèn)為是由普通杏(P.armeniaca)和西伯利亞杏(P.sibirica)自然種間雜交形成的類型[10-11]。杏資源種類極其豐富，不同種類在生態(tài)適應(yīng)性、形態(tài)特征等方面表現(xiàn)出多樣性，即使同一個(gè)種內(nèi)，不同品種在某些性狀上的變異也較顯著。近年來，對(duì)這些杏屬植物的研究主要集中在遺傳多樣性、親緣關(guān)系以及分類地位等方面[12-14]，而針對(duì)它們基因組大小的分析鮮見報(bào)道?；蚪M反映了生物物種全部和特定的遺傳信息，基因組大小是植物最基本也是最重要的生物多樣性特征參數(shù)。因此，本研究用流式細(xì)胞儀，通過單獨(dú)進(jìn)樣和混合進(jìn)樣結(jié)果分析，篩選出理想的內(nèi)參基因組，并以此為內(nèi)參，測(cè)定分屬于普通杏、遼杏、西伯利亞杏、仁用杏和紫杏5個(gè)種的12個(gè)杏品種資源的基因組大小，并以引進(jìn)的歐洲品種Canino為參照，比較不同種、變種及品種之間基因組大小的差異，以期為相關(guān)杏屬植物的物種進(jìn)化和分類研究以及基因組研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的13份杏資源(表1)分別屬于5個(gè)種和變種，其中普通杏4份(包括1份歐洲品種)、普通杏變種5份、西伯利亞杏1份、遼杏1份、紫杏1份、仁用杏1份。13份供試材料的嫩葉均采自北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院的杏資源圃，試驗(yàn)作為內(nèi)標(biāo)的桃品種早艷、葡萄品種瑞都科美和棗品種金絲小棗的嫩葉均采自北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院的資源圃。

表1 供試的杏資源信息Tab.1 Information of tested apricot materials

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞核懸液制備 按照試劑盒Cystain?PI Absolute (sysmex)的說明書進(jìn)行，取幼嫩、干凈的新鮮葉片，剪取小于0.5 cm2大小的新鮮嫩葉，放入培養(yǎng)皿中，加入500 μL提取緩沖液，用鋒利的刀片一次性快速切碎，材料整個(gè)過程浸沒在提取液里；完全切碎后再加入4 ℃下預(yù)冷的2 mL含有碘化丙啶(Propidium iodide, PI)12 μL和RNaseA 6 μL的染色液，之后立即用50 μmol/L濾膜過濾到5 mL收集管中，置4 ℃下避光染色1～2 h，獲得細(xì)胞核懸浮液，置于冰上備用。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。以二倍體的桃品種早艷、葡萄品種瑞都科美和棗品種金絲小棗分別做內(nèi)標(biāo)，篩選適宜的內(nèi)標(biāo)植物。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 用德國(guó)Partec流式細(xì)胞儀(CyFlow-Space)進(jìn)行檢測(cè)，每組樣品至少收集10 000個(gè)粒子，然后根據(jù)內(nèi)標(biāo)植物和待測(cè)植物的核濃度，調(diào)整比例進(jìn)行混合，使內(nèi)標(biāo)植物和代謝植物的核濃度盡量一致，再次共進(jìn)樣檢測(cè)，流式細(xì)胞儀測(cè)定內(nèi)標(biāo)與待測(cè)植物的熒光峰圖，以FlowMax軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，CV值控制在5%以內(nèi)。

1.2.3 樣品基因組大小的計(jì)算 熒光信號(hào)的強(qiáng)度代表了細(xì)胞核內(nèi)物質(zhì)的濃度，與細(xì)胞核DNA含量呈正比。樣品的基因組大小按照以下公式計(jì)算：待測(cè)樣品基因組大小=(待測(cè)樣品熒光強(qiáng)度/內(nèi)標(biāo)樣品熒光強(qiáng)度)×內(nèi)標(biāo)植物基因組大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)標(biāo)植物基因組的確定

以杏串枝紅、陜梅和大優(yōu)佳杏為例，分別以二倍體葡萄品種瑞都科美、二倍體桃早艷和二倍體棗金絲小棗的基因組做內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行內(nèi)標(biāo)基因組的篩選。杏、葡萄、桃和棗的基因組大小測(cè)定結(jié)果如圖1，可見，在優(yōu)化的試驗(yàn)條件和儀器參數(shù)設(shè)定下，4種植物基因組的流式直方圖中均出現(xiàn)了清晰的吸收峰，并且，杏和桃的流式直方圖中均出現(xiàn)了雙峰(圖1-A、C)，且雙峰出峰位置比例保持較為穩(wěn)定，通過計(jì)算發(fā)現(xiàn)，2個(gè)峰的道數(shù)值(出峰位置)呈2倍關(guān)系，由此可知，第1個(gè)峰代表的是G0/G1期的DNA含量，第2個(gè)峰代表的是G2/M期的DNA含量。流式細(xì)胞儀測(cè)定植物基因組大小，通常是通過比較G0/G1期的峰值來計(jì)算基因組大小。由圖1可知，杏、桃、葡萄和棗的G0/G1期峰的熒光強(qiáng)度值分別為119.93，103.54，190.86，176.99，根據(jù)基因組大小計(jì)算公式，在內(nèi)標(biāo)植物相同時(shí)，基因組大小與熒光峰值呈正比，由此判斷4種植物的基因組大小順序?yàn)樘?杏<棗<葡萄，與已經(jīng)發(fā)表的這4種植物基因組大小順序相符(杏294 Mb、桃265 Mb、棗438 Mb、葡萄487 Mb)[1]。

圖1 杏、葡萄、桃和棗分別單獨(dú)進(jìn)樣的流式細(xì)胞儀測(cè)試結(jié)果Fig.1 Flow cytometric fluorescent detection image of apricot, grape, peach and jujube

為了準(zhǔn)確測(cè)定杏屬植物基因組的大小，避免流式細(xì)胞儀在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)PI核染色靈敏度的差異，一般采取測(cè)試植物樣品與內(nèi)參樣品共進(jìn)樣，在相同條件下同時(shí)測(cè)定待測(cè)植物與內(nèi)標(biāo)植物的熒光峰值，通過比值估測(cè)待測(cè)植物基因組的大小。杏與不同內(nèi)參共進(jìn)樣得到的混合峰如圖2所示。在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下，混合樣品的吸收峰均可同時(shí)被檢測(cè)到，但是杏的細(xì)胞核和桃的細(xì)胞核卻不易分開，2C值吸收峰幾乎重疊(圖2-B)，因?yàn)槎叩幕蚪M大小比較接近。葡萄瑞都科美的2C熒光峰(G0/G1)位于杏的G0/G1期峰與G2/M期峰之間(圖2-A)，并且與杏細(xì)胞分裂的G2/M期幾乎重疊，互相干擾。由圖2-C可以看出，金絲小棗的2C值峰也位于杏的G0/G1期峰與G2/M期峰之間，但金絲小棗的基因組比葡萄小，它的G0/G1期峰的熒光強(qiáng)度值小于葡萄，故距離杏G2/M期峰相對(duì)稍遠(yuǎn)，杏與金絲小棗混合樣品的檢測(cè)直方圖中無重疊峰，且區(qū)分度良好，可獲得較少雜峰的峰型圖。因此，選用基因組大小已知的金絲小棗作為內(nèi)標(biāo)，可保證測(cè)定杏屬植物基因組大小的合理性和準(zhǔn)確性。通過比較單獨(dú)進(jìn)樣和共進(jìn)樣，確認(rèn)杏和棗熒光峰的相對(duì)位置，從而估算杏基因組的大小。其他杏屬植物基因組的大小測(cè)定均以棗基因組做內(nèi)參。

圖2 杏與葡萄、杏與桃、杏與棗合樣品流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The result of mixed samples of apricot with grape, peach or jujube, respectively

2.2 不同杏屬植物基因組大小的比較

以二倍體棗品種金絲小棗(C值0.44 pg，基因組大小為424 Mb)[2]為內(nèi)標(biāo)，通過比較待測(cè)樣品和內(nèi)參G0/G1期峰，計(jì)算得出杏屬植物不同種和品種的基因組大小，發(fā)現(xiàn)杏屬植物的基因組大小在(245.07±0.842)～(300.60±1.181)Mb。杏屬植物不同種和品種間基因組大小均有一定的差異，其中所測(cè)試的5個(gè)種間的差異均達(dá)到了顯著水平。由表2可知，基因組相對(duì)較大的是普通杏變種陜梅，為(300.60±1.181)Mb，其次為串枝紅，基因組大小為(291.59±1.642)Mb，二者差異顯著且均顯著高于其他品種；然后依次是Ⅲ組(遼杏及普通杏變種賽買提和皮乃孜)，Ⅳ組(西伯利亞杏的綠萼山杏及普通杏品種駱駝黃和青蜜沙)，Ⅴ組(普通杏變種垂枝山杏和仁用杏品種龍王帽)，Ⅳ組(普通杏變種李光杏類型大優(yōu)佳和普通杏歐洲品種類型卡尼諾)，組間差異均顯著但組內(nèi)差異均不顯著；基因組相對(duì)較小的是紫杏(245.07±0.842)Mb ，顯著低于其他品種。在普通杏的3個(gè)品種中，駱駝黃與青蜜沙杏的基因組大小無顯著差異，但均顯著小于串枝紅杏。另外，同屬于李光杏類型的3個(gè)品種間也有一定的差異，賽買提和皮乃孜的基因組大小分別是(279.45±4.619)Mb和(278.36±0.859)Mb，二者無顯著差異，但均顯著大于大優(yōu)佳杏。

表2 13個(gè)杏品種的基因組大小Tab.2 The genome size of 13 cultivars of P. armeniaca

3 結(jié)論與討論

基因組大小的測(cè)定一般采用內(nèi)標(biāo)法[5]，使用內(nèi)標(biāo)的分析能夠降低樣品制備以及儀器自身引起的誤差，因此更適用于精確的分析[15]。有研究表明，同一個(gè)植物類型材料，選擇的內(nèi)標(biāo)植物不同、測(cè)定方法不同(包括內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法、染色方法等)而得到大小不同的基因組測(cè)定值[2, 16-17]。內(nèi)標(biāo)植物的選擇對(duì)準(zhǔn)確測(cè)定待測(cè)植物的基因組很重要[18]，本研究?jī)?nèi)標(biāo)基因組的選擇標(biāo)準(zhǔn)，主要考慮了以下幾方面：已經(jīng)發(fā)表基因組大小的二倍體果樹植物，基因組大小與杏基因組大小相差不是太大，但要保證2種材料的熒光峰(G0/G1期峰)不能重疊。在實(shí)際檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，可能是因?yàn)樾舆@一物種細(xì)胞分裂間期較短，杏材料同時(shí)出現(xiàn)了細(xì)胞分裂的G0/G1期(二倍體DNA)熒光峰和G2/M期(DNA加倍)熒光峰；因此，內(nèi)參植物的熒光峰需要滿足與杏基因組的2個(gè)熒光峰均不重疊的條件。本研究中待測(cè)植物的2個(gè)熒光峰與金絲小棗測(cè)定的直方圖中熒光峰均無重疊，區(qū)分度良好，試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，故金絲小棗在本研究中是一種較為理想的內(nèi)標(biāo)植物。以金絲小棗為內(nèi)參測(cè)定普通杏基因組大小為272.65～291.59 Mb，與以雞血紅細(xì)胞為內(nèi)參測(cè)定杏基因組大小為294 Mb相接近[1]，這也表明本研究?jī)?nèi)標(biāo)植物的選擇是準(zhǔn)確可信的。

基因組大小是指真核生物單倍體基因組所含DNA的總量，可反映植物種間和品種間的差異[19-21]，本研究也得到了類似的結(jié)果。測(cè)試的杏5個(gè)種間基因組大小差異較大，達(dá)到了顯著水平，普通杏基因組相對(duì)較大，尤其是串枝紅杏(291.59 Mb)，紫杏基因組最小(245.07 Mb)；西伯利亞杏品種綠萼山杏與普通杏品種駱駝黃和青蜜沙差異不顯著，遼杏與普通杏變種賽買提和皮乃孜差異不顯著，兩組間差異小于其與紫杏之間的差異，說明普通杏與西伯利亞杏和遼杏的親緣關(guān)系較近，而與紫杏的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這與馮晨靜等[22]采用ISSR分析的結(jié)果相一致。另外，目前研究支撐杏屬植物的演化趨勢(shì)為：普通杏→遼杏→山杏[9]，從普通杏這一最原始的植物學(xué)種到山杏的進(jìn)化過程中，基因組大小沒有明顯的變化，與沈慧等[23]在棗屬植物上的研究結(jié)果不一致，酸棗到棗的進(jìn)化中則可能伴隨著基因組的縮減。“C值悖論”認(rèn)為基因組的大小和物種的進(jìn)化復(fù)雜度之間沒有嚴(yán)格的對(duì)應(yīng)關(guān)系[24],因此，杏基因組大小與杏屬植物種類進(jìn)化間的關(guān)系有待進(jìn)一步的研究揭示。

同一種內(nèi)不同變種類型的基因組大小差異也較大，普通杏的變種陜梅與垂枝山杏及李光杏類型(賽買提、大優(yōu)佳和皮乃孜)的基因組大小差異均顯著，且李光杏類型中的賽買提和皮乃孜與大優(yōu)佳的基因組大小差異亦達(dá)顯著水平，其中陜梅的基因組是所測(cè)13份杏材料中基因組最大的，達(dá)到了300.60 Mb。以李光杏類型中的大優(yōu)佳品種為例，與普通杏變種陜梅進(jìn)行比較，二者植物形態(tài)也差異較大，花、果實(shí)和葉片都明顯不同。陜梅杏在杏屬中花朵最大、花瓣最多、開花期最遲，適宜觀賞，很少結(jié)果實(shí)；屬于李光杏變種的大優(yōu)佳的最大特點(diǎn)是果實(shí)表面光滑無毛，果實(shí)小，含糖量高，葉片小而厚，抗旱性強(qiáng)[25]。基因組大小與其表型性狀有著復(fù)雜的關(guān)系。關(guān)于基因組大小與植物表型之間的相關(guān)性研究較少，目前比較確定的觀點(diǎn)認(rèn)為，基因組大小和細(xì)胞大小呈正相關(guān)關(guān)系[24,26]。DNA含量通過影響細(xì)胞大小和有絲分裂周期時(shí)間而影響表型，特別是在植物進(jìn)化和適應(yīng)性方面起著關(guān)鍵作用[17]。Knight等[27]研究得出相似的結(jié)果，基因組大小與細(xì)胞體積的大小、保衛(wèi)細(xì)胞的長(zhǎng)度以及表皮細(xì)胞面積等表型性狀相關(guān)性較強(qiáng)，而與單位面積葉質(zhì)量、光合作用效率等表型相關(guān)性較弱。本研究基因組相對(duì)較小的大優(yōu)佳杏原產(chǎn)我國(guó)新疆地區(qū)，新疆光照強(qiáng)、干旱少雨，為了適應(yīng)這種自然環(huán)境，葉片變小、變厚，可能是由于葉片細(xì)胞體積的大小、保衛(wèi)細(xì)胞的長(zhǎng)度以及表皮細(xì)胞面積變小的結(jié)果。而細(xì)胞的大小是為了適應(yīng)于基因組大小的改變而形成的被動(dòng)改變[24]?；蚪M相對(duì)較大的陜梅杏花朵較大，其細(xì)胞大小是否大于同屬的其他種類和品種，仍有待進(jìn)一步的研究。本研究對(duì)杏5個(gè)種或類型的13個(gè)變種或品種基因組大小的測(cè)定研究，可為杏屬植物基因組、轉(zhuǎn)錄組和資源的鑒定及分類等方面的深入研究提供參考。