水稻OsURGT1基因的生物信息學及表達譜分析

蘇 瑩，杜 強，郭崇炎，周 敏，石偉杰，趙 瓊，吳小雨，王志龍，陳秋紅

(1.湖南農業(yè)大學 農學院，水稻油菜抗病育種湖南省重點實驗室，作物基因工程湖南省重點實驗室， 湖南 長沙 410128；2.贛州市花卉研究所，江西 贛州 341413)

磷(P)在植物生長發(fā)育過程中必不可少，在植物細胞中，磷以磷酸鹽的形式存在，或與有機化合物結合，形成核苷酸、磷酸化代謝產物、磷脂等。擬南芥質體內膜上的磷酸轉運蛋白(pPT：Plastic Phosphate translocator)，是以無機磷酸鹽(Pi)或磷酸化的C3、C5、C6化合物作為底物的逆向轉運蛋白。通過利用pPT-cDNA序列進行同源比對，在擬南芥中找到了大量磷酸轉運蛋白同源基因(PTh)，這些相關磷酸轉運蛋白(PTs：Phosphate translocators)對于維持細胞質基質中Pi的穩(wěn)態(tài)，并嚴格完成Pi與磷酸化中間體交換的反應至關重要[1-2]。根據pPT蛋白的底物特異性和序列同源性，可將其分為4個不同的亞家族，分別是TPT(Triose phosphate/phosphate translocator)[3]、XPT(Xylulose 5-phosphate/phosphate translocator)[4]、GPT(Glucose 6-phosphate/phosphate translocator)[5]和PPT(Phosphoenolpyruvate/phosphate translocator/PT)[6]，其中TPT介導以磷酸三糖和3-磷酸甘油酸酯(3-PGA)形式的固定碳從葉綠體到細胞質的輸出。TPT也是第一個在分子水平上鑒定到的質體轉運蛋白。Takemoto 等[7]對磷酸三糖/磷酸鹽轉運體(TPT)進行了一系列全原子分子動力學模擬，發(fā)現該轉運體將葉綠體基質中的有機磷酸鹽嚴格地與無機磷酸鹽進行反向交換。

細胞壁是植物區(qū)分于動物的主要結構之一，對植物不僅具有保護和支持作用，還與植物細胞的物質運輸、信號傳導等生理功能有關。細胞壁的組成結構和成分復雜多樣，主要由各類多糖物質組成。大多數細胞壁非纖維素多糖分子的合成部位是高爾基體，合成所用底物是核苷酸單糖，而核苷酸單糖主要產生于細胞質溶膠，之后再被運輸至高爾基體用于合成各類非纖維素多糖分子。核苷酸糖轉運蛋白(Nucleotide sugar transportors，NSTs)則扮演著將核苷酸單糖從細胞質溶膠運輸到高爾基體中的重要角色[8-9]。NSTs目前在部分真核生物中有所發(fā)現。因為NSTs將核苷酸單糖跨膜轉運到高爾基體中的同時從高爾基體中輸出核苷一磷酸，因此它們也屬于逆向轉運蛋白。

pPT、PTh與NSTs都屬于DMT(Drug/metabolite transportor，藥物/代謝物轉運蛋白)超家族，且pPT、PTh蛋白與NSTs蛋白的結構具有較高的相似性，在多個氨基酸殘基部位具有較高的保守性，所以將pPT、PTh與NSTs蛋白統(tǒng)稱為TPT/NST家族蛋白[2]。目前，擬南芥基因組被預測至少編碼50個TPT/NST家族成員，而水稻基因組至少編碼53個TPT/NST家族成員[8，10]。這些家族中的大部分成員功能未知，但也有部分成員的功能已被揭示。擬南芥中的AtNST-KT1蛋白被證實特異性轉運UDP-半乳糖，而不轉運其他形式的核苷酸單糖[10]。Bakker等[11]利用UDP-半乳糖轉運缺陷的中國倉鼠卵巢細胞進行功能互補試驗，在擬南芥中發(fā)現并克隆了2個能夠轉運UDP-半乳糖的基因UDP-GalT1和UDP-GalT2。Norambuena等[12]在煙草和釀酒酵母中證實擬南芥AtUTr2蛋白可以特異性地轉運UDP-半乳糖，并且定位于高爾基體，推測其可能在擬南芥半乳糖的糖綴合物合成中起重要作用。Norambuena等[13]克隆了擬南芥中的AtUTr1基因，該基因編碼一種類似于核苷酸單糖轉運蛋白的跨膜疏水蛋白，并在釀酒酵母中被驗證能夠轉運UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖。Reyes等[14]發(fā)現擬南芥的內質網主要通過AtUTr1和AtUTr3蛋白吸收UDP-葡萄糖，并且當細胞積累錯誤折疊蛋白的時候，AtUTr1和AtUTr3蛋白參與向內質網中運輸UDP-葡萄糖。當同時敲除AtUTr1和AtUTr3基因時，擬南芥的雄配子和雌配子均發(fā)育異常。擬南芥AtUTr7蛋白定位于高爾基體，在煙草和酵母表達系統(tǒng)中，AtUTr7蛋白被證實可以轉運UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖，而不轉運其他形式的核苷酸單糖。在高濃度蔗糖培養(yǎng)條件下，AtUTr7基因缺失的擬南芥突變體植株表現出側根的早期增殖以及根毛變形。此外，與野生型相比，突變體的側向根尖中低甲酯化的半乳糖醛酸聚糖的分布有差異[15]。擬南芥GONST1基因編碼核苷酸單糖轉運蛋白，利用酵母缺失突變體證實GONST1蛋白具有轉運GDP-甘露糖的活性，并且定位于高爾基體[16]。除GONST1外，擬南芥中還鑒定了多個GONST同源基因，包括GONST2、GONST3、GONST4、GONST5。利用酵母缺失突變體，證實GONST2與GONST1具有相似的轉運GDP-甘露糖的活性，而GONST3、CONST4、CONST5轉運GDP-甘露糖的活性較弱[17]。后來經Rautengarten等[18]的研究發(fā)現，GONST4能夠特異性的轉運GDP-巖藻糖，而非GDP-甘露糖，并將它重新命名為GDP-fucose transporter 1 (GFT1)。Ebert等[19]在擬南芥中鑒定了3個定位于高爾基體的UDP-木糖轉運蛋白UXT1～UXT3，UXT1除定位于高爾基體外，還定位于內質網，UXT1基因的突變將導致擬南芥莖稈細胞壁的木糖含量比野生型減少30%。Seino等[20]通過同源比對，發(fā)現在水稻中具有多個編碼UDP-半乳糖轉運蛋白的基因序列，并克隆了其中4個成員，分別命名為OsUGT1、OsUGT2、OsUGT3、OsUGT4。利用UDP-半乳糖轉運蛋白活性不足的Lec8細胞系，發(fā)現表達OsUGT1、OsUGT2、OsUGT3能夠恢復Lec8細胞的缺陷表型，而表達OsUGT4不能恢復其表型；利用酵母表達系統(tǒng)證實OsUGT4是UDP-葡萄糖轉運蛋白，而不是UDP-半乳糖轉運蛋白。水稻OsNST1蛋白在酵母缺失突變體中被證實具有轉運UDP-葡萄糖的功能，定位于高爾基體，OsNST1基因的突變導致水稻莖稈纖維素含量下降、細胞壁結構改變，從而造成植株機械強度減弱，研究表明，OsNST1蛋白為形成基質多糖提供糖基底物，從而調節(jié)纖維素的生物合成[21]。Rautengarten等[8]在擬南芥中識別和表征了6個雙功能UDP-L-鼠李糖(Rha)/UDP-D-半乳糖(Gal)轉運蛋白，命名為URGT(AtURGT1～AtURGT6)，2019年Parra-Rojas等[22]發(fā)現AtURGT2基因與擬南芥種子表皮黏液的形成有關。另外，有研究發(fā)現NSTs還可以轉運核苷硫酸鹽[23]。

基于核苷酸單糖轉運蛋白(NST)在植物中的重要性，本研究利用6個擬南芥UDP-鼠李糖/UDP-半乳糖轉運蛋白序列(AtURGT1～AtURGT6)，在水稻中比對到1個具有相同結構域的基因(LOC_Os02g40090)，其與擬南芥中的AtURGT5(At4G09810)和AtURGT6(At1G34020)基因高度同源[8]，將其命名為OsURGT1。OsURGT1基因編碼的蛋白OsURGT1含有TPT/NST結構域。本研究通過生物信息學技術對OsURGT1基因的結構、啟動子順式作用元件、編碼蛋白的氨基酸組成、親/疏水性、跨膜結構域、高級結構、進化關系進行分析；通過激素處理和非生物脅迫處理水稻幼苗，探索OsURGT1基因在多種激素和逆境處理條件下的響應表達情況，從而推測其可能參與的生物學功能。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及試劑

本試驗所用的水稻材料為秈型常規(guī)水稻T98B，種植于湖南農業(yè)大學生命科學樓。提取水稻RNA的試劑分別為TRIzol(Thermo Scientific公司)、無水乙醇、異丙醇和三氯甲烷(國藥集團)、DEPC水(生工生物公司)；反轉錄試劑盒為Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit with dsDNase(Thermo Scientific公司)；qPCR試劑盒為MonAmpTMSYBR?Green qPCR Mix(High ROX)(莫納生物科技有限公司)；處理的激素有ABA、GA、SA、Eth、MeJA、2，4-D(Sigma公司)；非生物脅迫處理所需試劑有PEG4000、CdCl2、NaCl、H2O2和硝酸鈣(國藥集團)；水稻幼苗水培試劑為霍格蘭營養(yǎng)液固體粉末(Coolaber公司)。

1.2 水稻水培營養(yǎng)液配制

取霍格蘭固體粉末1.26 g，溶解于1 000 mL的蒸餾水中，另外加入0.945 g硝酸鈣共同溶解，高溫高壓滅菌后備用。

1.3 TRIzol法提取水稻RNA，并反轉錄成cDNA

取水稻組織樣品50 mg，在預冷研缽中用液氮迅速研磨成粉。打冰備用，將研磨完的組織粉末分別各加入1 mL的TRIzol，旋渦振蕩后置于冰上靜置5 min，低溫(4 ℃)離心(10 000 r/min)10 min后，吸取上清至新的1.5 mL離心管中，并加入三氯甲烷，混勻后冰上靜置5 min，低溫(4 ℃)離心(12 000 r/min)10 min后，吸取上清至新的1.5 mL離心管中，并加入異丙醇，輕緩混勻后冰上靜置5 min，低溫(4 ℃)離心(10 000 r/min)10 min后，倒掉上清，加入500 μL 75%乙醇，混勻后，低溫(4 ℃)離心(10 000 r/min)5 min，倒掉上清，室溫放置2 min，加入DEPC水于55 ℃溶解RNA，溶解3 min后保存于-80 ℃冰箱備用。

反轉錄前先配置DNA消化反應體系。在干凈的PCR管中加入1 μg的RNA、1 μL的dsDNase和1 μL的10×dsDNase Buffer，并加DEPC水補充到10 μL體積，之后37 ℃溫育2 min，加入1 μL 10 mmol/L DTT。然后進行反轉錄合成cDNA第一鏈。在以上消化好的11 μL RNA模板中分別加入1 μL的100 μmol/L Oligo(dT)18Primer、1 μL的10 mmol/L dNTP Mix、4 μL 5×RT Buffer和1 μL的Maxima H Miuns Enzyme Mix，最后補充2 μL 的DEPC水，混勻于50 ℃溫育30 min，85 ℃溫育5 min。

1.4 qRT-PCR反應

設計特異性良好的qRT-PCR引物，擴增產物長度控制在80～200 bp，引物長度為18～25 bp。qRT-PCR反應體系構建，在干凈的PCR管中加10 μL MonAmpTMSYBR?Green qPCR Mix，0.4 μL的上引(下引)，cDNA模板為2 μL(cDNA原液稀釋10倍)，最后加DEPC水補充到20 μL。

1.5 生物信息學分析

利用ExPASy-ProtParam工具(https：//web.expasy.org/protparam/)分析OsURGT1蛋白的氨基酸組成及理化性質；利用ExPASy-ProtScale工具(https：//web.expasy.org/protscale/)分析OsURGT1蛋白的親/疏水性。利用軟件TMHMM Server v.2.0對OsURGT1蛋白進行跨膜結構域預測。使用軟件GOR4、Phyre2預測OsURGT1蛋白的二級結構和三級結構。在NCBI數據庫中通過同源比對，選擇16個與OsURGT1蛋白高度同源的物種蛋白，運用Mega 6.06軟件對這些蛋白以臨近法構建系統(tǒng)進化樹并進行分析。運用在線網站Exon-Intron Graphic Maker(http：//www.wormweb.org/exonintron)對OsURGT1基因進行內含子和外顯子分析。利用 Plant CARE 在線網站(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/)對OsURGT1基因的啟動子序列進行順式作用元件分析。

1.6 OsURGT1基因在水稻中的轉錄表達譜分析

取三葉期水稻的根、葉片，成熟期的根、莖、葉、葉鞘、穗，用于OsURGT1基因的組織轉錄表達譜分析。將三葉期水稻幼苗在20% PEG4000(干旱)、100 mmol/L H2O2(氧化)、42 ℃(高溫)、4 ℃(低溫)、0.15 mol/L NaCl(鹽)、0.3 mmol/L CdCl2(鎘)等逆境條件下處理，處理不同時間段后，取地上部分組織樣品，提取RNA并進行反轉錄，之后進行qRT-PCR反應，檢測OsURGT1基因對于各非生物脅迫處理的響應轉錄表達譜。將三葉期水稻幼苗分別用ABA(脫落酸)、GA(赤霉素)、SA(水楊酸)、MeJA(茉莉酸甲酯)等激素進行處理(所有激素的終濃度為0.1 mmol/L)，處理不同時間段后，取地上部分組織樣品，抽提RNA并進行反轉錄，之后進行qRT-PCR反應，檢測OsURGT1基因對于激素誘導處理的響應表達譜。用于qRT-PCR反應的引物序列見表1。以水稻泛素基因Ubiquitin(LOC_Os03g13170)為內參基因。

表1 水稻OsURGT1基因表達量分析相關引物Tab.1 Primers for gene expression analysis of OsURGT1 in rice

2 結果與分析

2.1 OsURGT1基因的獲得

通過序列同源比對，最終從水稻基因組數據庫(http：//rice.plantbiology.msu.edu/)中找到OsURGT1基因，全長為3 421 bp，外顯子和內含子分析結果見圖1，共有5個外顯子?；蛉LCDS為996 bp，編碼331個氨基酸長度的蛋白質(圖2)。該基因長度符合NST蛋白的特征，具有300～400個氨基酸殘基。

圖1 水稻OsURGT1基因的結構Fig.1 Gene structure of OsURGT1 in Oryza sativa

2.2 生物信息學分析

2.2.1OsURGT1基因編碼蛋白的氨基酸組成分析OsURGT1基因編碼蛋白OsURGT1的相對分子質量為36 397.18 ku，其分子式為C1685H2654N420O441S17，等電點為9.57，其中帶負電荷的氨基酸殘基個數有13個(Asp、Glu)，帶正電荷的氨基酸殘基個數有25個(Arg、Lys)，親水性的總平均值為0.618。如圖3結果所示，OsURGT1蛋白氨基酸組成中，亮氨酸(Leu)的含量最高，其次是纈氨酸(Val)，含量最低的是色氨酸(Trp)、半胱氨酸(Cys)和天冬氨酸(Asp)，氨基酸含量在5%以上的有9種氨基酸。

2.2.2 OsURGT1蛋白的親/疏水性分析 利用ProtScale工具對OsURGT1蛋白進行親/疏水性分析。如圖4所示，OsURGT1蛋白的氨基酸分布于0以上的閾值大于分布于0以下的閾值，推測OsURGT1蛋白為疏水性蛋白，疏水性最大值為3.367，位于第139個氨基酸，最小值為-2.500，位于第306個氨基酸。

圖2 水稻OsURGT1基因的全長CDS及對應的氨基酸序列Fig.2 Full-length CDS and deduced amino acid sequence of OsURGT1 gene in Oryza sativa

Val.纈氨酸；Tyr.酪氨酸；Trp.色氨酸；Thr.蘇氨酸；Ser.絲氨酸；Pro.脯氨酸；Phe.苯丙氨酸；Met.甲硫氨酸；Lys.賴氨酸；Leu.亮氨酸；Ile.異亮氨酸；His.組氨酸；Gly.甘氨酸；Glu.谷氨酸；Cys.半胱氨酸；Gln.谷氨酰胺；Asp.天冬氨酸；Asn. 天冬酰胺；Arg.精氨酸；Ala.丙氨酸。

圖4 OsURGT1蛋白的親/疏水性分析Fig.4 Hydrophilici/hydrophobic analysis of OsURGT1 protein

2.2.3 OsURGT1蛋白的跨膜結構域分析 如圖5所示，OsURGT1蛋白有9個跨膜結構域，推測其是一個膜蛋白。

2.2.4 OsURGT1蛋白的高級結構分析 如圖6-A、B所示，OsURGT1蛋白預測的二級結構中α螺旋有59個，占比17.82%；延伸鏈有119個，占比35.95%；無規(guī)則卷曲有153個，占比46.22%。對OsURGT1蛋白進行三級結構建模預測(圖6-C)，結果顯示，依據一個與其匹配度最高的模板蛋白，以100%的置信度對OsURGT1蛋白的291個氨基酸(覆蓋率達88%)進行了建模，模板蛋白是一個膜蛋白，并且是一個GDP-甘露糖轉運蛋白，即NST蛋白。這表明OsURGT1蛋白不但在一級結構上符合NST的特征，在高級結構上亦具有NST的特征。

圖5 OsURGT1蛋白的跨膜結構域分析Fig.5 Transmembrane domain analysis of OsURGT1 protein

2.2.5 OsURGT1蛋白的進化樹分析 在NCBI數據庫中，通過蛋白序列比對，選取16個物種中與水稻OsURGT1同源性較高的蛋白，即山茶CsURGT(Camelliasinensis，XP_028106522)、油棕EgURGT(Elaeisguineensis， XP_010906037)、短花藥野生稻ObURGT(Oryzabrachyantha， XP_006647512)、哈氏黍PhURGT(Panicumhallii， XP_025814183)、豬粟PmURGT(Panicummiliaceum，RLM80742)、毛果楊PtURGT(Populustrichocarpa，XP_002307514)、高粱SbURGT(Sorghumbicolor，XP_021310114)、小米SiURGT(Setariaitalica， XP_004953102)、玉米ZmURGT(Zeamays， PWZ39018)、二穗短柄草BdURGT(Brachypodiumdistachyon， XP_003575354)、鐵皮石斛DcURGT(Dendrobiumcatenatum，XP_020688249)、陸地棉GhURGT(Gossypiumhirsutum，XP_016732973)、三裂葉薯ItURGT(Ipomoeatriloba，XP_031117650.)、核桃JeURGT(Juglansregia， XP_018846584)、荷花NnURGT(Nelumbonucifera，XP_010242229)、可可TcURGT(Theobromacacao， XP_007048167)。運用Mega 6.06軟件對這17個同源性較高的蛋白進行進化樹分析，由圖7結果可知，進化樹總共分成了兩大分支，在第一分支上OsURGT1蛋白與短花藥野生稻中的ObURGT親緣關系最近，而與第二分支上的物種蛋白(可可、山茶、三裂葉薯、荷花、陸地棉、核桃、毛果楊)親緣關系較遠。

A.OsURGT1蛋白的二級結構，不同的字母代表不同的二級結構(h.α螺旋；e.延伸鏈；c.無規(guī)則卷曲)；B.OsURGT1蛋白的二級結構的評分結構(藍色.α 螺旋；紫色.無規(guī)則卷曲；紅色.延伸鏈)；C.OsURGT1蛋白的三級結構預測。

圖7 OsURGT1相關蛋白的進化樹分析Fig.7 Phylogenetic tree analysis for OsURGT1 related proteins

2.2.6OsURGT1基因啟動子的順式作用元件分析 截取OsURGT1基因起始密碼子ATG前2 000 bp的序列作為基因啟動子序列，運用在線工具Plant CARE對OsURGT1基因啟動子序列進行順式作用元件分析(表2)。除部分未知功能順式元件外，預測發(fā)現啟動子區(qū)域含有參與激素調控的順式作用元件，如ABA(脫落酸)、MeJA(茉莉酸鉀酯)、GA(赤霉素)，還有參與光響應調控和脅迫誘導調控的順式作用元件，從而推測OsURGT1基因可能參與部分激素調控與逆境脅迫響應。

2.3 水稻OsURGT1基因的表達譜分析

2.3.1 組織表達譜 取三葉期水稻幼苗的根和葉，孕穗期水稻的根、莖、葉、穗、葉鞘分別進行OsURGT1基因的轉錄表達譜分析。從圖8可以看出，在三葉期時，OsURGT1基因在葉中的表達量顯著高于根中表達量。孕穗期時，在葉中的表達量最高，其次是葉鞘，表達量最低的是根。從以上結果可知，OsURGT1基因在植株的整個生長發(fā)育期都有表達，說明該基因參與水稻植株的生長發(fā)育過程。

表2 OsURGT1基因的啟動子順勢作用元件Tab.2 Cis-acting elements prediction for the promoter sequence of OsURGT1 gene

YR.三葉期的根；YL.三葉期的葉；R.孕穗期的根；S.孕穗期的莖；L.孕穗期的葉；LS.孕穗期的葉鞘；SP.穗。柱形圖上方的不同小寫字母表示OsURGT1基因在不同組織中表達量的顯著性差異(P<0.05)。圖9-10同。

2.3.2 激素誘導表達譜 為了解水稻OsURGT1基因是否參與激素調控途徑，將三葉期水稻幼苗用6種激素處理，分別是ABA(脫落酸)、GA(赤霉素)、SA(水楊酸)、Eth(乙烯)、2，4-D(植物生長調節(jié)劑)、MeJA(茉莉酸鉀酯)，在處理不同時間段后(0，1，3，6，12，24 h)分別取地上部分組織樣品，抽提RNA，反轉錄后進行OsURGT1基因表達量檢測。從圖9可知，在2，4-D處理后，OsURGT1基因表達量在處理1 h后急劇上升，之后一直保持在一個相對較高的水平；在ABA處理后，OsURGT1基因的表達量總體呈現一個波動上升的過程，在0～3 h逐漸上升，6 h下降，之后逐漸緩慢上升，在處理24 h達到最大值；在Eth處理后，OsURGT1基因的表達量在處理1 h急劇上升，3 h下降之后呈逐漸上升趨勢，在處理24 h表達量達最大值；在SA和GA處理后，OsURGT1基因表達量總體呈上升趨勢，但前期上升相對緩慢，在處理12～24 h過程中上升幅度較大；而在MeJA處理后，OsURGT1基因的表達量在處理1 h降低，但在3 h顯著升高后快速降低至0 h水平，之后又持續(xù)升高。經過表達量的差異顯著性分析結果可看出，經2，4-D、ABA、Eth激素處理后OsURGT1基因在處理1～24 h的表達量與在處理0 h的表達量差異顯著；經GA和SA處理后OsURGT1基因在處理3～24 h的表達量與在處理0～1 h的表達量差異顯著；經MeJA處理后OsURGT1基因在處理1，3，12，24 h的表達量與在處理0，6 h的表達量差異顯著。根據以上結果推測，OsURGT1基因可能直接或間接參與了ABA、GA、SA、Eth、2，4-D、MeJA這幾種激素的相關調控過程。

圖9 水稻OsURGT1基因的激素處理誘導表達譜分析Fig.9 The induced expression profile analysis of gene OsURGT1 after treated by hormones

2.3.3 非生物脅迫處理誘導表達譜 為了解水稻OsURGT1基因是否參與多種非生物脅迫的功能調控，將三葉期水稻幼苗分別用6種非生物脅迫處理，分別是PEG4000(干旱)、H2O2(氧化)、42 ℃(高溫)、4 ℃(低溫)、NaCl(鹽)、CdCl2(鎘)，在處理不同時間段后(0，1，3，6，12，24 h)分別取地上部分組織樣品，抽提RNA，反轉錄后進行OsURGT1基因的表達量檢測。從圖10可知，OsURGT1基因在42 ℃高溫條件處理下，表達量在處理1 h急劇上升，又在處理3 h急劇降低至比處理0 h還低的水平，之后再緩慢上升至第2高的表達水平；在CdCl2條件處理下，OsURGT1基因的表達量在處理1 h顯著升高，3 h急劇降低后又緩慢上升至0 h水平，24 h時又顯著降低；在4 ℃低溫條件處理下，OsURGT1基因的表達量先緩慢上升，在處理6 h急劇上升至相對最大值，之后有一定程度的降低，在處理1～24 h的表達量均比0 h的表達量高；在PEG4000干旱條件處理下，OsURGT1基因的表達量在1 h上升，之后呈現一個波動下降的趨勢，且在處理3～24 h表達量均顯著低于0 h；在NaCl鹽條件處理下，OsURGT1基因的表達量在處理1 h達到最大值，之后急劇下降，在處理6 h達到最小值，之后有一定程度的上升； 在H2O2條件處理下，OsURGT1基因的表達量總體呈現一個波動下降的趨勢，在1 h降低，3 h升高，6 h降低，12 h有所升高，之后又降低。通過表達量的差異顯著性分析結果可看出，經高溫、鎘、低溫、干旱、鹽處理后，OsURGT1基因的表達量在處理0～24 h的整個過程中的變化差異較顯著；經氧化處理后，OsURGT1基因的表達量在處理0，3 h、1，12 h、6，24 h 3組的組內兩兩之間無顯著性差異，3組的相互之間存在顯著性差異，但是從處理的整個過程看表達量變化幅度不大。根據以上結果可知，OsURGT1基因對干旱、氧化、高溫、低溫、鹽、重金屬鎘這些逆境脅迫都有不同程度的響應，說明OsURGT1基因極有可能在水稻中參與了這些逆境脅迫的功能調控過程。

圖10 非生物脅迫處理后OsURGT1基因的誘導表達譜分析Fig.10 The inducted expression profile analysis of gene OsURGT1 after treated by abiotic stresses

3 討論

植物生長發(fā)育需要各種糖基化合物，包括各類多糖、糖蛋白、蛋白多糖、糖脂和其他一些次生代謝產物等。核苷酸單糖則是形成這些糖基化合物的基礎小分子化合物[24]。大多數核苷酸單糖在細胞質溶膠中產生后，由高爾基體膜或內質網膜上的NSTs蛋白將這些核苷酸單糖反向轉運至高爾基體或者內質網中，再經高爾基體或內質網膜上的糖基轉移酶(GTs)將各種各樣的UDP-或GDP-糖殘基用于各種多糖分子的生物合成[25-26]，因此，NSTs蛋白大多都定位于高爾基體[15-17]，部分定位于內質網[20]，或者同時定位于高爾基體和內質網[14，19]。除此之外，NSTs蛋白還具有一些相似的特點，如一般由300～400個氨基酸組成，擁有6～10個跨膜結構域，催化位點面向細胞器的內腔，一般為疏水性蛋白等[27-29]。本研究利用擬南芥AtURGT基因序列進行同源比對，獲得了水稻OsURGT1基因，其全長為3 421 bp，CDS全長為996 bp，含有5個外顯子，編碼331個氨基酸長度的蛋白質；預測結果表明，OsURGT1蛋白含有9個跨膜結構域，是一個膜蛋白；蛋白親/疏水性預測結果顯示，OsURGT1蛋白為疏水性蛋白；蛋白的三級結構建模結果顯示，OsURGT1蛋白與一個NST蛋白模板高度相似，88%的氨基酸殘基建模置信度達到100%。以上結果皆表明，OsURGT1基因編碼蛋白的序列及結構特點符合NST家族蛋白的特點，OsURGT1蛋白極有可能在水稻中發(fā)揮NST蛋白功能，至于其具體轉運哪種類型的核苷酸單糖，有待進一步試驗證實。

組織轉錄表達譜檢測結果顯示，OsURGT1基因在水稻苗期及孕穗期的各個組織中都有表達，在葉和莖中的表達量相對較高，在根和穗中表達量相對較低，尤其是在根中的表達量相對最低，說明OsURGT1基因在水稻的整個生長發(fā)育過程中應該發(fā)揮一定的作用，且在葉的生長發(fā)育過程中可能發(fā)揮相對更重要的作用。

通過對OsURGT1基因的啟動子序列進行順式作用元件分析，發(fā)現OsURGT1基因的啟動子區(qū)域含有參與激素調控(ABA-脫落酸、MeJA-茉莉酸鉀酯、GA-赤霉素)、光響應和脅迫誘導調控(低溫誘導和厭氧)的順式作用元件；不同激素及非生物脅迫處理響應表達水平檢測結果表明，OsURGT1基因對于各種激素(ABA-脫落酸、GA-赤霉素、SA-水楊酸、Eth-乙烯、2，4-D-植物生長調節(jié)劑、MeJA-茉莉酸鉀酯)處理皆有較強的轉錄表達水平的變化；對于非生物脅迫處理中的高低溫、PEG4000、CdCl2、NaCl也有一定程度的響應表達。綜上，OsURGT1基因極有可能參與水稻以上相關調控途徑，但其具體的調控功能及機理有待進一步深入探索。