千里香中黃酮類(lèi)成分的分離鑒定及抗氧化活性研究

向方桃，陳封政，陳建明，田 沖，楊孝蓉，李書(shū)華*

1樂(lè)山師范學(xué)院附屬醫(yī)院；2樂(lè)山師范學(xué)院 樂(lè)山特色農(nóng)產(chǎn)品藥用成分研發(fā)工程中心，樂(lè)山 614000；3固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，宜賓 644000；4成都格純生物醫(yī)藥有限公司，成都 610000

千里香(Murrayapanaculata(L.) Jack)為蕓香科九里香屬植物，主要分布于我國(guó)南方等地。九里香屬在我國(guó)有6種及2個(gè)變種[1]，1978年植物分類(lèi)學(xué)家黃成就將M.panaculata(L.) Jack的中文名稱(chēng)由九里香更名為千里香[2]。2015版《中國(guó)藥典》收載的九里香為千里香(M.panaculata(L.) Jack)和九里香(M.exoticaL.)的干燥葉和帶葉嫩枝，其主要功能為行氣止痛，活血化瘀[3]。藥典里對(duì)九里香僅有性狀鑒別、顯微鑒別以及水分和總灰分檢查，缺少成分鑒別和有效成分的含量測(cè)定。國(guó)內(nèi)外對(duì)九里香的研究報(bào)道較多，但仔細(xì)分析發(fā)現(xiàn)這些文獻(xiàn)研究的品種多為九里香(M.exoticaL.)，主要側(cè)重于九里香的提取物的生理活性研究：抑菌、抗炎、殺蟲(chóng)、抗生育、消炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用[4-6]以及成分分析、分離與鑒定[7,8]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)千里香的研究主要集中揮發(fā)性成分分布[9]，精油的抑菌活性及成分分析[10]，氯仿萃取物提取物對(duì)家蠅成蟲(chóng)、蘿卜蚜、椰心菜甲和斜紋夜蛾有殺滅作用和對(duì)香蕉、芒果的炭疽病的抑制作用[11]，醇提取物對(duì)稻瘟病病原菌的抑制作用[12]以及千里香的多甲氧基基黃酮成分分離與鑒定[13,14]等方面。

國(guó)內(nèi)外對(duì)黃酮的抗氧化活性研究較多，黃酮抗氧化活性的機(jī)理是其酚羥基可能被氧化成羰基等因素，多甲氧基基黃酮由于酚羥基較少，其抗氧化活性比對(duì)應(yīng)的黃酮弱[15]。

為了進(jìn)一步闡明千里香的活性成分，我們對(duì)千里香枝葉的化學(xué)成分進(jìn)行了分離鑒定，并對(duì)所得到的單體化合物進(jìn)行了抗氧化活性研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀YRE-501(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，電子天平FA1004(鶴壁市力科電子有限公司)，7200型可見(jiàn)分光光度計(jì)(尤尼柯儀器有限公司)，制備液相色譜SACID100 mm(成都格萊精密儀器有限公司)；Varian INOVA 400核磁共振譜儀。

薄層色譜硅膠GF254和柱色譜硅膠(300～400目，青島海洋化工有限公司產(chǎn)品)；維生素C(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)(百靈威科技有限公司)。

千里香，2018年7月購(gòu)自安國(guó)冷背藥材有限公司，經(jīng)樂(lè)山師范學(xué)院成英副教授鑒定為蕓香科九里香屬植物千里香(M.panaculata(L.) Jack)的干燥葉及嫩枝，標(biāo)本保存于樂(lè)山師范學(xué)院樂(lè)山特色農(nóng)產(chǎn)品藥用成分研發(fā)工程中心(20180701)。

1.2 方法

1.2.1 提取與分離

稱(chēng)取10 kg千里香干燥葉及嫩枝，粉碎，平均分裝于2個(gè)50 L的塑料桶中，分別向每個(gè)桶中加入25 L乙酸乙酯，室溫浸泡5天后過(guò)濾，得到第一次浸提液。然后再次分別向每個(gè)桶中加入20 L乙酸乙酯，室溫浸泡5天，過(guò)濾，得到第二次浸提液。合并兩次浸提液，在50 ℃條件下減壓濃縮，得到流浸膏408 g。將流浸膏用乙酸乙酯溶解，上清液滴加于300 g 300～400目硅膠上，水浴揮干溶劑，得到吸附了樣品的硅膠。將2 500 g 300～400目硅膠濕法裝入玻璃層析柱中，然后將吸附了樣品的硅膠置于柱上端，以不同比例的石油醚：丙酮混合液(8∶1→1∶1)為洗脫液，得到6個(gè)部分。將每個(gè)部分通過(guò)制備液相分離，結(jié)合多次硅膠柱層析分離和重結(jié)晶純化，得到6個(gè)化合物：1(50 mg)、2(15 2mg)、3(95 mg)、4(30 mg)、5(110 mg)和6(36 mg)。

1.2.2 化合物抗氧化活性的測(cè)定

根據(jù)Hu等[15]的研究方法，以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照，采用DPPH自由基清除率檢測(cè)法，研究化合物的抗氧化活性。

抗氧化反應(yīng)體系：用移液器分別準(zhǔn)確取100 μL不同濃度的化合物或Vc溶液，3.90 mL 75 μmol/L的DPPH溶液，搖勻后放置于暗處30 min后，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A0，同時(shí)測(cè)定100 μL化合物溶液+3.90 mL甲醇的吸光度A1以及3.90 mL 75 μmol/L的DPPH溶液+100 μL甲醇的吸光度A2。所有樣品均做三個(gè)重復(fù)，取平均值。按照下面公式計(jì)算化合物對(duì)DPPH自由基的清除率。

DPPH自由基的清除率=[1-(A0-A1)/A2]×100%

式中：A0=100 μL化合物溶液+3.90 mL DPPH溶液；A1=100 μL化合物溶液+3.90 mL甲醇的吸光度；A2=3.90 mL DPPH溶液+100 μL甲醇的吸光度。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1淡黃色粉末;10%硫酸-乙醇噴霧加熱后顯黃色。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.56(1H，d，J= 8.0 Hz，H-6′)，7.39(1H，s，H-2′)，6.96(1H，d，J= 8 Hz，H-5′)，6.59(1H，s，H-3)，6.41(1H，s，H-6)，3.98(3H，s，4′-OCH3)，3.95(6H，s，3′-OCH3，8-OCH3)，3.93(6H，s，5-OCH3，7-OCH3)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：178.2(C-4)，160.8(C-2)，156.6(C-7)，156.3(C-9)，151.9(C-5)，151.8(C-4′)，149.2(C-3′)，130.5(C-8)，123.9(C-1′)，119.7(C-6′)，112.2(C-5′)，108.7(C-10)，108.5(C-2′)，106.9(C-3)，92.4(C-6)，61.5(8-OCH3)，56.4(5-OCH3)，56.3(7-OCH3)，56.1(3′-OCH3)，56.0(4′-OCH3)。上述核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道的5，7，8，3′，4′-五甲氧基黃酮基本一致。

化合物2淡黃色粉末;10%硫酸-乙醇噴霧加熱后顯黃色。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.17(2H，s，H-2′，6′)，6.64(1H，s，H-3)，6.44(1H，s，H-6)，4.01(3H，s，4′-OCH3)，3.99(3H，s，8-OCH3)，3.95(9H，s，3′-OCH3，5′-OCH3，5-OCH3)，3.92(3H，s，7-OCH3)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：177.9(C-4)，160.3(C-2)，156.7(C-7)，156.4(C-9)，153.5(C-3′)，153.5(C-5′)，151.9(C-5)，140.8(C-4′)，130.6(C-8)，126.7(C-1′)，108.8(C-10)，107.9(C-3)，103.2(C-2′)，103.2(C-6′)，92.5(C-6)，61.4(8-OCH3)，61.0(4′-OCH3)，56.6(5-OCH3)，56.3(7-OCH3)，56.2(3′-OCH3)，56.2(5′-OCH3)。上述核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道的5，7，8，3′，4′，5′-六甲氧基黃酮基本一致。

化合物3淡黃色粉末;10%硫酸-乙醇噴霧加熱后顯黃色。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.08(2H，s，H-2′，6′)，6.64(1H，s，H-3)，6.58(1H，s，H-8)，6.44(1H，s，H-6)，3.97(3H，s，5-OCH3)，3.95(6H，s，3′-OCH3，5′-OCH3)，3.94(3H，s，7-OCH3)，3.92(3H，s，4′-OCH3)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：177.6(C-4)，164.1(C-7)，160.9(C-5)，160.5(C-2)，159.9(C-9)，153.5(C-3′)，153.5(C-5′)，140.8(C-4′)，126.8(C-1′)，109.2(C-10)，108.9(C-3)，103.4(C-2′)，103.4(C-6′)，96.2(C-6)，92.9(C-8)，61.1(4′-OCH3)，56.5(5-OCH3)，56.4(3′-OCH3)，56.4(5′-OCH3)，55.8(7-OCH3)。上述核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道的5，7，3′，4′，5′-五甲氧基黃酮基本一致。

化合物4淡黃色粉末;10%硫酸-乙醇噴霧加熱后顯黃色。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.08(2H，s，H-2′，6′)，6.81(1H，s，H-8)，6.70(1H，s，H-3)，4.00(3H，s，5-OCH3)，3.99(3H，s，7-OCH3)，3.94(6H，s，3′-OCH3，5′-OCH3)，3.92(6H，s，4′-OCH3，6-OCH3)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：177.6(C-4)，161.4(C-2)，158.0(C-7)，154.6(C-9)，153.6(C-3′)，153.6(C-5′)，152.5(C-5)，141.0(C-4′)，140.5(C-6)，126.7(C-1′)，112.7(C-10)，107.9(C-3)，103.5(C-2′)，103.5(C-6′)，96.3(C-8)，62.2(5-OCH3)，61.6(6-OCH3)，61.1(4′-OCH3)，56.4(3′-OCH3)，56.4(5′-OCH3)，56.4(7-OCH3)。上述核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的5，7，3′，4′，5′-六甲氧基黃酮基本一致。

化合物5淡黃色粉末;10%硫酸-乙醇噴霧加熱后顯黃色。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.54(1H，d，J= 8 Hz，H-6′)，7.35(1H，s，H-2′)，6.99(1H，d，J= 8 Hz，H-5′)，6.70(1H，s，H-8)，6.57(1H，s，H-3)，3.99(6H，s，3′-OCH3，4′-OCH3)，3.98(3H，s，7-OCH3)，3.92(3H，s，6-OCH3)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：182.7(C-4)，164.3(C-2)，158.9(C-7)，153.3(C-9)，152.9(C-4′)，152.4(C-5)，149.4(C-3′)，132.7(C-6)，123.6(C-1′)，120.2(C-6′)，111.2(C-5′)，108.8(C-2′)，106.0(C-10)，104.2(C-3)，90.7(C-8)，60.9(4′-OCH3)，56.4(6-OCH3)，56.1(3′-OCH3)，56.1(7-OCH3)。上述核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道的5-羥基-6，7，3′，4′-四甲氧基黃酮基本一致。

化合物6淡黃色粉末;10%硫酸-乙醇噴霧加熱后顯黃色。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.61(1H，d，J= 8 Hz，H-6′)，7.44(1H，s，H-2′)，7.01(1H，d，J= 8 Hz，H-5′)，6.74(1H，s，H-3)，4.13(3H，s，7-OCH3)，3.99(9H，s，3′-OCH3，4′-OCH3，8-OCH3)，3.96(3H，s，6-OCH3)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：183.1(C-4)，164.4(C-2)，153.2(C-4′)，152.6(C-7)，149.9(C-9)，149.9(C-3′)，145.9(C-5)，136.7(C-6)，132.9(C-8)，123.5(C-6′)，120.3(C-1′)，111.3(C-5′)，108.8(C-2′)，106.8(C-10)，103.7(C-3)，62.1(6-OCH3)，61.8(7-OCH3)，61.2(6-OCH3)，56.2(3′-OCH3)，56.0(4′-OCH3)。上述核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道的化合物5-羥基-6，7，8，3′，4′-五甲氧基黃酮基本一致。

2.2 化合物抗氧化活性的測(cè)定結(jié)果與分析

對(duì)從千里香中分得的6個(gè)化合物及千里香的乙酸乙酯提取物進(jìn)行了抗氧化試驗(yàn)，結(jié)果顯示千里香的乙酸乙酯提取物濃度為250 μg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除率為15.26%，維生素C濃度為40 μM時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除率為48.06%，6個(gè)化合物表現(xiàn)出不同程度的抗氧化作用(各化合物對(duì)DPPH自由基的清除率見(jiàn)圖1)，化合物1～4的抗氧化作用很弱，化合物5和6的有一定的抗氧化作用，但明顯弱于維生素C。通過(guò)結(jié)構(gòu)分析，化合物5和化合物6均含有5位酚羥基，5位羥基與4位的羰基協(xié)同作用，形成一個(gè)六元環(huán)系來(lái)穩(wěn)定和清除自由基[25]，故表現(xiàn)出一定的抗氧化活性；而化合物1～4則不含有酚羥基，缺少這種體系，故其抗氧化能力很弱?；衔?和3的抗氧化活性幾乎沒(méi)有差別，化合物2和4的抗氧化活性也很一致，但化合物2和4的抗氧化能力略強(qiáng)于化合物1和3。從上述結(jié)果可以看出，結(jié)構(gòu)類(lèi)似的多甲氧基黃酮在均無(wú)酚羥基存在的情況下，含甲氧基多的化合物抗氧化活性略強(qiáng)于含甲氧基少的化合物。

圖1 化合物對(duì)DPPH的清除曲線Fig.1 DPPH free radical scavenging abilities of compounds

3 結(jié)論

本文對(duì)千里香的乙酸乙酯提取物進(jìn)行了分離純化，得到了6個(gè)多甲氧基黃酮，其中化合物1是首次從九里香屬植物里分離得到，也是首次從千里香植物里分離得到，豐富了千里香化合物的結(jié)構(gòu)類(lèi)型?；衔?和5填補(bǔ)了chembook資源平臺(tái)對(duì)照品的空白。對(duì)分離得到的6個(gè)多甲氧基黃酮進(jìn)行了清除DPPH自由基試驗(yàn)，結(jié)果顯示6個(gè)化合物均具有一定的抗氧化活性，其中含有5位酚羥基的多甲氧基黃酮的抗氧化活性明顯強(qiáng)于不含酚羥基的多甲氧基黃酮，對(duì)于結(jié)構(gòu)類(lèi)似均無(wú)酚羥基的多甲氧基黃酮，則含甲氧基多的化合物抗氧化活性略強(qiáng)于含甲氧基少的化合物。

通過(guò)本文的研究結(jié)合文獻(xiàn)[13,14]，可以看出千里香(M.panaculata(L.) Jack)一般不含有香豆素類(lèi)化合物，而九里香(M.exoticaL.)[19,20]則富含香豆素類(lèi)化合物，這從植物化學(xué)分類(lèi)學(xué)上佐證了千里香和九里香的區(qū)別，以此推測(cè)《中國(guó)藥典》將千里香和九里香不加區(qū)別使用值得商榷。

致謝：感謝成都格純生物醫(yī)藥有限公司在分離工作中提供的部分設(shè)備和幫助。