冰菜的化學(xué)成分研究

舒 悅，李婷婷，曾艷波*

1海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，?？?570311；2中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所海南省海洋生物資源功能性成分研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?571101

冰菜(MesembryanthemumcrystallinumL.)又名冰葉日中花，為番杏科日中花屬一年生草本植物，在葉面和莖上著生有大量的大型泡狀細(xì)胞，里面充滿液體，在太陽(yáng)照射下反射光線，就像冰晶一樣，因此而得名[1]。冰菜原產(chǎn)于南非納米比沙漠等干旱地區(qū)，現(xiàn)分布較廣，加勒比海周邊、環(huán)地中海沿岸和澳大利亞西部等國(guó)家和地區(qū)都有分布[2]。冰菜是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的保健蔬菜，冰菜的酸味來(lái)源于天然的蘋果酸，冰菜中不但含有豐富的氨基酸等，而且還含有豐富的鈉、鉀等礦物質(zhì)，并含有肌醇、松醇等對(duì)人體有益的物質(zhì)。肌醇可以促進(jìn)脂肪代謝、預(yù)防脂肪肝和動(dòng)脈硬化，也可以降低體內(nèi)的膽固醇、防止脫發(fā)、改善濕疹，還可以預(yù)防因?yàn)檠逅禺惓Ｒ鸬膽n郁癥、恐慌癥和強(qiáng)迫癥。而松醇則具有降低血糖的效果[3]。另外，冰菜中含有2，6-二叔丁基對(duì)甲酚是一種很強(qiáng)的抗氧化劑[4,5]。此外，前期對(duì)冰菜的研究主要集中在冰菜提取物的生物活性方面。Bouftira等[6]的研究表明，冰菜水提物具有抗氧化和抗菌活性。Seungmi等[7]的研究顯示，冰菜提取物具有α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗氧化活性，可作為一種天然的抗糖尿病和抗氧化的功能性食品。本研究組對(duì)冰菜乙醇提取物和乙醇提取物各萃取部分進(jìn)行了乙酰膽堿酯酶抑制活性的研究。結(jié)果表明，冰菜乙醇提取物及其各溶劑萃取部分中，除水部分無(wú)活性外，其余各部分均有乙酰膽堿酯酶抑制活性[8]。為了一步了厘清冰菜提取物中的化學(xué)成分，尋找新的生物活性成分，本研究對(duì)冰菜的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，并對(duì)化合物進(jìn)行了細(xì)胞毒活性測(cè)試。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物樣品

本研究所用冰菜于2018年5月采于海南省文昌市，由本所段瑞軍博士鑒定為日中花屬植物MesembryanthemumcrystallinumL.。憑證標(biāo)本(MC20180513)存于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所B502實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 儀器和試劑

Brucker AV-500型超導(dǎo)核磁共振儀(Bruker公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化器械株式會(huì)社)；萬(wàn)分之一分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；Autospec-3000質(zhì)譜儀(Bruker)；Laborta 4001 (2L)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph Elektro GmbH ( Co.)；電子計(jì)重秤(啟東友銘衡器有限公司)；安捷倫1260分析型高效液相色譜儀(Agilent Technologies Inc.)。Sephadex LH-20和RP-18(德國(guó)Merck公司)；GF254高效薄層板(青島海洋化工廠)；柱層析用硅膠(200～300目和60～80目)(青島海洋化工廠)；常用有機(jī)溶劑為重蒸工業(yè)試劑；色譜甲醇(天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 提取與分離

將新鮮冰菜(50.0 kg)切成2厘米左右的小段，用95%乙醇室溫浸提三次，提取液經(jīng)減壓濃縮得到乙醇提取物(200.0 g)。將其分散在水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取各三次，分別經(jīng)減壓濃縮得到石油醚部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分，其質(zhì)量分別為96.6 g、18.0 g和75.0 g。

石油醚部分(96.6 g)經(jīng)MCI柱色譜，以甲醇-水(10%→100%)梯度洗脫，得到五個(gè)流分(Fr.1～5)。Fr.2(80.0 g)經(jīng)減壓硅膠柱層析以氯仿-甲醇(1∶0→0∶1)梯度洗脫，分段收集得到17個(gè)流分(Fr.2.1～ Fr.2.17)。Fr.2.8(4.0 g)經(jīng)葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20)柱色譜(甲醇)得5個(gè)流分(Fr.2.8.1～ Fr.2.8.5)，F(xiàn)r.2.8.4(1.1 g)經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜得化合物1(1.0 mg)。

乙酸乙酯部分(18.0 g)經(jīng)過(guò)減壓硅膠柱層析，以氯仿-甲醇(1∶0→0∶1)梯度洗脫，得到12個(gè)流分(Fr.1～12)。Fr.1(0.7 g)經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜(甲醇)洗脫后，又反復(fù)硅膠柱色譜得化合物4(1.0 mg)。Fr.4(0.8 g)經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜和葡聚糖凝膠柱色譜得到化合物3(3.0 mg)。Fr.7(2.1 g)用甲醇:水(30%→100%)ODS反相色譜柱洗脫后經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇)洗脫，最后通過(guò)硅膠柱色譜和半制備型高效液相色譜得到單體化合物2(1.5 mg)。Fr.9(2.8 g)經(jīng)甲醇Sephadex LH-20柱色譜分離后，又用甲醇:水(10%→100%)C18反相色譜柱梯度洗脫，最后經(jīng)硅膠柱色譜分離得到化合物5(3.1 mg)。

正丁醇部分(75.0 g)經(jīng)PR-18柱色譜以甲醇:水(0∶1→1∶0)梯度洗脫得到7個(gè)流分(Fr.1～7)。Fr.2(5.0 g)經(jīng)減壓硅膠(H)柱色譜以氯仿:甲醇梯度洗脫得到5個(gè)流分(Fr.2.1～ Fr.2.5)。Fr.2.2(1.3 g)用純甲醇Sephadex LH-20凝膠柱色譜洗脫，然后經(jīng)一系列硅膠柱色譜繼續(xù)分離得到單體化合物6(325.5 mg)，F(xiàn)r.2.3(0.6 g)經(jīng)硅膠柱色譜和半制備型高效液相色譜分別分離得到單體化合物7(1.0 mg)和8(3.5 mg)。Fr.2.4(0.4 g)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇洗脫)分離，然后用硅膠柱色譜繼續(xù)純化，最后用半制備型高效液相柱色譜分離得到單體化合物9(7.6 mg)。

1.2.2 細(xì)胞毒活性篩選

腫瘤細(xì)胞毒活性篩選采用MTT法，具體方法參照文獻(xiàn)[9,10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色固體；ESI-MS：m/z279[M+H]+；分子式為C16H22O4；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.72(2H，dd，J= 5.7，3.3 Hz)，7.62(2H，dd，J= 5.7，3.3 Hz)，4.29(4H，t，J= 6.6 Hz)，1.72(4H，m)，1.46(4H，m)，0.98(6H，t，J= 7.4 Hz)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：167.6，132.4，130.6，128.3，65.8，30.5，19.8，13.7。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道一致，故鑒定化合物1為鄰苯二甲酸二丁酯。

化合物2無(wú)色膏狀物；ESI-MS：m/z227 [M+H]+；分子式為C13H22O3；(500 MHz，CD3OD)δ：6.04(1H，d，J= 16.5 Hz，H-7)，5.52(1H，ddd，J= 16.5，6.5，3.0 Hz，H-8)，4.31(1H，q，J= 6.5 Hz，H-9)，3.83(1H，d，J= 3.0 Hz，H-4)，3.78(1H，m，H-3)，1.83(3H，s，H-13)，1.81(1H，m，H-2a)，1.27(3H，d，J= 6.5 Hz，H-10)，1.46(1H，m，H-2b)，1.07(3H，s，H-12)，1.04(3H，s，H-11)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：142.4(C-6)，140.5(C-8)，128.8(C-5)，126.8(C-7)，72.6(C-4)，69.5(C-9)，68.0(C-3)，41.6(C-2)，37.7(C-1)，30.3(C-11)，27.7(C-12)，23.8(C-10)，19.9(C-13)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道一致，故鑒定化合物2為ixerol B。

化合物3白色絮狀結(jié)晶；ESI-MS：m/z247 [M+H]+；分子式為C14H18N2O2；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.97(1H，s，H-4)，7.77(1H，s，H-1)，7.06(5H，m，H-12～16)，4.00(1H，q，J= 5.2 Hz，H-3)，3.39(1H，dt，J= 3.8，1.9 Hz，H-6)，3.00(1H，m，H-10b)，2.73(1H，dd，J= 13.5，5.1 Hz，H-10a)，1.55(1H，m，H-7)，0.50(3H，d，J= 7.1 Hz，H-8)，0.11(3H，d，J= 6.8 Hz，H-9)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：167.8(C-5)，168.0(C-2)，137.0(C-11)，131.2(C-12，16)，128.0(C-13，15)，127.0(C-14)，60.1(C-6)，56.2(C-3)，38.7(C-10)，31.2(C-7)，19.0(C-8)，17.8(C-9)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致，故鑒定化合物3為環(huán)(苯丙-纈)二肽。

化合物4白色絮狀結(jié)晶；ESI-MS：m/z231 [M+H]+；分子式為C13H14N2O2；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.45(1H，d，J= 7.5 Hz，H-4)，7.35(1H，d，J= 8.0 Hz，H-7)，7.10(1H，t，J= 7.5 Hz，H-6)，7.01(1H，t，J= 7.5 Hz，H-5)，4.55(1H，q，J= 6.0 Hz，H-11)，3.21(1H，dd，J= 16.0，4.5 Hz，H-8a)，2.82(1H，m，H-8b)，1.63(3H，d，J= 7.0 Hz，H-12)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：136.5(C-7a)，126.2(C-3a)，121.5(C-6)，119.0(C-5)，118.1(C-4)，111.4(C-7)，106.8(C-3)，57.8(C-9)，49.2(C-11)，23.2(C-8)，17.0(C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致，故鑒定化合物4為(1S,3S)-1-methyl-1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid。

化合物5淡黃色晶體；ESI-MS：m/z231 [M+H]+；分子式為C13H14N2O2；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.42(1H，d，J= 8.0 Hz，H-4)，7.32(1H，d，J= 8.0 Hz，H-7)，7.08(1H，t，J= 7.5 Hz，H-6)，6.99(1H，t，J= 7.5 Hz，H-5)，4.65(1H，q，J= 6.5 Hz，H-11)，3.09(1H，dd，J= 15.5，5.0 Hz，H-8a)，2.96(1H，dd，J= 15.5，8.0 Hz,H-8b)，1.58(3H，d，J= 6.5 Hz，H-12)；13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ：136.2(C-7a)，126.2(C-3a)，121.3(C-6)，118.7(C-5)，118.0(C-4)，111.2(C-7)，105.6(C-3)，52.9(C-9)，46.5(C-11)，22.8(C-8)，18.4(C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致，故鑒定化合物5為(1R,3S)-1-methyl-1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid。

化合物6無(wú)色油狀物；ESI-MS：m/z331 [M+H]+；分子式為C16H26O7；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：4.69(1H，d，J= 10.9 Hz，H-7a)，4.32(1H，d，J= 7.8 Hz，H-1′)，4.26(1H，d，J= 10.9 Hz，H-7b)，3.91(1H，dd，J= 12.0，2.0 Hz，H-6′b)，3.70(1H，dd，J= 12.0，5.0 Hz，H-6′a)，3.28～3.37(3H，H-3′，4′，5′)，3.18(1H，dd，J= 9.2，7.8,H-2′)，2.49(2H，dd，J= 7.7，6.0 Hz，H-6)，1.86(2H，m，H-5)，1.85(3H，s，2-Me)，1.24(6H，d，J= 6.0 Hz，4-Me)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：202.1(C-1)，135.4(C-2)，160.1(C-3)，36.6(C-4)，35.2(C-5)，38.4(C-6)，26.7(4-Me)，27.0(4-Me)，11.9(2-Me)，66.6(C-7)，104.1(C-1′)，75.1(C-2′)，78.1(C-3′)，71.7(C-4′)，78.1(C-5′)，62.9(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致，故鑒定化合物6為jasmioside E。

化合物7淡黃色結(jié)晶；ESI-MS：m/z245 [M+H]+；分子式為C9H12N2O6；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.89(1H，d，J= 8.0 Hz，H-6)，5.77(1H，d，J= 5.5 Hz，H-1′)，5.65(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5)，4.02(1H，t，J= 5.0 Hz，H-5′a)，3.95(1H，t，J= 5.0 Hz，H-5′b)，3.84(1H，q，J= 3.5 Hz，H-4′)，3.62(1H，br d，J= 12.5 Hz，H-2′)，3.55(1H，br d，J= 12.5 Hz，H-3′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：163.2(C-4)，150.8(C-2)，140.8(C-6)，101.8(C-5)，87.7(C-1′)，84.9(C-4′)，73.6(C-2′)，69.9(C-3′)，60.9(C-5′)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道一致，故鑒定化合物7為尿苷。

化合物8白色固體；ESI-MS：m/z136 [M+H]+；分子式為C5H5N5；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：8.11(1H，s，H-2)，8.10(1H，s，H-8)，7.13(2H，s，H-NH2)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：155.7(C-6)，152.8(C-2)，151.9(C-4)，139.9(C-8)，117.7(C-5)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道一致，故鑒定化合物8為維生素B4。

化合物9白色晶體；ESI-MS：m/z373 [M+H]+；分子式為C17H24O9；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.76(2H，s，H-3，5)，6.59(1H，d，J= 16.0 Hz，H-7)，6.36(1H，dt，J= 16.0，5.5 Hz，H-8)，4.87(1H，s，H-1′)，4.23(2H，d，J= 5.5 Hz，H-9)，3.86(6H，s，2，6-OMe)，3.80(1H，dd，J= 11.9，1.8 Hz，H-6′a)，3.67(1H，dd，J= 12.0，5.1 Hz，H-6′b)，3.48(1H，t，J= 8.3 Hz，H-2′)，3.42(2H，m，H-3′，4′)，3.21(1H，m，H-5′)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：154.3(C-2，6)，135.8(C-7)，135.1(C-1)，131.3(C-4)，130.0(C-8)，105.4(C-3，5)，105.3(C-1′)，78.4(C-5′)，77.8(C-3′)，75.7(C-2′)，71.4(C-4′)，63.6(C-9)，62.6(C-6′)，57.0(2，6-OMe)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道一致，故鑒定化合物9為紫丁香苷。

2.2 細(xì)胞毒活性測(cè)試結(jié)果

細(xì)胞毒活性測(cè)試結(jié)果表明，以上9個(gè)化合物對(duì)宮頸癌細(xì)胞(Hela)、胃癌細(xì)胞(SGC-7901)、肺癌細(xì)胞(A549)、肝癌細(xì)胞(BEL-7402)和慢性髓原白血病細(xì)胞(K562)的增殖均無(wú)生長(zhǎng)抑制活性。

3 結(jié)論

因?yàn)榍捌趯?duì)冰菜的研究主要集中在冰菜提取物的生物活性方面，對(duì)冰菜化學(xué)成分的研究比較少，為了進(jìn)一步厘清冰菜提取物中的化學(xué)成分，本研究對(duì)冰菜的化學(xué)成分進(jìn)行了研究。從冰菜中共分離鑒定9個(gè)化合物，均為首次從冰菜中分離得到。細(xì)胞毒活性測(cè)試結(jié)果顯示，上述化合物對(duì)宮頸癌細(xì)胞(Hela)、胃癌細(xì)胞(SGC-7901)、肺癌細(xì)胞(A549)、肝癌細(xì)胞(BEL-7402)和慢性髓原白血病細(xì)胞(K562)的增殖均無(wú)生長(zhǎng)抑制活性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，其中環(huán)(苯丙-纈)二肽(3)對(duì)肝癌細(xì)胞HepG-II和前列腺癌細(xì)胞LNCaP具有一定的細(xì)胞毒活性[20]，并具有對(duì)小鼠乳腺癌tsFT210細(xì)胞的細(xì)胞周期抑制活性[21]。從白刺果汁中分離得到的(1S,3S)-1-methyl-1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid(4)和(1R,3S)-1-methyl-1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid(5)的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性均不明顯[22]。從冰菜中分離得到的jasmioside E(6)為含量最大的一個(gè)化合物，所分離到的質(zhì)量達(dá)到325.5 mg。此化合物屬于單萜葡萄糖苷類化合物，是中藥梔子的主要成分。藥理研究顯示中藥梔子具有抗氧化、抗炎、抗疲勞、抗菌、抗老年癡呆、降血糖、降血壓和神經(jīng)保護(hù)等多種生物活性[23,24]。因此推測(cè)冰菜提取物的抗菌、抗氧化、α-葡萄糖苷酶抑制活性和乙酰膽堿酯酶抑制活性有可能與這個(gè)化合物的存在有一定的關(guān)系，這個(gè)化合物的生物活性值得深入研究。