煙田附近植物白粉病菌初步調查及其相關性分析

張開虹 桑維鈞 刁朝強 石春發(fā)

摘要：煙草白粉菌是一種專性寄生菌，且田間很難發(fā)現(xiàn)其有性態(tài)，故煙草白粉菌是如何進行初侵染還不是很明確。為了解煙草周邊寄主白粉菌與煙草白粉菌的相關性，確定周邊寄主引起煙草白粉病發(fā)生的地位

，本研究在貴陽周邊的清鎮(zhèn)、開陽、修文、貴安新區(qū)等煙草基地對煙草周邊白粉菌植物進行調查采集、形態(tài)學鑒定，并建立植物白粉病菌的rDNA-ITS系統(tǒng)發(fā)育樹，確定相互間的親緣關系。此次共調查了煙田周邊白粉菌植物16個科的30種植物，其中菊科植物種類最多，為8種;其次是豆科植物4種;調查的30種植物中，三葉鬼針草（菊科）、豨薟（菊科）、酸模葉蓼（蓼科）、短序鐵莧（大戟科）、樸樹（榆科）等5種植物發(fā)現(xiàn)有性型，形態(tài)學鑒定分別為單囊殼屬Sphaerotheca、單囊殼屬Sphaerotheca、白粉菌屬 Erysiphe、白粉菌屬 Erysiphe、白粉菌屬 Erysiphe，與ITS（ITS4/5）比對的結果一致;經構建幾種白粉菌屬植物種間ITS系統(tǒng)發(fā)育樹表明，所采寄主白粉菌與煙草白粉菌不是同一個種，在分子親緣關系上相關性不大。

關鍵詞：煙草;寄主;白粉病菌;相關性;系統(tǒng)發(fā)育

中圖分類號：S435.72

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2020）02-0082-05國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2020.02.014

Preliminary Investigation and Correlation Analysis of Plant Powdery Mildew Near Tobacco Field

ZHANG Kaihong1， SANG Weijun1*， Diao Chaoqiang2， SHI Chunfa2

（1. College of Tobacco Science of Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025， China;2. Guiyang Branch Company， Guizhou Tobacco Company， Guiyang， Guizhou 550002， China;3. Guizhou Southeast Institute of Forestry， Kaili， Guizhou 556000， China）

Abstract：Tobacco powdery mildew is an obligate parasite， which is difficult to find its sexual state in the field， thus it is not very cleart how early tobacco powdery mildew infestation carried out. In order to understand the correlation between tobacco and the hosts， and determine the status of tobacco powdery mildew caused by the surrounding hosts. In this paper， we investigated powdery mildew of tobacco surrounding plants in Guiyang， Qingzhen Kaiyang， Xiuwen， Gui'an New District and other place during one year， and preliminary identified powdery mildew and build plants rDNA-ITS phylogenetic tree to determine their relatives. A total of 30 plants in 16 families of Powdery mildew plants around the tobacco field were investigated，of which the family of Compositae was the most， 8 species; followed by 4 species of legumes. Among the 30 plant species surveyed， Bidens （Asteraceae）， Herba Siegesbeckiae （Asteraceae）， pale smartweed （Polygonaceae）， short sequence iron pigweed （Euphorbiaceae）， hackberry （Ulmaceae） have sexual types and The morphological identifications were Sphaerotheca，Sphaerotheca， Erysiphe， Erysiphe， Erysiphe， the results were consistent with the ITS （ITS4 / 5）. The ITS phylogenetic trees constructed among several species of powdery mildew plants showed that the collected powdery mildew and the powdery mildew were not the same species， and there was little correlation in molecular kinship.

Keywords：tobacco; host; powdery mildew; relevance; phylogeny

煙草白粉?。═abacco powdery mildew）是Erysiphe cichoracearum DC.引起的病害，主要靠分生孢子進行傳播危害，在陰雨寡照天氣下發(fā)生尤為嚴重，病斑初為黃褐色，近圓形，斑上覆白色粉狀物，通常先發(fā)生于成熟葉片，葉腳向上逐漸蔓延，斑塊擴大白粉布滿整個葉片，葉片褪綠后枯死，嚴重時危害嫩莖，病葉烤后色暗且薄，喪失經濟價值。煙草白粉菌是一種專性寄生菌，無法進行培養(yǎng)，目前尚沒有明確煙草白粉菌是如何進行再侵染和病害循環(huán)危害煙草。煙草白粉菌在下一年再次發(fā)生危害，必須經歷嚴寒酷暑，且煙草為一年生植物，前人關于白粉菌再侵染源的調查研究在其他植物上有過相關的報道，主要體現(xiàn)在以下幾個方面;（1）無性態(tài)越冬。張喜萍[1]研究了溫室月季白粉菌發(fā)病規(guī)律發(fā)現(xiàn)，月季的白粉菌分生孢子不能夠通過病殘體進行越冬，主要通過休眠芽里面的菌絲體進行越冬侵染危害，故溫室大棚內的白粉菌可以作為下一年白粉病危害的初侵染源;（2）有性態(tài)越冬。在研究野生寄主發(fā)現(xiàn)周邊野生寄主上的閉囊殼對小麥的侵染能力發(fā)現(xiàn)這些寄主在病害循環(huán)上不能起到作用[24]。楊家書等[3]還發(fā)現(xiàn)自生麥苗上的閉囊殼不能越冬在3、4月份引起春播小麥發(fā)病。

為了解煙草周邊寄主植物白粉菌與煙草白粉菌的關系，明確其在煙草白粉菌越冬的地位，其是否是煙草白粉病病害循環(huán)中的關鍵因子，特展開了煙草周邊植物的白粉菌調查及鑒定，并對兩者之間的相關性進行分析研究。

1材料與方法

1.1試驗材料及儀器

植物白粉菌采集于貴陽市周邊煙草種植田附近）。試劑：無菌水、玻片、酒精燈、針、冰袋保鮮盒、Biomiga公司的真菌基因組DNA提取試劑盒、引物（ITS4 5-TCCTCC-GCTTATTGATATGC-3，ITS5 5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3）。

試驗儀器：凝膠電泳儀、離心機、水浴鍋、PCR儀、光學顯微鏡、光學體視鏡、相機等。

1.2試驗方法

1.2.1病原菌采集

2015年，在清鎮(zhèn)蘆荻、開陽、修文、貴安新區(qū)等煙草基地周邊進行寄主白粉菌調查采樣，把采集到的白粉菌裝入自封袋中封好口，做好標記，把標本裝入裝有冰袋的泡沫盒中，帶回實驗室鏡檢及提取DNA。

1.2.2形態(tài)學觀察

用透明膠帶粘取白色霉層，放在滴有 3% KOH 的載玻片上，在Olympus顯微鏡下觀察病原菌菌絲、分生孢子梗和分生孢子、附著胞、芽管等特征，并進行測量和顯微拍照，結合相關文獻鑒定病原菌[56]。

1.2.3DNA提取及擴增

把標本放置在光學體視鏡下用挑針挑取孢子（約200個），將孢子收集到2 mL的離心管中，作為DNA提取材料，用Bioma公司生產的真菌DNA提取試劑盒對白粉菌總DNA進行提取，提取方法參照說明書。PCR反應體系為：9.5 μL ddH2O，12.5 μL 2×Tap Master Mix（天根生化科技（北京）有限公司），正反引物各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL。

1.2.4系統(tǒng)發(fā)育樹建立

用MEGA 5.0對所測的白粉菌屬樣品ITS序列經Clustal匹配分析，并進行比對分析，基于Kimura-2-parameter雙參數(shù)模型，采用鄰近距離法（NJ法）構建系統(tǒng)進化樹以推演系統(tǒng)發(fā)生關系，同時，采用bootstrap法，經1 000次循環(huán)檢驗系統(tǒng)進化樹的可靠性。最后，對樹形進行優(yōu)化分析，以篩選出最適合反映煙草白粉病E.cichoracearum DC.與植物白粉菌相關性的樹形。

2結果與分析

2.1植物白粉菌發(fā)生情況調查、ITS鑒定結果及部分白粉菌屬形態(tài)學鑒定結果

經過一年多的煙田周邊白粉菌的寄主采集，目前已經確定16個科30種植物，其中菊科植物種類最多，種數(shù)為8種，其次是豆科的4種。調查的30種植物中，三葉鬼針草（菊科）、豨薟（菊科）、酸模葉蓼（蓼科）、短序鐵莧（大戟科）、樸樹（榆科）等5種植物發(fā)現(xiàn)有性型，形態(tài)學鑒定分別為單囊殼屬Sphaerotheca、單囊殼屬Sphaerotheca、白粉菌屬 Erysiphe、白粉菌屬 Erysiphe、白粉菌屬 Erysiphe，對以上采集到的部分白粉菌進行測序（ITS4/5）比較，測序結果表明，共有6種菌屬于白粉菌屬，寄主分別是三葉草Oxalidaceae、川榛Corylus heterophylla、紫茉莉Mirabilis jalapa、樸樹Celtis sinensis、酸模葉蓼Polygonum lapathifolium、短序鐵莧Acalypha brachystachya，其中有5種在野外采集到有性態(tài)，對部分的樣品鑒定結果如表1所示。

2.2形態(tài)學描述

2.2.1酸模葉蓼白粉菌

酸模葉蓼白粉菌于8月份左右發(fā)病，發(fā)病初期可見葉正面有白色小點分布，病害發(fā)生嚴重時正反面可見白色粉層，多集中在背面，于10月份左右產生閉囊殼，閉囊殼主要分布于葉背，子囊果集生，少數(shù)散生，形態(tài)學鑒定為蓼白粉菌Erysiphe polygoni DC.。分生孢子柱狀串生4～7個，大小25.0～450×13.0～19.0 μm;子囊果聚生至近聚生，少數(shù)散生，暗褐色，扁球形，直徑82～137 μm，壁細胞不規(guī)則多角形，直徑6～16 μm，附屬絲15～35根，不分枝或不規(guī)則分枝，少數(shù)近雙叉分枝

1～2次，彎曲，常作扭曲狀或曲折狀，長度約為子囊果的0.5～1.7倍，長45～195 μm，上下近等粗或局部粗細不勻，褐色至無色，子囊3～8個，卵形，少數(shù)近球狀，有柄有時亦不見柄，45～70×30-30-40 μm，子囊孢子孢子2～5個，一般卵-橢圓形，少數(shù)卵-矩圓形，帶黃色，15～30×10～15 μm。

2.2.2短序鐵莧白粉菌

短序鐵莧白粉菌于7月份末發(fā)病，發(fā)病初期可見葉正面有白色小點分布，病害發(fā)生嚴重時正反面可見白色粉層，多集中在背面，于9月中旬產生閉囊殼，閉囊殼主要分布于葉背，葉正面也有分布，子囊果多集生少散生，形態(tài)學鑒定為鐵莧白粉菌Erysiphe acalyphae DC.。分生孢子柱狀串生4～7個，大小23.0～46.0×14.0～20.0 μm;子囊果聚生至近聚生，少數(shù)散生，暗褐色，扁球形，直徑75～125 μm，壁細胞不規(guī)則多角形，直徑8～18 μm，附屬絲16～28根，至子囊果上部發(fā)生，直或稍彎曲，長度約為子囊果的0.5～1倍，長60～175 μm，上下近等粗或下部略粗，子囊3～7個，卵形、近卵形至不規(guī)則卵形，有柄有時亦不見柄，27～45×30-17-26 μm，子囊孢子不能夠完全出現(xiàn)。

2.2.3樸樹白粉菌

樸樹白粉菌于10月左右開始發(fā)病，發(fā)病初期可見葉正面有白色小點分布，病害發(fā)生嚴重時正反面可見白色粉層，多集中在正面，于11月月中旬產生閉囊殼，閉囊殼主要分布于葉背，葉正面也有分布，子囊果多集生少散生，能產生兩種形態(tài)的產孢結構，經形態(tài)學鑒定為三孢半內生鉤絲殼Pleochaeta shiraiana DC.和南芥白粉菌E. acalyphae DC.。分生孢子柱狀串生4～7個，大小25.0～40.0×160～20.0 μm;三孢半內生鉤絲殼Pleochaeta shiraiana DC.，子囊果聚生至近聚生，少數(shù)散生，暗褐色，扁球形，多分布葉正面，直徑90-140 μm，壁細胞不規(guī)則多角形，直徑15～25 μm，附屬絲8～15根，至子囊果上部發(fā)生，直或彎曲，長度約為子囊果的0.7～1.5倍，長70～155 μm，上下近等粗或下部略粗，子囊4～6個，近球形、廣卵形至不規(guī)則卵形，大多數(shù)無柄，少數(shù)有短柄，45～55×30～45 μm，子囊孢子4～6個，大小12～20×10～15 μm（圖3b， 3c）;南芥白粉菌E.acalyphae DC.，子囊果聚生至近聚生，少數(shù)散生，暗褐色，扁球形，直徑85～185μm，壁細胞不規(guī)則多角形，直徑12～25 μm，附屬絲7～15根，至子囊果上部發(fā)生，直或稍彎曲，長度約為子囊果的0.5～1倍，長40～175 μm，上下近等粗或下部略粗，子囊2個有時3、4個，卵形、近卵形至不規(guī)則卵形，有柄有時亦不見柄，35～55×20～30 μm，子囊孢子5～8個，大小12～23×6～14 μm（圖3-D）。

2.3系統(tǒng)發(fā)育

構建的系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出，32個樣品經過系統(tǒng)發(fā)育樹比較后大致分入3支，分別是白粉菌屬（Erysiphe）、叉絲單囊殼屬（Podosphaera）、布氏白粉菌屬（Blumeria），與形態(tài)學鑒定結果一致;測定的植物白粉菌均與NCBI里面白粉菌屬植物列入一個分枝，但是在白粉菌屬分組中，煙草白粉病E.cichoracearum DC.卻被分到另一個分枝，與前面鑒定的酸模葉蓼白粉菌、短序鐵莧白粉菌、樸樹白粉菌分隔開來，說明形態(tài)學鑒定結果在分子水平上基本保持一致，故可以推斷煙草白粉菌E.cichoracearum DC.與周邊寄主植物其他白粉菌種種間相關性不大，其他白粉菌屬的種不太可能交叉感染引起煙草白粉病?？紤]到本次采樣在其他植物上沒有采到菊科白粉菌E.cichoracearum DC.，故應該以不同寄主白粉菌E. cichoracearum DC.與煙草的病原菌想關性作為出發(fā)點，采集寄主植物菊科白粉菌

3結論與討論

據(jù)劉鐵志等[6]研究表明，有一些植物白粉病存在著多個病原菌，以往所認識的引起煙草白粉病的病菌為E. cichoracearum DC.，但是根據(jù)刑荷荷等[9]調查了青島煙草發(fā)現(xiàn)引起煙草白粉病的病原菌為奧隆特高氏白粉菌Golovinomyces orontii，故煙草白粉菌也可能存在著多個病原菌。

COOK等[10]研究介紹，將紫藤和夏櫟上分離的白粉菌E. alphitoides接種到夏櫟上成功了，但是接種白粉菌到紫藤上均失敗告終，BRAUN

和COOK[11]也報道夏櫟在世界范圍內存在著超過26種白粉菌，故表明白粉菌寄主選擇有擴張的趨勢。煙草白粉病的控制除了采用抗病品種外，首先就要加強田間管理，煙田雜草的發(fā)生嚴重影響了烤煙的質量和產量，李祖任等人

[7]

于2011年和2012年對貴州省主要烤煙產區(qū)進行了雜草調查，共鑒定出雜草191種，隸屬于43科132屬。而且有研究表明很多雜草已經成為煙草病蟲害的寄主和傳播媒介，對煙草的生長產生了很大的危害[8]。分子系統(tǒng)學是一種比較直觀和簡單的反應不同種屬親緣關系的方法，目前已經被廣泛應用于真菌分類學中，為了解煙田周邊寄主白粉菌與煙草白粉菌的相關性，本文對煙田周邊寄主白粉菌進行調查采樣，共采集到了寄主植物30種，表明貴陽地區(qū)煙田周邊白粉菌寄主非常豐富，將采集到的樣品進行形態(tài)學鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析確定煙草白粉菌與寄主白粉菌的相關性，結果表明，形態(tài)學鑒定結果基本上與分子鑒定一致，故表明煙草白粉病不是E. cichoracearum DC.菌而是由本屬的其他種引起的概率非常低，煙草白粉病與其他種類白粉菌屬的種的相關性不大，為了更好確定二者間的相互作用關系，還需進行致病分析及采集引起煙草白粉病的同一種白粉菌進行致病分析和系統(tǒng)發(fā)育分析確認，為煙草白粉病發(fā)生的預測預報工作制定科學合理的煙田雜草防除策略奠定基礎。

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