綿羊Fsp27基因5

張偉 王世銀 高莉 徐夢(mèng)思 王新華 甘尚權(quán)

摘要：【目的】明確綿羊脂肪特異蛋白27基因（Fsp27）5'端非編碼區(qū)（5'-UTR）g.16767527位點(diǎn)和g.16767779-16767780位點(diǎn)突變與其尾脂沉積能力的關(guān)聯(lián)性，為低脂肪綿羊品種選育提供理想的分子標(biāo)記，提高低脂肪綿羊品種改良選育效率。【方法】以5個(gè)不同尾脂沉積能力的綿羊品種為研究對(duì)象，包括脂尾型綿羊品種阿勒泰羊，短脂尾型綿羊品種小尾寒羊和湖羊，長瘦尾型綿羊品種中國美利奴細(xì)毛羊和薩?？搜?，采用PCR-SSCP結(jié)合基因測(cè)序?qū)d羊Fsp27基因5'-UTR區(qū)堿基突變情況進(jìn)行檢測(cè)，并分析相關(guān)突變與綿羊尾脂沉積能力的關(guān)聯(lián)性。【結(jié)果】綿羊Fsp27基因5'-UTR區(qū)g.16767527位點(diǎn)為C/A突變，在所檢測(cè)的綿羊群體中均存在3種基因型（CC、CA和AA），但在不同尾脂沉積能力綿羊品種群體中的基因型頻率存在明顯差異：阿勒泰羊群體中以CC基因型為主，基因型頻率為0.869;小尾寒羊和湖羊群體中以CA基因型為主，基因型頻率分別為0.698和0.628;中國美利奴細(xì)毛羊和薩福克羊群體則以AA基因型為主，基因型頻率分別為0.616和0.833。g.16767527位點(diǎn)的基因型分布在阿勒泰羊、小尾寒羊和湖羊群體中極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（PHWE<0.01），在薩?？搜蛉后w中顯著偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（PHWE<0.05）。g.16767779-16767780位點(diǎn)為雙堿基突變，對(duì)應(yīng)為GG/GG、GG/TC和TC/TC基因型;在尾脂沉積能力強(qiáng)的阿勒泰羊、小尾寒羊和湖羊群體中，g.16767779-16767780位點(diǎn)以TC為優(yōu)勢(shì)等位基因，對(duì)應(yīng)的等位基因頻率分別為0.862、0.954和0.927;在尾脂沉積能力差的中國美利奴細(xì)毛羊和薩?？搜蛉后w中則以GG等位基因?yàn)橹?，其等位基因頻率分別為0.980和0.983。這2個(gè)位點(diǎn)的突變均對(duì)綿羊Fsp27基因5'-UTR區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響?！窘Y(jié)論】綿羊Fsp27基因5'-UTR區(qū)g.16767527位點(diǎn)的C/A突變和g.16767779-16767780位點(diǎn)的GG/TC突變與其尾脂沉積能力密切相關(guān)，可作為分子標(biāo)記應(yīng)用于低脂肪綿羊品種的輔助選育。

關(guān)鍵詞： 綿羊;Fsp27基因;5'-UTR區(qū);堿基突變;尾脂沉積能力;關(guān)聯(lián)性

中圖分類號(hào)： S826.8? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）07-1511-09

Abstract：【Objective】To investigate the relationship between the g.16767527 site and g.16767779-16767780 sites mutation of fat specific protein 27 gene（Fsp27） 5' non-coding region（5'-UTR） and the tail fat deposition ability of sheep， find ideal molecular markers for low fat sheep breeding， and then improve the breeding efficiency of low fat sheep. 【Method】Here， five sheep breeds which had different fat deposition abilities were chosen， including the Altay sheep， which is a fat tail or nates sheep breed， small tail Han sheep and Hu sheep， which are short fat tail breeds， and Chinese Merino and Suffolk sheep， which are long thin tail breeds， and PCR-SSCP and gene sequencing were applied to detect the mutation in 5'-UTR of Fsp27 gene and investigated the relationship between the mutation sites and tail fat deposition in sheep. 【Result】The results showed that three genotypes（CC， CA and AA） of the C/A mutation at g.16767527 site in 5'-UTR of Fsp27 gene could be detected in all sheep population included in this research， but their genotype frequency were different in sheep breeds with different fat deposition abilities. The CC genotype was the major one in Altay sheep population， its genotype was 0.869; the CA genotype was the major one in Small Tail Han sheep and Hu sheep， the genotype were 0.698 and 0.628 respectively; but in Chinese Merino and Suffolk sheep， the AA was major genotype， the genotype were 0.616 and 0.833 respectively. The genotype distribution of g.16767527 site extremely significantly drifted Hardy-Weinberg equilibrium（PHWE<0.01） in Altay， Small Tail Han sheep and Hu sheep， and it significantly drifted Hardy-Weinberg equilibrium（PHWE<0.05） in Suffolk sheep population. At g.16767779-16767780 site， there were two mutated bases， and showed three different genotypes， GG/GG， GG/TC and TC/TC respectively. The TC was preponderance genotype at g.16767779-16767780 sites in Altay sheep， Small Tail Han sheep and Hu sheep population， which had a good ability to grow tail fat， and the genotype frequencies were 0.862， 0.954 and 0.927 respectively. But in Chinese Merion and Suffolk sheep population， which had poor tail fat deposition ability， the preponderance genotype was GG and genotype frequencies were 0.980 and 0.983 respectively. Further investigation showed that mutation at the two sites all obviously affected the secondary structure of Fsp27 gene? 5'-UTR. 【Conclusion】The C/A mutation at g.16767527 site and GG/TC mutation at g.16767779-16767780 site of Fsp27 gene 5'-UTR of sheep are highly correlated with their tail fat deposition ability， and may be good molecular markers that can be used to breed sheep breeds with low fat.

Key words： sheep（Ovis aries）; Fsp27 gene; 5'-UTR region; base mutation; tail fat deposition ability; relevance

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31860298， 31860639）; Open Project of State Key Laboratory of Sheep Genetic Improvement and Healthy Production（MYSKLKF201801）

0 引言

【研究意義】高寒地區(qū)綿羊利用夏秋季節(jié)牧草充足時(shí)期在其尾部沉積大量脂肪作為能量儲(chǔ)備，至冬季牧草匱乏時(shí)則通過分解尾脂為機(jī)體提供能量，順利度過冬季漫長的枯草期（甘尚權(quán)等，2013a）。在過去物質(zhì)匱乏的年代，綿羊尾脂也是農(nóng)牧民動(dòng)物脂肪的重要來源，尾脂沉積能力強(qiáng)的綿羊品種也因此更受青睞。在自然選擇和人工選擇的共同作用下，高寒地區(qū)已形成很多尾脂沉積能力較強(qiáng)的綿羊品種（張偉等，2014），我國新疆北部地區(qū)大量養(yǎng)殖的阿勒泰羊就是典型代表。由于養(yǎng)殖條件的不斷改善，冬季枯草期已不再對(duì)高寒地區(qū)的綿羊產(chǎn)生明顯影響，且隨著人們生活水平的提高，高脂肪食物攝入對(duì)健康產(chǎn)生的危害已得到廣泛關(guān)注。在這種背景下，尾脂發(fā)達(dá)且胴體脂肪含量高的綿羊品種不再受到農(nóng)牧民和消費(fèi)者青睞。因此，如何在保持這類綿羊品種優(yōu)良性狀的前提下對(duì)其進(jìn)行改良選育，對(duì)提高脂尾型綿羊品種的市場(chǎng)適應(yīng)性及促進(jìn)低脂肪健康羊肉生產(chǎn)均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】脂肪特異蛋白27（Fat specific protein 27，F(xiàn)sp27）屬于CIDE（Cell death-inducing DEF45-like effector）家族成員，定位于脂滴表面和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)（Nian et al.，2010），在促進(jìn)脂肪細(xì)胞的脂滴融合過程中發(fā)揮重要作用（潘洪彬等，2014，2015）。Fsp27可在脂滴—脂滴接觸點(diǎn)（LD contact site，LDCS）上介導(dǎo)小脂滴中的中性脂經(jīng)LDCS向大脂滴轉(zhuǎn)移，進(jìn)而形成更大的脂滴，若Fsp27基因被敲除，則無法完成上述過程（Gong et al.，2011）。Nishino等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，敲除Fsp27基因后，小鼠的白色脂肪水解速率顯著升高，脂肪細(xì)胞中的大脂滴轉(zhuǎn)變成很多分散均勻的小脂滴。Xu等（2015）研究證實(shí)，正常情況下人類肝細(xì)胞中的Fsp27基因表達(dá)量很低，當(dāng)其被激活且上調(diào)表達(dá)時(shí)，會(huì)促進(jìn)肝細(xì)胞中的脂滴生長，最終導(dǎo)致脂肪肝發(fā)生。董維鵬等（2018）研究表明，在3T3-L1細(xì)胞中，若Fsp27基因表達(dá)量下調(diào)，則細(xì)胞中的甘油三酯含量顯著下降、甘油含量顯著上升，同時(shí)大脂滴的生成受抑制，細(xì)胞中分散有大量小脂滴。Fsp27肽鏈N端第1～130個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域僅在維持其構(gòu)象中發(fā)揮作用，其C-端第131～239個(gè)氨基酸殘基在介導(dǎo)LDCS的中性脂轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用（Tamori et al.，2016），而第120～220個(gè)氨基酸殘基可與甘油三酯脂肪酶（Adipose triglyceride lipase，ATGL）相互作用，抑制ATGL的脂肪分解功能，進(jìn)而引起甘油三酯沉積（Grahn et al.，2014）。此外，F(xiàn)sp27可特異性抑制激素敏感脂肪酶（Hormone sensitive lipase，HSL）在脂滴表面的定位，進(jìn)而抑制脂肪水解（李聰?shù)龋?014）。Fsp27基因表達(dá)水平與動(dòng)物體內(nèi)游離脂肪酸的含量密切相關(guān)，當(dāng)脂肪酸水平升高時(shí)，F(xiàn)sp27基因表達(dá)量相應(yīng)上調(diào)，脂肪合成速度加快;而脂肪酸水平降低時(shí)，F(xiàn)sp27基因表達(dá)量迅速下調(diào)，脂肪水解速度加快，從而使體內(nèi)的脂肪酸保持在適當(dāng)水平，以滿足機(jī)體的能量需求（Nian et al.，2010）。Fsp27在生物體內(nèi)不穩(wěn)定，其半衰期約1 h，說明其可快速響應(yīng)體內(nèi)脂肪酸的變化（Price et al.，2019）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】Fsp27基因在調(diào)控動(dòng)物的脂肪沉積過程中發(fā)揮重要作用。本課題組前期在綿羊Fsp27基因5'端非編碼區(qū)（5'-UTR）檢測(cè)到大量的突變位點(diǎn)，但這些突變位點(diǎn)是否與綿羊的尾脂沉積能力相關(guān)尚有待進(jìn)一步探究。【擬解決的關(guān)鍵問題】以5個(gè)不同尾脂沉積能力的綿羊品種為研究對(duì)象，對(duì)Fsp27基因5'-UTR區(qū)g.16767527位點(diǎn)和g.16767779-16767780位點(diǎn)突變與綿羊尾脂沉積能力的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期為低脂肪綿羊品種選育提供理想的分子標(biāo)記，提高低脂肪綿羊品種改良選育效率。

1 材料與方法

1. 1 樣品采集

200份湖羊（短脂尾型）耳組織采自新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)六師鑫寶種羊場(chǎng)，210份薩?？搜颍ㄩL瘦尾型）耳組織采自新疆奇臺(tái)農(nóng)場(chǎng)種羊場(chǎng)，200份中國美利奴細(xì)毛羊（長瘦尾型）耳組織采自新疆吉木薩爾縣三臺(tái)鎮(zhèn)細(xì)毛羊養(yǎng)殖基地，215份阿勒泰羊（脂尾型）耳組織樣品和165份小尾寒羊（短脂尾型）基因組樣品由新疆農(nóng)墾科學(xué)院甘尚權(quán)研究員課題組饋贈(zèng)，所有耳組織樣品均置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 DNA提取

不同綿羊品種耳組織樣品的基因組DNA均采用動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）進(jìn)行提取，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 引物設(shè)計(jì)與合成

檢索Ensemble網(wǎng)站（http：//asia.ensembl.org/index.html），獲得綿羊Fsp27基因序列，然后與UCSC中（http：//genome.ucsc.edu/）收錄的綿羊基因組序列（Oar_v4.0，Nov. 2015）進(jìn)行比對(duì)，截取包含5'-UTR的1000 bp序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物，分別擴(kuò)增Fsp27基因5'-UTR區(qū)（包含g.16767527位點(diǎn)和g.16767779-16767780位點(diǎn)），要求擴(kuò)增片段控制在300 bp左右，以利于后續(xù)進(jìn)行SSCP檢測(cè)。擴(kuò)增引物（表1）采用Oligo 6.0進(jìn)行設(shè)計(jì)，然后委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 4 不同綿羊品種Fsp27基因突變情況檢測(cè)及其尾脂沉積能力關(guān)聯(lián)性分析

以不同綿羊品種基因組DNA為模板，選用表1中的引物分別對(duì)Fsp27基因5'-UTR區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系25.0 ?L：DNA模板（100 ng/mL）1.0 ?L，10×PCR Buffer 2.5 ?L，dNTPs（10 mmol/L）2.0 ?L，上、下游引物（10 mmol/L）各0.5 ?L，Taq DNA聚合酶（2.5 U/L）0.5 ?L，加ddH2O補(bǔ)足至25.0 ?L。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，參照甘尚權(quán)等（2013b）的方法對(duì)其進(jìn)行SSCP檢測(cè)，挑選不同帶型的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，以確定其對(duì)應(yīng)的突變位點(diǎn)，并分析相關(guān)突變與綿羊品種尾脂沉積能力的關(guān)聯(lián)性。

1. 5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0計(jì)算不同綿羊群體中Fsp27基因2個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型頻率及等位基因頻率，以卡方（χ2）檢驗(yàn)分析各群體中的基因型是否處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（張偉等，2016）;使用RNAstructure 5.6分析不同位點(diǎn)突變對(duì)Fsp27基因5'-UTR二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，并通過能值△G變化比較不同構(gòu)象的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 綿羊Fsp27基因5'-UTR區(qū)的PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR擴(kuò)增綿羊Fsp27基因5'-UTR區(qū)g.16767527位點(diǎn)和g.16767779-16767780位點(diǎn)所在區(qū)域，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)均獲得清晰明亮的單一條帶（圖1），未見明顯雜帶，且擴(kuò)增片段大小與預(yù)期結(jié)果相符，說明PCR擴(kuò)增體系具有良好的特異性和較高的擴(kuò)增效率，為后續(xù)進(jìn)行SSCP檢測(cè)提供了可靠保障。

2. 2 綿羊Fsp27基因5'-UTR區(qū)g.16767527位點(diǎn)突變與綿羊尾脂沉積能力的關(guān)聯(lián)性

使用Fsp27P1U和Fsp27P1L引物分別擴(kuò)增不同尾脂沉積能力綿羊品種的基因組，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SSCP檢測(cè)，共獲得3種帶型（圖2-A）;對(duì)不同帶型對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，可確認(rèn)其分別為CC、CA和AA基因型（圖2-B），說明g.16767527位點(diǎn)在所檢測(cè)的綿羊群體中均存在3種基因型。

在5個(gè)不同尾脂沉積能力綿羊品種群體中均能檢測(cè)到綿羊Fsp27基因5'-UTR區(qū)g.16767527位點(diǎn)，但其基因型頻率存在明顯差異（表2），且與尾脂沉積能力具有明顯的關(guān)聯(lián)性。在脂尾型的阿勒泰羊群體中，CC基因型頻率為0.869，CA和AA基因型頻率分別為0.094和0.038;在短脂尾型的小尾寒羊和湖羊群體中以CA基因型為主，基因型頻率分別為0.698和0.628;在長瘦尾型的中國美利奴細(xì)毛羊和薩?？搜蛉后w中則以AA基因型為主，基因型頻率分別為0.616和0.833?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果顯示，g.16767527C>A位點(diǎn)的基因型分布在阿勒泰羊、小尾寒羊和湖羊群體中極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（PHWE<0.01），在薩?？搜蛉后w中顯著偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（PHWE<0.05）。

2. 3 綿羊Fsp27基因5'-UTR區(qū)g.16767779-16767780位點(diǎn)突變與綿羊尾脂沉積能力的關(guān)聯(lián)性

使用Fsp27P2U和Fsp27P2L引物分別擴(kuò)增不同尾脂沉積能力綿羊品種的基因組，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SSCP檢測(cè)，也獲得3種帶型（圖3-A）;對(duì)不同帶型對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)為雙堿基突變，分別對(duì)應(yīng)為GG/GG、GG/TC和TC/TC基因型（圖3-B）。此外，在檢測(cè)綿羊群體中該雙堿基突變存在明顯的連鎖遺傳，即G等位基因和G等位基因存在連鎖，T等位基因和C等位基因存在連鎖。

進(jìn)一步分析g.16767779-16767780位點(diǎn)在不同尾脂沉積能力綿羊品種群體中的分布情況，結(jié)果表明該位點(diǎn)與綿羊的尾脂沉積能力存在明顯關(guān)聯(lián)性（表3）。在尾脂沉積能力強(qiáng)的阿勒泰羊、小尾寒羊和湖羊群體中，g.16767779-16767780位點(diǎn)以TC為優(yōu)勢(shì)等位基因，對(duì)應(yīng)的等位基因頻率分別為0.862、0.954和0.927;在尾脂沉積能力差的中國美利奴細(xì)毛羊和薩?？搜蛉后w中則以GG等位基因?yàn)橹?，其等位基因頻率分別為0.980和0.983。

2. 4 位點(diǎn)突變對(duì)綿羊Fsp27基因5'-UTR二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

為進(jìn)一步了解g.16767527位點(diǎn)和g.16767779-16767780位點(diǎn)突變對(duì)綿羊Fsp27基因5'-UTR二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，采用RNAstructure 5.6對(duì)不同基因型的5'-UTR二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，取自由能最低的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果（圖4和圖5）發(fā)現(xiàn)這2個(gè)SNPs位點(diǎn)的突變均對(duì)綿羊Fsp27基因5'-UTR二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響。由于綿羊Fsp27基因的5'-UTR與翻譯起始調(diào)控、穩(wěn)定性、剪切加工及細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸和定位等過程密切相關(guān)，若堿基突變?cè)斐善涠?jí)結(jié)構(gòu)改變，則可能對(duì)上述過程產(chǎn)生影響，致使細(xì)胞中Fsp27基因的編碼蛋白水平發(fā)生變化，進(jìn)而影響其參與調(diào)控的生物學(xué)過程。

3 討論

Fsp27定位于脂肪細(xì)胞的脂滴表面和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)（Nian et al.，2010;許祥等，2020），其對(duì)脂肪沉積的調(diào)控過程已基本闡明，主要通過以下途徑促進(jìn)脂肪沉積：（1）通過LDCS介導(dǎo)小脂滴中的中性脂肪向大脂滴轉(zhuǎn)移，進(jìn)而形成一個(gè)更大的脂滴（Gong et al.，2011）;（2）Fsp27可特異性抑制HSL在脂滴表面的定位，HSL是脂肪水解過程中的關(guān)鍵水解酶，若HSL無法結(jié)合到脂滴上，則無法參與脂肪水解，進(jìn)而導(dǎo)致脂肪水解受到影響（李聰?shù)龋?014）。Fsp27基因在細(xì)胞中的表達(dá)量與脂肪酸含量密切相關(guān)，但Fsp27不穩(wěn)定，在生物體內(nèi)的半衰期約1 h，因此其蛋白水平可快速響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸含量的變化（Price et al.，2019）。當(dāng)脂肪酸水平升高時(shí)，F(xiàn)sp27基因表達(dá)量上調(diào)，脂肪水解被抑制;而脂肪酸不足時(shí)，F(xiàn)sp27基因表達(dá)量下調(diào)，脂肪水解速率加快，促使機(jī)體的脂肪酸水平和能量供應(yīng)保持在動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)（Nian et al.，2010）?？梢姡炯?xì)胞中Fsp27基因的表達(dá)量對(duì)其生物學(xué)功能正常發(fā)揮至關(guān)重要。

在細(xì)胞質(zhì)中，單鏈mRNA均通過鏈內(nèi)堿基配對(duì)而折疊成具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，而這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)通常是核糖體結(jié)合及核酸內(nèi)切酶識(shí)別等生物學(xué)過程的重要特征（王琛，2015;李瑞芳等，2018;常衛(wèi)東等，2019）。由于mRNA的5'-UTR與翻譯起始調(diào)控、穩(wěn)定性、剪切加工及細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸和定位等過程密切相關(guān)（邢光東等，2008;高飛，2012），若5'-UTR發(fā)生堿基突變而影響其二級(jí)結(jié)構(gòu)，勢(shì)必對(duì)其參與調(diào)控的信號(hào)通路產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響所調(diào)控的相關(guān)性狀。雖然至今未見綿羊Fsp27基因5'-UTR區(qū)堿基突變對(duì)其生物學(xué)功能產(chǎn)生影響的相關(guān)報(bào)道，但Curi等（2009）對(duì)瘤牛及其與黃牛雜交后代的研究結(jié)果表明，鈣調(diào)蛋白抑制蛋白（Calpastatin，CAST）基因5'-UTR區(qū)的Ddel多態(tài)位點(diǎn)與牛肉的剪切值（SF）及肌原纖維斷裂指數(shù)（MFI）相關(guān);秦立紅等（2010）也研究表明，公牛雄激素受體基因5'-UTR區(qū)的T/G突變與其精子密度顯著相關(guān);鄒輝等（2019）在努比亞山羊骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體-IB（BMPR-IB）基因5'-UTR區(qū)檢測(cè)到A/G突變，其關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明該突變位點(diǎn)與努比亞山羊繁殖性能相關(guān)，表現(xiàn)為GG基因型母羊的產(chǎn)羔數(shù)和子代平均初生重較AA基因型母羊均有所減少。本研究通過對(duì)不同尾脂沉積能力綿羊品種Fsp27基因5'-UTR區(qū)的堿基突變進(jìn)行系統(tǒng)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)g.16767527位點(diǎn)的C/A突變和g.16767779-16767780位點(diǎn)的GG/TC突變均與綿羊尾脂沉積能力密切相關(guān)，具體表現(xiàn)為g.16767527位點(diǎn)為C等位基因和g.16767779-16767780位點(diǎn)為TC等位基因的綿羊品種尾脂沉積能力均明顯增強(qiáng)。此外，g.16767527位點(diǎn)和g.16767779-16767780位點(diǎn)的突變均對(duì)綿羊Fsp27基因5'-UTR區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響，且由于這2個(gè)突變位點(diǎn)與綿羊尾脂沉積能力密切相關(guān)，故推測(cè)這種二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變可能對(duì)mRNA穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯效率產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響脂肪細(xì)胞中Fsp27基因的表達(dá)水平，最終造成綿羊尾脂沉積能力差異。鑒于此，今后應(yīng)對(duì)不同基因型綿羊個(gè)體尾脂組織中的Fsp27基因表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，進(jìn)一步揭示這2個(gè)突變位點(diǎn)的生物學(xué)功能。

脂肪代謝關(guān)系到機(jī)體能量供應(yīng)，且一定是通過復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行精確控制，絕非1～2個(gè)基因或SNP位點(diǎn)就能闡述清楚。不同綿羊品種的尾脂沉積能力差異非常明顯，為研究脂肪代謝調(diào)控機(jī)制提供了很好的素材。本研究選用的阿勒泰羊?qū)儆谥玻ㄖ危┬途d羊品種（趙倩君等，2010），沉積尾部脂肪能力非常強(qiáng)，其尾脂重量可達(dá)十幾公斤;湖羊和小尾寒羊?qū)儆诙讨残途d羊品種，其尾脂沉積能力相對(duì)較弱（鞏元芳等，2002;王凱等，2013）;薩福克羊和細(xì)毛羊則屬于長瘦尾綿羊品種，其尾脂沉積能力最差。此外，這5個(gè)綿羊品種地域間隔較遠(yuǎn)，進(jìn)行基因交流的可能性較小。本課題組前期曾對(duì)阿勒泰羊、小尾寒羊、湖羊、薩?？搜蚝椭袊览?xì)毛羊等5個(gè)綿羊品種的脂肪沉積相關(guān)基因突變情況進(jìn)行系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)了大量與尾脂沉積能力相關(guān)的SNPs位點(diǎn)（甘尚權(quán)等，2013b;王世銀等，2013;張偉等，2013），綜合本研究的相關(guān)數(shù)據(jù)，后期將對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行深度分析，進(jìn)而為低脂肪綿羊品種選育提供理想的分子標(biāo)記。

4 結(jié)論

綿羊Fsp27基因5'-UTR區(qū)g.16767527位點(diǎn)的C/A突變和g.16767779-16767780位點(diǎn)的GG/TC突變與其尾脂沉積能力密切相關(guān)，可作為分子標(biāo)記應(yīng)用于低脂肪綿羊品種的輔助選育。

參考文獻(xiàn)：

常衛(wèi)東，魏康寧，王麗，王林嵩，李用芳. 2019. mRNA的N6-甲基腺嘌呤研究進(jìn)展[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，48（1）：1-5. [Chang W D，Wei K N，Wang L，Wang L S，Li Y F. 2019. Recent progresses of N6-methyladenosine in mRNA[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences，48（1）：1-5.]

董維鵬，張少華，許祥，燕炯. 2018. 下調(diào)Fsp27基因表達(dá)聯(lián)合楊梅素干預(yù)對(duì)3T3-L1細(xì)胞脂解的影響[J]. 中國生物工程雜志，38（12）：7-13. [Dong W P，Zhang S H，Xu X，Yan J. 2018. The effect and mechanism of down-regula-ted Fsp27 gene combined with myricetin on lipolysis of 3T3-L1 adipocytes[J]. China Biotechnology，38（12）：7-13.]

甘尚權(quán)，沈敏，李歡，梁耀偉，楊井泉，高磊，劉守仁，王新華. 2013a. X染色體60149273位點(diǎn)在脂尾（臀）和瘦尾綿羊品種中的多態(tài)性及其基因定位[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，46（22）：4791-4799. [Gan S Q，Shen M，Li H，Liang Y W，Yang J Q，Gao L，Liu S R，Wang X H. 2013a. Polymorphism of the 60149273th loci on X chromosome among fat tail and thin tail breeds and its gene mapping[J]. Scientia Agricultura Sinica，46（22）：4791-4799.]

甘尚權(quán)，張偉，沈敏，李歡，楊井泉，梁耀偉，高磊，劉守仁，王新華. 2013b. 綿羊X染色體59383635位點(diǎn)多態(tài)性與脂尾性狀的相關(guān)性分析[J]. 遺傳，35（10）：1209-1216. [Gan S Q，Zhang W，Shen M，Li H，Yang J Q，Liang Y W，Gao L，Liu S R，Wang X H. 2013b. Correlation analysis between polymorphism of the 59383635th locus on X chromosome and fat-tail trait in sheep[J]. Hereditas（Beijing），35（10）：1209-1216.]

高飛. 2012. 豬繁殖與呼吸綜合征病毒5'非編碼區(qū)順式作用元件的解析[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué). [Gao F. 2012. Dissection of cis-acting elements in 5'-untranslated region of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[D]. Nanjing：Nanjing Agricultural University.]

鞏元芳，李祥龍，劉錚鑄，李金泉. 2002. 我國主要地方綿羊品種隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA研究[J]. 遺傳，24（4）：423-426. [Gong Y F，Li X L，Liu Z Z，Li J Q. 2002. Studies of random amplified polymorphic DNA（RAPD） of main indigenous sheep breeds in China[J]. Hereditas（Beijing），24（4）：423-426.]

李聰，周林康，李蓬. 2014. Fsp27通過抑制HSL的脂滴定位調(diào)節(jié)脂肪水解[J]. 中國科學(xué)：生命科學(xué)，44（10）：1073-1081. [Li C，Zhou L K，Li P. 2014. Fsp27 inhibits lipolysis by excluding HSL from lipid droplet surface[J]. Scientia Sinica Vitae，44（10）：1073-1081.]

李瑞芳，李宏，郭春陽，楊薩如拉. 2018. mRNA環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白質(zhì)折疊速率的影響[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，45（6）：672-678. [Li R F，Li H，Guo C Y，Yang S R L. 2018. Influences of the mRNA loop structures on protein fol-ding rate[J]. Progress in Biochemistry and Biophysics，45（6）：672-678.]

潘洪彬，孫澤威，李春雨，趙素梅，黃英，楊明華，高士爭，秦貴信. 2015. 豬FSP27基因過表達(dá)脂肪細(xì)胞系的構(gòu)建與驗(yàn)證[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，30（4）：588-593. [Pan H B，Sun Z W，Li C Y，Zhao S M，Huang Y，Yang M H，Gao S Z，Qin G X. 2015. Establishment and verification of porcine FSP27 gene overexpression preadipocyte[J]. Journal of Yunnan Agricultural University，30（4）：588-593.]

潘洪彬，趙素梅，孫澤威，龍國輝，高士爭，秦貴信. 2014. 脂肪特異蛋白27（Fsp27）與脂肪代謝[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，45（3）：347-353. [Pan H B，Zhao S M，Sun Z W，Long G H，Gao S Z，Qin G X. 2014. Fat-specific protein 27 （Fsp27） and lipid metabolism[J]. Chinese Journal of Ani-mal and Veterinary Sciences，45（3）：347-353.]

秦立紅，任穎，劉暢，張金玉，張嘉寶，趙志輝. 2010. 牛AR基因5'-UTR SNP分析及與精液品質(zhì)關(guān)系[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，32（3）：335-339. [Qin L H，Ren Y，Liu C，Zhang J Y，Zhang J B，Zhao Z H. 2010. SNP analysis of 5'-UTR of androgen receptor gene and its relationship with semen quality in bulls[J]. Journal of Jilin Agricultural University，32（3）：335-339.]

王琛. 2015. mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能在不同物種中的分布差異研究[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué). [Wang C. 2015. Studies on the difference of mRNA secondary structure and MFE among different species[D]. Yangling：Northwest A & F University.]

王凱，楊青春，陳俊鵬，劉艷芬，劉鈾. 2013. 小尾寒羊在廣東湛江地區(qū)的適應(yīng)性研究[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，44（12）：2094-2097. [Wang K，Yang Q C，Chen J P，Liu Y F，Liu Y. 2013. Adaptability of Small-tail Han Sheep in Zhanjiang，Guangdong Province[J]. Journal of Southern Agriculture，44（12）：2094-2097.]

王世銀，張偉，沈敏，李歡，梁耀偉，楊井泉，高磊，甘尚權(quán)，王新華. 2013. 綿羊X染色體59194976位點(diǎn)多態(tài)分析及其與尾（臀）脂性狀相關(guān)性研究[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，32（5）：575-580. [Wang S Y，Zhang W，Shen M，Li H，Liang Y W，Yang J Q，Gao L，Gan S Q，Wang X H. 2013. Polymorphism analysis of the position（59194976） on sheep X chromosome and its relationship with fat-tail （fat-rump） trait[J]. Genomics and Applied Biology，32（5）：575-580.]

邢光東，王根林，劉慶華，傅澤紅，劉鐵錚. 2008. 鵝催乳素受體基因cDNA 2種新5'-UTR特征分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，24（3）：298-301. [Xing G D，Wang G L，Liu Q H，F(xiàn)u Z H，Liu T Z. 2008. Characterization of two novel 5'-UTRs of gPRLR cDNA[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Scien-ces，24（3）：298-301.]

許祥，董維鵬，張少華，馮晨毅，劉田福，燕炯. 2020. Fsp27基因沉默載體的構(gòu)建及其對(duì)細(xì)胞脂解的影響研究[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，36（1）：88-94. [Xu X，Dong W P，Zhang S H，F(xiàn)eng C Y，Liu T F，Yan J. 2020. Construction of Fsp27 gene silencing vector and its effect on cell lipolysis[J].? Biotechnology Bulletin，36（1）：88-94.]

張偉，蔣曙光，沈敏，趙偉利，許瑞霞，宋廣超，劉守仁，王新華，甘尚權(quán). 2014. 綿羊7號(hào)染色體46843356位點(diǎn)多態(tài)性與尾脂沉積相關(guān)性研究[J]. 畜牧與獸醫(yī)，46（4）：25-29. [Zhang W，Jiang S G，Shen M，Zhao W L，Xu R X，Song G C，Liu S R，Wang X H，Gan S Q. 2014. Relationship between the polymorphsim of 46843356 locus on the 7th chromosome and tail fat deposition[J]. Animal Husban-dry & Veterinary Medicine，46（4）：25-29.]

張偉，沈敏，李歡，高磊，梁耀偉，楊井泉，劉守仁，王新華，甘尚權(quán). 2013. 綿羊X染色體59571364與59912586位點(diǎn)在脂尾、瘦尾綿羊群體中的多態(tài)性檢測(cè)及分析[J]. 遺傳，35（12）：1384-1390. [Zhang W，Shen M，Li H，Gao L，Liang Y W，Yang J Q，Liu S R，Wang X H，Gan S Q. 2013. Detection and analysis of polymorphisms of 59571364 and 59912586 loci on X chromosome in fat-tail and thin-tail sheep flocks[J]. Hereditas（Beijing），35（12）：1384-1390.]

張偉，石國慶，鄧雙義，王世銀. 2016. MTNR1A基因Exon II T/C突變與綿羊季節(jié)性繁殖的關(guān)聯(lián)性分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，47（9）：1582-1586. [Zhang W，Shi G Q，Deng S Y，Wang S Y. 2016. Correlation between T/C mutation of MTNR1A gene Exon II and seasonal reproduction of sheep[J]. Journal of Southern Agriculture，47（9）：1582-1586.]

趙倩君，關(guān)偉軍，喬海云，孟詳人，韓建林，李向臣，何曉紅，浦亞斌，馬月輝. 2010. 基于cytb基因探討家綿羊和多角綿羊的系統(tǒng)發(fā)育[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，43（14）：3005-3011. [Zhao Q J，Guan W J，Qiao H Y，Meng X R，Han J L，Li X C，He X H，Pu Y B，Ma Y H. 2010. Phylogenetics of domestic sheep and multi-horned sheep based on cytb gene[J]. Scientia Agricultura Sinica，43（14）：3005-3011.]

鄒輝，瞿秋紅，夏琴，崔悅悅，江雨航，韋玲靜，嚴(yán)雪瑜，蔣欽楊，韋英明. 2019. 努比亞山羊BMPR-IB基因多態(tài)性與其產(chǎn)羔性狀的關(guān)聯(lián)性分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，50（4）：860-866. [Zou H，Qu Q H，Xia Q，Cui Y Y，Jiang Y H，Wei L J，Yan X Y，Jiang Q Y，Wei Y M. 2019. Correlation ana-lysis between Nubian goats BMPR-IB gene polymorphism and its lambing traits[J]. Journal of Southern Agriculture，50（4）：860-866.]

Curi R A，Chardulo L A L，Mason M C，Arrigoni M D B，Silveira A C，de Oliveira H N. 2009. Effect of single nucleotide polymorphisms of CAPN1 and CAST genes on meat traits in Nellore beef cattle（Bos indicus） and in their cro-sses with Bos taurus[J]. Animal Genetics，40（4）：456-462.

Gong J Y，Sun Z Q，Wu L Z，Xu W Y，Schieber N，Xu D J，Shui G H，Yang H Y，Parton R G，Li P. 2011. Fsp27 promotes lipid droplet growth by lipid exchange and transfer at lipid droplet contact sites[J]. The Journal of Cell Bio-logy，195（6）：953-963.

Grahn T H M，Kaur R，Yin J，Schweiger M，Sharma V M，Lee M J，Ido Y，Smas C M，Zechner R，Lass A，Puri V. 2014. Fat-specific protein 27（FSP27） interacts with adipose triglyceride lipase（ATGL） to regulate lipolysis and insulin sensitivity in human adipocytes[J]. The Journal of Biological Chemistry，289（17）：12029-12039.

Nian Z Q，Sun Z Q，Yu L X，Toh S Y，Sang J L，Li P. 2010. Fat-specific protein 27 undergoes ubiquitin-dependent de-gradation regulated by triacylglycerol synthesis and lipid droplet formation[J]. The Journal of Biological Chemistry，285（13）：9604-9615.

Nishino N，Tamori Y，Tateya S，Kaeaguchi T，Shibakusa T，Mizunoya W，Inoue K，Kitazawa R，Kitazawa S，Matsuki Y，Hiramatsu R，Masubuchi S，Omachi A，Kimura K，Saito M，Amo T，Ohta S，Yamaguchi T，Osumi T，Cheng J L，F(xiàn)ujimoto T，Nakao H，Nakao K，Aiba A，Okamura H，F(xiàn)ushiki T，Kasuga M. 2008. Fsp27 contributes to efficient energy storage in murine white adipocytes by promoting the formation of unilocular lipid droplets[J]. Journal of Clinical Investigation，118（8）：2808-2821.

Price A M，Doner N M，Gidda S K，Jambunathan S，James C N，Schami A，Yurchenko O，Mullen R T，Dyer J M，Puri V，Chapman K D. 2019. Mouse fat-specific protein 27 （FSP27） expressed in plant cells localizes to lipid droplets and promotes lipid droplet accumulation and fusion[J]. Biochimie，169：41-53.

Tamori Y，Tateya S，Ijuin T，Nishimoto Y，Nakajima S，Ogawa W. 2016. Negatively-charged residues in the polar carboxy-terminal region in FSP27 are indispensable for expanding lipid droplets[J]. FEBS Letters，590（6）：750-759.

Xu X，Park J G，So J S，Lee A H. 2015. Transcriptional activation of Fsp27 by the liver-enriched transcription factor CREBH promotes lipid droplet growth and hepatic steatosis[J]. Hepatology，61（3）：857-869.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）