龍眼SPS基因克隆及其表達分析

帥良 殷菲朧 廖玲燕 劉云芬 段振華 宋慕波

摘要：【目的】克隆龍眼蔗糖磷酸合成酶基因（DlSPS）并分析其表達特性，為深入探究SPS基因家族成員在植物生長發(fā)育過程中的調(diào)控機制提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳允堼堁蹫椴牧?，利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆DlSPS基因，對其進行生物信息學分析，并用實時熒光定量PCR檢測龍眼不同組織[根、莖、葉、幼果、果皮、花、熟果（果肉和果皮）]的相對表達量;測定分析果實發(fā)育過程中蔗糖含量、SPS活性及DlSPS基因表達的相關(guān)性?！窘Y(jié)果】克隆獲得的DlSPS基因（GenBank登錄號為KP769779）cDNA全長3504 bp，編碼1057個氨基酸殘基，其編碼蛋白分子量118.38 kD，理論等電點6.09，脂溶指數(shù)85.53，不穩(wěn)定系數(shù)43.69，親/疏水性平均值-0.412，為不穩(wěn)定的親水蛋白。DlSPS蛋白與溫州蜜桔（BAA23213.1）SPS蛋白同源性最高，聚在同一小分支上，表明二者親緣關(guān)系較近。DlSPS蛋白二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋占35.0%，延伸鏈占13.8%，無規(guī)則卷曲占51.2%，與其三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果相符。DlSPS基因在不同組織中均有表達，但表達量存在明顯差異，其中在葉中的表達量顯著高于其他組織（P<0.05，下同），其次是在幼果和花中的表達量，在根、果肉、果皮和莖中的表達量較低。龍眼果實發(fā)育過程中，蔗糖含量和SPS活性均呈先上升后下降的趨勢，但蔗糖含量在謝花后101 d達最大值，而SPS活性在謝花后94 d活性達最大值，說明SPS活性與蔗糖積累具有一定的相關(guān)性。DlSPS基因的表達量隨著果實發(fā)育呈略微下降—大幅上升—略微下降的變化趨勢，在謝花后101 d表達量達到最大值，此時蔗糖含量也達最大值?！窘Y(jié)論】SPS在龍眼不同組織生長發(fā)育過程中對蔗糖積累發(fā)揮重要作用，尤其是對葉片和果實中蔗糖積累發(fā)揮關(guān)鍵作用。

關(guān)鍵詞： 龍眼;蔗糖磷酸合成酶（SPS）;基因克隆;表達分析;蔗糖含量;酶活性

中圖分類號： S667.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）07-1529-08

Abstract：【Objective】To explore the expression characteristics of sucrose phosphate synthase gene（DlSPS） of longan， which provided a theoretical basis for further exploring the regulatory mechanism of SPS gene family members du-ring longan growth and development. 【Method】Using Shixia longan as experimental material， DlSPS gene was cloned by RT-PCR combined with RACE，and bioinformatics analysis was carried out. The relative expression of different longan tissues[root， stem， leaf， young fruit， pericarp， flower and ripe fruit（pulp and pericarp）] was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The correlation among sucrose content，SPS activity and DlSPS gene expression during fruit development was measured and analyzed. 【Result】The full length cDNA of DlSPS gene（GenBank number：KP769779） was 3504 bp， encoding 1057 amino acids residues， protein molecular weight 118.38 kD， theoretical isoelectric point 6.09， lipophilic index 85.53， instability coefficient 43.69， hydrophilic/hydrophobic average -0.412， which was an unstable hydrophilic protein. The amino acid sequence of DlSPS protein had the highest homology with SPS protein of Citrus unshiu （BAA23213.1）， and they were clustered on the same small branch， indicating that they were closely related to each other. In the secondary structure of DlSPS protein， α-helix accounted for 35.0%， extension chain accounted for 13.8%， and irregular curl accounted for 51.2%， which was consistent with the predicted results of the tertiary structure. DlSPS gene was expressed in different tissues， but the expression level was different， in which the expression in leaves was significantly higher than that in other tissues（P<0.05， the same below）， followed by the expression in young fruit and flower， and lower in root， pulp， pericarp and stem. During longan fruit development， sucrose content and SPS activity increased at first and then decreased， but sucrose content reached the maximum at 101 d after flowering， while SPS activity reached the maximum at 94 d after flowering， indicating that there was a certain correlation between SPS activity and sucrose accu-mulation. The expression of DlSPS gene decreased slightly，increased sharply then decreased slightly with the development of fruit， and reached the highest value at 101 d after flowering， and the sucrose content also reached the maximum value. 【Conclusion】SPS plays a key role in sucrose accumulation during longan fruit development， especially in leaves and fruits.

Key words： longan; sucrose phosphate synthase（SPS）; gene cloning; expression analysis; sucrose content; enzyme activity

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31860457）; Guangxi Natural Science Foundation of China（2018GXNSFBA281118，2017GXNSFAA198082）

0 引言

【研究意義】龍眼（Dimocarpus longan Lour.）為無患子科（Sapindaceae）龍眼屬（Dimocarpus）植物，是我國南方名特優(yōu)水果之一，屬于糖直接積累型果實，發(fā)育過程中果實假種皮僅有極少數(shù)的淀粉積累，成熟時以可溶性糖（包括蔗糖、葡萄糖和果糖）的形式貯藏于液泡中（劉麗琴等，2015;帥良等，2015，2016a）。蔗糖不僅是植物體內(nèi)光合作用的主要產(chǎn)物，也是果實糖類的主要組分，其合成代謝過程中最關(guān)鍵的限速酶是蔗糖磷酸合成酶（Sucrose phosphate synthase，SPS）（黃堂偉等，2016;葉紅霞等，2019），該酶在果實發(fā)育和采后均控制蔗糖合成（王麗娟等，2013）。果實糖含量變化不僅影響其品質(zhì)還會影響貯藏壽命（張明方，2003）。因此，克隆龍眼SPS基因（DlSPS）并分析其表達特性，以期深入探究SPS在龍眼蔗糖代謝中的作用機制，對提高其果實品質(zhì)和貯藏壽命具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】SPS廣泛存在于高等植物的葉片、果實、貯藏塊根、塊莖等組織中，是一種可溶性酶，屬低豐度蛋白（劉凌霄等，2005;王旭明等，2018），其催化6-磷酸果糖（Fructose-6-P）和尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）生成6-磷酸蔗糖（Sucrose-6-P）和鳥嘌呤核糖核苷酸（UDP），進而控制植物體內(nèi)的蔗糖合成和轉(zhuǎn)化（胡瑞芳等，2012;趙令敏等，2019）。Langenk?mper等（2002）對不同物種SPS基因全長序列和保守序列進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SPS基因可分為A、B和C 3個家族。Castleden等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，單子葉植物SPS基因可分為A、B、C、DIII和DIV 5個家族，而雙子葉植物至少有A、B和C 3個家族。目前已從玉米（Worrell et al.，1991）、柑橘（Komatsu et al.，1996）、水稻（Valdez-Alarcón et al.，1996）、甜瓜（于喜艷等，2007）、甘蔗（黃東亮等，2013）、枸杞（王麗娟等，2013）和木薯（黃堂偉等，2016）等多個物種中克隆得到SPS基因。研究發(fā)現(xiàn)，SPS與果實中蔗糖的積累、果實品質(zhì)形成及成熟衰老密切相關(guān)，且轉(zhuǎn)SPS基因的植物蔗糖含量均明顯提高，果實風味品質(zhì)也有所提升（張明方和李志凌，2002;李雯等，2005）?！颈狙芯壳腥朦c】目前，有關(guān)龍眼SPS基因克隆及表達分析的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以石硤龍眼為材料，利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆DlSPS基因，對其進行生物信息學分析，并用實時熒光定量PCR檢測其在龍眼不同組織中的相對表達量，測定分析果實發(fā)育過程中蔗糖含量、SPS活性和DlSPS基因表達的相關(guān)性，為深入探究SPS基因家族成員在植物生長發(fā)育過程中的調(diào)控機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 植物材料 以石硤龍眼為試料，自謝花59 d后每隔14 d摘取不同發(fā)育階段龍眼果實，每次取20個果實，用于研究不同發(fā)育階段龍眼果實DlSPS基因表達變化、SPS活性與蔗糖含量間的關(guān)系。同時，采集龍眼謝花后30 d根、莖、葉、幼果、花及熟果（謝花后110 d成熟龍眼果實），立即運回實驗室，從中選取發(fā)育正常、外觀良好的樣品作為試驗材料，其中，熟果的果肉和果皮分開。各材料分別取樣20個，用于組織差異表達分析。上述采集的樣品于液氮中速凍，置于-80 ℃超低溫冰箱中凍存。

1. 1. 2 主要試劑 RNA提取試劑盒購自北京華越洋生物科技有限公司;大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、PCR Amplification Kit、pMD20-T Vector Kit、3'-Full RACE Core Set Ver.2.0、Gel DNA Purification Kit Ver2.0購自寶生物工程（大連）有限公司;M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自美國Life公司;實時熒光定量PCR試劑SYBR Green Master購自德國Roche公司。

1. 1. 3 主要儀器設備 5810D型臺式高速離心機（德國Eppendorf公司）、BS224S型電子分析天平（德國Sartorious公司）、PTC-200型PCR儀（美國MJ Research公司）、羅氏LightCycler 480熒光定量PCR儀（德國Roche公司）和Agilent 1200LC型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 總RNA提取與cDNA第一鏈合成 使用RNA提取試劑盒提取龍眼果實總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。以總RNA為模板，按M-MLV反轉(zhuǎn)錄合成試劑盒說明合成cDNA第一鏈，于-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 基因克隆 根據(jù)GenBank上已發(fā)表的其他物種中性轉(zhuǎn)化酶基因序列，利用Primer Premier 5.0設計PCR引物DlSPS-For和DlSPS-Rev（表1）。以cDNA為模板，PCR擴增DlSPS基因的中間片段，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段，切膠回收目的片段，連接至pMD20-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，通過PCR鑒定出陽性克隆，將其送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。根據(jù)擴增獲得的片段序列，利用Primer Premier 5.0，按照3'-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒要求設計3'-RACE引物（DlSPS-3'RACE Outer和DlSPS-3'RACE Inner）（表1），按照Clontech SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒要求設計5'-RACE引物（DlSPS-5'RACE）（表1），嚴格按照上述兩種試劑盒說明進行PCR擴增，切膠回收目的片段，后續(xù)連接、轉(zhuǎn)化、鑒定和測序同上。

利用ContigExpress將上述PCR擴增獲得的DlSPS基因中間片段、5'末端和3'末端cDNA序列進行拼接獲得DlSPS基因cDNA全長序列，使用NCBI數(shù)據(jù)庫的ORF Finder查找其開放閱讀柜（ORF），設計簡并引物DlSPS-ORF-For和DlSPS-ORF-Rev（表1）進行PCR擴增，以確定所拼接的序列是否為目的基因序列（帥良等，2017）。

1. 2. 3 生物信息學分析 參照帥良等（2017）的方法進行生物信息學分析。使用NCBI數(shù)據(jù)庫的ORF Finder查找基因的ORF，并使用SIB的Translate tool進行氨基酸序列翻譯。蛋白的理化性質(zhì)采用ProtParam tool進行預測;使用NCBI數(shù)據(jù)庫的BLASTn和BLASTx對氨基酸序列進行比對分析;使用Clustal X 1.83進行蛋白氨基酸序列同源性及序列多重比較分析;使用PredictProtein對蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預測;使用SWISS-MODEL Workspace預測蛋白三級結(jié)構(gòu);運用MEGA 5.0中的Neighbor-joining（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1. 2. 4 實時熒光定量PCR檢測 參照Shuai等（2016）和Luo等（2019）的方法，以DlGAPDH基因作為內(nèi)參，實時熒光定量PCR檢測DlSPS基因的表達情況。相對表達量計算采用2-△△Ct法，由Roche Lightcycler? 480系統(tǒng)自動分析得出結(jié)果。

1. 2. 5 果實蔗糖含量測定 使用高效液相色譜法測定龍眼果實蔗糖含量（帥良等，2016b）。設3個重復，取平均值。

1. 2. 6 SPS活性測定 參照帥良等（2015）的方法提取新鮮果實中SPS，并參照趙智中等（2001）的方法測定SPS活性。

1. 3 數(shù)據(jù)處理與作圖

使用Excel 2013進行數(shù)據(jù)處理及分析，使用Origin 8.5作圖，并使用Adobe Illustrator CS6進行圖形美化及編輯。

2 結(jié)果與分析

2. 1 DlSPS基因克隆結(jié)果

如圖1-A所示，DlSPS基因中間片段的PCR擴增產(chǎn)物長度約850 bp，與預期結(jié)果基本相符。測序結(jié)果顯示，該片段長度為870 bp，經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)，確定為目的片段，即DlSPS基因的中間片段。利用3'-RACE引物擴增獲得長度為2492 bp的片段（圖1-B）;利用5'-RACE引物擴增獲得長度為800 bp的片段（圖1-C）。將上述所獲得的中間片段、5'末端和3'末端cDNA序列進行拼接，獲得DlSPS基因cDNA全長序列，經(jīng)ORF Finder分析發(fā)現(xiàn)，該序列包含SPS基因的完整ORF序列。根據(jù)其設計ORF序列引物，PCR擴增獲得一條長度約3100 bp的片段（圖1-D）。將其測序結(jié)果進行BLAST比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該片段的ORF序列正確，表明成功獲得DlSPS基因cDNA全長序列。

2. 2 DlSPS基因的核苷酸序列分析結(jié)果及基因家族鑒定

DlSPS基因的GenBank登錄號為KP769779，cDNA序列全長3504 bp，編碼1057個氨基酸殘基，其中，5'端非翻譯區(qū)59 bp，3'端非翻譯區(qū)271 bp，Ploy A尾巴為10 bp。通過不同物種的SPS基因核苷酸序列多重比對發(fā)現(xiàn)，DlSPS基因與溫州蜜桔SPS基因（AB005023.1）同源性最高，為86%。運用Pfam對DlSPS蛋白和擬南芥A、B和C 3個家族成員AtSPSA1（At5g20280）、AtSPSB（At1g04920）和AtSPSC（At4g10120）蛋白的氨基酸序列進行結(jié)構(gòu)域預測分析，結(jié)果（圖2）顯示，DlSPS、AtSPSB和AtSPSC蛋白均具有Glycos_transf_1（糖基轉(zhuǎn)移酶組1）、S6PP（蔗糖-6F-磷酸磷酸水解酶）和Sucrose_synth（蔗糖合酶）3個結(jié)構(gòu)域，而AtSPSA1蛋白只含有S6PP和Glycos-transt-1 2個結(jié)構(gòu)域;DlSPS與AtSPSA1蛋白的S6PP結(jié)構(gòu)域均具有較長尾鏈的氨基酸序列，而AtSPSC蛋白S6PP結(jié)構(gòu)域未含有較長尾鏈的氨基酸序列，故推測DlSPS基因?qū)儆贐家族基因。

2. 3 DlSPS蛋白理化性質(zhì)預測分析結(jié)果

2. 3. 1 DlSPS蛋白親/疏水性預測預測結(jié)果 使用ProtScale預測DlSPS蛋白的親/疏水性，結(jié)果（圖3）顯示，DlSPS蛋白分子量118.38 kD，理論等電點6.09，脂溶指數(shù)85.53，不穩(wěn)定系數(shù)43.69，為不穩(wěn)定蛋白，最大親水性為-2.542、最大疏水性為1.432，親/疏水性平均值為-0.412，說明親水性氨基酸數(shù)量明顯高于疏水性氨基酸數(shù)量，故為親水蛋白。

2. 3. 2 系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結(jié)果 從NCBI數(shù)據(jù)庫搜索獲得19種作物的SPS蛋白氨基酸序列，并與DlSPS蛋白進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析，結(jié)果（圖4）顯示，DlSPS蛋白與溫州蜜桔（Citrus unshiu，BAA23213.1）SPS蛋白同源性最高，聚在同一小分支上，表明二者親緣關(guān)系較近。

2. 3. 3 DlSPS蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)預測 DlSPS蛋白二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果顯示，α-螺旋占35.0%，延伸鏈占13.8%，無規(guī)則卷曲占51.2%。使用SWISS-MODEL Workspace預測DlSPS蛋白三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖5）顯示，DlSPS蛋白三級結(jié)構(gòu)蛋白與二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果相符。

2. 4 DlSPS基因組織表達特性分析結(jié)果

由圖6可知，DlSPS基因在不同組織中均有表達，但表達量存在明顯差異，其中在葉中的表達量最高，顯著高于其他組織（P<0.05，下同），其次在幼果和花中的表達量，二者也存在顯著差異，在根、果肉和果皮的表達量無顯著差異（P>0.05，下同），但顯著高于莖中的表達量，推測DlSPS基因參與龍眼不同組織的生長發(fā)育和代謝過程，但在葉和幼果中對蔗糖積累發(fā)揮的重要作用更加明顯，其原因是葉片為光合作用下蔗糖合成代謝最旺盛的部位，而果實作為庫器官，是貯藏蔗糖的主要場所，因此，葉片和幼果中SPS基因的表達量相對較高。

2. 5 龍眼果實蔗糖含量與SPS的相關(guān)性分析結(jié)果

由圖7可知，龍眼果實發(fā)育過程中蔗糖含量和SPS活性均呈先上升后下降的趨勢，但蔗糖含量在謝花后101 d達最大值，為82.76 mg/g，而SPS活性在謝花后94 d活性達最大值，為49.51 μmol/（g·h），說明SPS活性與蔗糖的積累具有一定的相關(guān)性，推測SPS可調(diào)控龍眼果實中蔗糖含量（圖7）。DlSPS基因的表達量隨著果實發(fā)育呈略微下降—大幅上升—略微下降的變化趨勢，在謝花后101 d表達量達最大值，此時蔗糖含量也達最大值（圖8），表明DlSPS基因可調(diào)控龍眼果實蔗糖合成。綜上所述，在龍眼果實發(fā)育過程中，SPS對蔗糖的積累發(fā)揮重要作用。

3 討論

蔗糖是植物體內(nèi)光合作用的主要產(chǎn)物和果實糖分的主要成分，主要以碳水化合物的形式運輸（帥良等，2016a）。SPS是蔗糖代謝過程中最重要的限速酶，近年來從分子水平探究其在蔗糖代謝中的調(diào)控機制已成為研究熱點。Im（2004）研究表明，植物SPS基因主要在葉片中表達，在其他非光合組織中也有表達，但表達量較低。陳忠良等（2019）研究表明，甘蔗的高、低糖基因型與葉片蔗糖代謝相關(guān)酶活性密切相關(guān)，并影響糖分積累;與低糖品種相比，高糖品種甘蔗葉片的葉綠素含量、SPS基因表達量、糖分含量及蔗糖代謝相關(guān)酶活性相對較高，表明高糖品種甘蔗葉片蔗糖代謝水平更活躍。本研究結(jié)果（即DlSPS基因在龍眼葉中表達量顯著高于其他組織）與上述前人研究結(jié)果相似，推測其原因是葉片是蔗糖合成代謝最旺盛的部位。Gnansounou等（2005）研究表明，甜高粱莖稈蔗糖含量與葉片SPS蛋白表達的相關(guān)系數(shù)為0.895，與莖稈SPS蛋白的表達相關(guān)系數(shù)為0.781。本研究也發(fā)現(xiàn)，DlSPS基因在不同組織中均有表達，其中在葉、幼果和花中表達較高。可見，SPS在植物生長發(fā)育過程中對蔗糖積累發(fā)揮重要作用。此外，楊明等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，隨著高粱的生長發(fā)育，SPS-A基因在莖稈中的表達不斷升高，與蔗糖含量變化趨勢一致;在生長后期，甜高粱莖稈中SPS基因表達量明顯高于普通高粱，說明SPS基因高效表達能明顯提高蔗糖含量，這與甜高粱蔗糖高效積累密切相關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)，龍眼果實發(fā)育過程中蔗糖含量和SPS活性均呈先上升后下降的趨勢，說明SPS活性與蔗糖積累具有一定的相關(guān)性;DlSPS基因的表達量隨著果實發(fā)育呈略微下降—大幅上升—略微下降的變化趨勢，在謝花后101 d表達量達最大值，此時蔗糖含量也達最大值，表明在龍眼果實發(fā)育過程中SPS對蔗糖的積累發(fā)揮重要作用。今后通過蛋白質(zhì)免疫印跡和酵母雙雜交等技術(shù)手段，尋找龍眼果實中SPS蛋白的上、下游蛋白，可進一步了解DlSPS基因的調(diào)控機制，并尋找可調(diào)控其表達的方法進行人為調(diào)控龍眼果實的糖代謝，以便于龍眼采摘、貯藏及加工。

4 結(jié)論

SPS在龍眼不同組織生長發(fā)育過程中對蔗糖積累發(fā)揮重要作用，尤其是對葉片和果實中蔗糖積累發(fā)揮關(guān)鍵作用。

參考文獻：

陳忠良，秦翠鮮，桂意云，廖芬，汪淼，王震，龍明華，黃東亮. 2020. 生長前期甘蔗葉片糖分含量及蔗糖磷酸合成酶基因表達分析[J]. 分子植物育種，18（13）：4229-4235. [Chen Z L，Qin C X，Gui Y Y，Liao F，Wang M，Wang Z，Long M H，Huang D L. 2020. Characterization of sugar content and SPS expression parttern in leaves at the early growth stage of sugarcane[J]. Molecular Plant Breeding，18（13）：4229-4235.]

胡瑞芳，姜慧，李玥瑩. 2012. 蔗糖代謝相關(guān)酶的研究進展[J]. 北方園藝，（1）：167-170. [Hu R F，Jiang H，Li Y Y. 2012. Research progress of enzymes related to sucrose metabolism[J]. Northern Horticulture，（1）：167-170.]

黃東亮，秦翠鮮，陳忠良，桂意云，李雙喜，汪淼，廖青，李楊瑞. 2013. 甘蔗B家族蔗糖磷酸合成酶基因SofSPSB的克隆及原核表達[J]. 南方農(nóng)業(yè)學報，44（4）：545-551. [Huang D L，Qin C X，Chen Z L，Gui Y Y，Li S X，Wang M，Liao Q，Li Y R. 2013. Cloning and prokaryotic expression of sucrose phosphate synthase gene（SofSPSB） in sugarcane[J]. Journal of Southern Agriculture，44（4）：545-551.]

黃堂偉，羅興錄，單忠英，朱艷梅. 2016. 木薯蔗糖磷酸合成酶基因克隆及組織表達分析[J]. 福建農(nóng)業(yè)學報，31（12）：1273-1279. [Huang T W，Luo X L，Shan Z Y，Zhu Y M. 2016. Cloning and tissue expressions of sucrose phosphate synthase gene in cassava[J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences，31（12）：1273-1279.]

李雯，邵遠志，陳維信. 2005. 蔗糖磷酸合成酶（SPS）與果實品質(zhì)及成熟衰老的研究進展[J]. 西北植物學報，（11）：202-206. [Li W，Shao Y Z，Chen W X. 2005. Research advances in the relationships of sucrose phosphate synthase（SPS） with fruit quality and maturity and senescence[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，（11）：202-206.]

劉麗琴，李偉才，舒波，魏永贊，武紅霞，石勝友. 2015. 蔗糖代謝相關(guān)酶在‘石硤龍眼假種皮糖積累中的作用[J]. 果樹學報，32（4）：653-657. [Liu L Q，Li W C，Shu B，Wei Y Z，Wu H X，Shi S Y. 2015. Role of sucrose metabolism related enzymes in accumulation of sugar in‘Shixiaof Dimocarpus longan Lour.[J]. Journal of Fruit Science，32（4）：653-657.]

劉凌霄，沈法富，盧合全，韓慶點，劉云國. 2005. 蔗糖代謝中蔗糖磷酸合成酶（SPS）的研究進展[J]. 分子植物育種，（2）：275-281. [Liu L X，Shen F F，Lu H Q，Han Q D，Liu Y G. 2005. Research advance on sucrose phosphate synthase in sucrose metabolism[J]. Molecular Plant Bree-ding，（2）：275-281.]

帥良，谷李桃，劉文浩，韓冬梅，吳振先. 2016a. 不同龍眼品種果實退糖特性分析[J]. 熱帶作物學報，37（10）：1900-1907. [Shuai L，Gu L T，Liu W H，Han D M，Wu Z X. 2016a. Characteristic analysis of sugar returning in the fruit of different longan cultivars[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，37（10）：1900-1907.]

帥良，錢盼紅，劉文浩，韓冬梅，吳振先. 2016b. 不同龍眼品種果實成熟時糖含量及其特征研究[J]. 熱帶作物學報，37（5）：915-921.[Shuai L，Qian P H，Liu W H，Han D M，Wu Z X. 2016b. Sugar contents and composition in the mature fruit of different longan cultivars[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，37（5）：915-921.]

帥良，廖玲燕，韓冬梅，吳振先. 2017. 龍眼中性轉(zhuǎn)化酶基因（DlNI）的克隆及分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學報，30（10）：2202-2209. [Shuai L，Liao L Y，Han D M，Wu Z X. 2017. Cloning and sequence analysis of neutral invertase gene（DlNI） from longan fruit[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，30（10）：2202-2209.]

帥良，薛曉清，牛佳佳，顧渝娟，韓冬梅，吳振先. 2015. 龍眼果實發(fā)育過程中果糖激酶活性及其基因表達分析[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學學報，36（5）：99-104. [Shuai L，Xue X Q，Niu J J，Gu Y J，Han D M，Wu Z X. 2015. Analyses of the fructokinase activity and its gene expression during the development of longan fruits[J]. Journal of South China Agricultural University，36（5）：99-104.]

王麗娟，丁向真，王彥才，李翔. 2013. 枸杞蔗糖磷酸合成酶基因的克隆及組織表達分析[J]. 西北植物學報，33（8）：1516-1520.[Wang L J，Ding X Z，Wang Y C，Li X. 2013. Cloning and tissue expression analysis of sucrose phosphate synthase gene from Lycium barbarum L.[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，33（8）：1516-1520.]

王旭明，趙夏夏，陳景陽，龔茂健，楊善，謝平，莫俊杰，黃永相，葉昌輝，周鴻凱. 2018. 鹽脅迫下水稻孕穗期SS和SPS活性與糖積累的響應及其相關(guān)性分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，34（3）：481-486. [Wang X M，Zhao X X，Chen J Y，Gong M J，Yang S，Xie P，Mo J J，Huang Y X，Ye C H，Zhou H K. 2018. The response and correlations between carbohydrate accumulation and activities of SPS，SS at booting stage of rice under salt stress[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，34（3）：481-486.]

楊明，劉麗娟，李莉云，王博，常金華，劉國振. 2009. 甜高粱蔗糖積累與莖稈中SPS表達的相關(guān)性研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，42（1）：85-92. [Yang M，Liu L J，Li L Y，Wang B，Chang J H，Liu G Z. 2009. Correlation analysis of sugar accumulation and SPS expression in sweet sorghum（Sorghum bicolor L. Moench） stems[J]. Scientia Agricultura Sinica，42（1）：85-92.]

葉紅霞，呂律，王同林，海睿，汪炳良. 2019. 不同變種甜瓜糖分積累及蔗糖代謝酶活性動態(tài)變化[J]. 核農(nóng)學報，33（10）：1959-1966. [Ye H X，Lü L，Wang T L，Hai R，Wang B L. 2019. Dynamic changes of sugar accumulation and sucrose metabolic enzymes activity during fruit growth and maturation in different varieties of melon（Cucumis melo L.）[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences，33（10）：1959-1966.]

于喜艷，樊繼德，何啟偉. 2007. 甜瓜果實蔗糖磷酸合成酶基因cDNA片段的克隆及表達分析[J]. 園藝學報，34（1）：205-208. [Yu X Y，F(xiàn)an J D，He Q W. 2007. Cloning and expression analysis of a sucrose phosphate synthase cDNA fragment in melon fruit[J]. Acta Horticulturae Sinica，34（1）：205-208.]

張明方，李志凌，陳昆松，錢瓊秋，張上隆. 2003. 網(wǎng)紋甜瓜發(fā)育果實糖分積累與蔗糖代謝參與酶的關(guān)系[J]. 植物生理與分子生物學學報，29（5）：455-462. [Zhang M F，Li Z L，Chen K S，Qian Q Q，Zhang S L. 2003. The relationship between sugar accumulation and enzymes rela-ted to sucrose metabolism in developing fruits of muskmelon[J]. Acta Photophysiologica Sinica，29（5）：455-462.]

張明方，李志凌. 2002. 高等植物中與蔗糖代謝相關(guān)的酶[J]. 植物生理學報，38（3）：289-295. [Zhang M F，Li Z L. 2002. Sucrose-metabolizing enzymes in higher plants[J]. Plant Physiology Communications，38（3）：289-295.]

趙令敏，邵盈，張艷芳，敖蘭吉亞，季祥，蘇彩霞，霍秀文. 2019. 山藥塊莖膨大期淀粉合成關(guān)鍵酶活性及調(diào)控基因的表達分析[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學學報，53（6）：847-854. [Zhao L M，Shao Y，Zhang Y F，Aolan J Y，Ji X，Su C X，Huo X W. 2019. Analysis of key enzyme activity and gene expression in starch synthesis during tuber expansion of yam[J]. Journal of Henan Agricultural University，53（6）：847-854.]

趙智中，張上隆，徐昌杰，陳昆松，劉拴桃. 2001. 蔗糖代謝相關(guān)酶在溫州蜜柑果實糖積累中的作用[J]. 園藝學報，28（2）：112-118. [Zhao Z Z，Zhang S L，Xu C J，Chen K S，Liu S T. 2001. Role of enzymes related to sucrose meta-bolism in sugar accumulation of Wenzhou tangerine fruit [J]. Acta Horticulturae Sinica，28（2）：112-118.]

Castleden K C，Naohiro A，Gillespie V J，MacRae E A，Quick P W，Buchner P，F(xiàn)oyer C H，F(xiàn)urbank R T，Lunn J E. 2004. Evolution and function of the sucrose-phosphate synthase gene families in wheat and other grasses[J]. Plant Physiology，135（3）：1753-1764.

Gnansounou E，Dauriat A，Wyman C E. 2005. Refining sweet sorghum to ethanol and sugar：Economic trade-offs in the context of North China[J]. Bioresource Technology，96（9）：985-1002.

Im K H. 2004. Expression of sucrose-phosphate synthase（SPS） in non-photosynthetic tissues of maize[J]. Molecules and Cells，17（3）：404-409.

Komatsu A，Takanokura Y，Omura M，Akihama T. 1996. Cloning and molecular analysis of cDNAs encoding three sucrose phosphate synthase isoforms from a citrus fruit（Citrus unshiu Marc.）[J]. Molecular & General Genetics，252（3）：346-351.

Langenk?mper G，F(xiàn)ung R W M，Newcomb R D，Atkinson R G，Gardner R C，MacRae E A. 2002. Sucrose phosphate synthase genes in plants belong to three different families[J]. Journal of Molecular Evolution，54（3）：322-332.

Luo T，Shuai L，Liao L Y，Li J，Duan Z H，Guo X M，Han D，Wu Z X. 2019. Soluble acid invertases act as key factors influencing the sucrose/hexose ratio and sugar receding in longan（Dimocarpus longan Lour.） Pulp[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，67（1）：352-363.

Shuai L，Li J，Niu J J，Qian P H，Liu W H，Xue X Q，Han D M，Wu Z X. 2016. Sucrose-metabolizing enzymes and their genes in the arils of two Dimocarpus longan cultivars[J]. Biologia Plantarum，60（4）：741-748.

Valdez-Alarcón J J，F(xiàn)errando M，Salerno G，Jimenez-Moraila B，Herrera-Estrella L. 1996. Characterization of a rice sucrose-phosphate synthase-encoding gene[J]. Gene，170（2）：217-222.

Worrell A C，Bruneau J M，Summerfelt K，Boersig M，Voelker T A. 1991. Expression of a maize sucrose phosphate synthase in tomato alters leaf carbohydrate partitioning[J]. The Plant Cell，3（10）：1121-1130.

（責任編輯 陳 燕）