響應(yīng)面法優(yōu)化雞小腸黏膜唾液酸提取工藝

胡玥明 孫桂菊 姚宏亮

摘要：[目的]優(yōu)化雞小腸黏膜唾液酸提取工藝，為肉雞加工副產(chǎn)物開發(fā)再利用提供新思路。[方法]以雞小腸黏膜為原料，以唾液酸提取量為指標(biāo)，先采用單因素試驗(yàn)，在幾種提取唾液酸常用酸中篩選最佳酸，進(jìn)一步確定提取酸濃度、提取時間、液料比等3個因素影響唾液酸提取量的優(yōu)化范圍。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，共進(jìn)行17組處理，每組處理3次重復(fù)，考察檸檬酸濃度、提取時間、液料比等3個因素對唾液酸提取量的影響，從而確定雞小腸黏膜唾液酸提取的最佳工藝參數(shù)。[結(jié)果]雞小腸黏膜唾液酸提取最佳工藝參數(shù)為：檸檬酸濃度0.1molL，提取時間4h，液料比32.20：1（mLg）?？紤]實(shí)際操作的簡便，確定唾液酸提取的最佳工藝參數(shù)為：檸檬酸濃度0.1mol.L，提取時間4h，液料比30：1（mL：g＼）。在此條件下，得到的唾液酸提取量為（1010.39土21.87）Hg"g～，與預(yù)測值1025.694g*g無明顯差異。[結(jié)論]通過響應(yīng)面法優(yōu)化了唾液酸提取工藝條件，提高了雞小腸黏膜唾液酸提取量，為雞小腸廢棄物開發(fā)再利用提供新的思路。

關(guān)鍵詞：響應(yīng)面法;雞小腸黏膜;唾液酸

中圖分類號：TS201

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1008-0384（2020）06-0665-08

0引言

[研究意義]肉雞加工過程中，雞腸通常被當(dāng)作加工副產(chǎn)物直接丟棄，不僅形成浪費(fèi)，如處理不當(dāng)，還會造成環(huán)境負(fù)擔(dān)”。唾液酸是一類帶羧基的九碳化合物酰基衍生物的通稱則，其最重要的2種形式為N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-acetylneuraminicacid，Neu 5Ac）和N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（N-gylcolylneuraminicacidNeu5Gc）B。Neu 5Gc分布于豬、牛、羊等紅肉食品中，雞、鴨等禽類及魚類中含有的唾液酸僅為Neu 5Ac研究證實(shí)，正常人體內(nèi)含有的唾液酸僅為Neu 5Ac，Neu 5Ac在人體內(nèi)發(fā)揮多種生物學(xué)功能，具有抗病毒、抗炎、提高學(xué)習(xí)記憶能力等多種作用，是對人體有益的唾液酸。人類對紅肉食品的攝入是造成Neu 5Gc在人體內(nèi)蓄積的主要途徑，Neu 5Gc會加快癌癥的進(jìn)程，對人體健康造成有害影響。自然界中，燕窩是Neu 5Ac含量最高的天然物質(zhì)，但燕窩價格高昂，對于大部分人而言，難以負(fù)擔(dān)。因此，尋找安全廉價的唾液酸來源，意義重大。[前人研究進(jìn)展]現(xiàn)階段，對唾液酸的研究多集中于其生物學(xué)功E，研究證實(shí)其在抗病毒、抗炎及促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、提高學(xué)習(xí)記憶能力0-等方面發(fā)揮重要作用。唾液酸的制備方法主要有化學(xué)合成法、酶合成法、微生物發(fā)酵法和天然物提取法。前3種方法具有生產(chǎn)工藝復(fù)雜、經(jīng)濟(jì)成本較高等缺點(diǎn)。從天然原料中提取Neu 5Ac的方法，由于制備原料安全可靠無污染，且能實(shí)現(xiàn)某些物質(zhì)的開發(fā)再利用，從而達(dá)到一定的經(jīng)濟(jì)效益，因此，對此法的研究近年來較為熱門。劉靜波等嗎采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，水解雞蛋殼膜制備唾液酸的最佳工藝;陳璇等酶解豬小腸黏膜肝素加工廢棄物，得到高唾液酸化的黏蛋白;范群艷采用響應(yīng)面法，優(yōu)化微波結(jié)合木瓜蛋白酶提取得到燕窩唾液酸的工藝。[研究切人點(diǎn)]目前，以雞小腸黏膜為原料提取唾液酸尚未見報道。雞小腸黏膜，可作為制備唾液酸的安全廉價來源，從而為雞副產(chǎn)物的開發(fā)再利用提供新的思路。[擬解決的關(guān)鍵問題]本文擬通過單因素試驗(yàn)初步確定提取唾液酸的各因素水平，采用響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得到提取唾液酸的最佳工藝條件，從而為雞小腸黏膜的開發(fā)再利用提供新的方向。

1材料與方法

1.1材料與試劑

雞腸廢棄物，常州立華食品有限公司;唾液酸標(biāo)品，美國sigma公司;乙酸丁酯、丁醇，麥克林中國;三氯甲烷、甲醇、鹽酸、硫酸、三氟乙酸、冰醋酸、檸檬酸、硫酸銅、間苯二酚等均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

SCIENTZ-10N，18ND冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司;紫外分光光度計(jì)，北京萊伯泰科儀器股份有限公司;H2050R臺式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;IMS-20雪花制冰機(jī)，常熟市雪科電器有限公司;LS-1離心濃縮儀，湖南平凡科技有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1原材料的處理將收集到的雞腸廢棄物取小腸部分，勻漿，真空冷凍干燥去除水分。待樣品凍千后，用高速萬能粉碎機(jī)粉碎成粉末，過50目篩，制得雞小腸黏膜凍干粉備用。

1.3.2間苯二酚-鹽酸法測定唾液酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立唾液酸的測定方法主要有間苯二酚鹽酸法、高效液相色譜法等，有研究表明，這2種方法測定的結(jié)果無明顯差異。本研究采取間苯二酚鹽酸法測定唾液酸含量，參考中國藥典三部！唾液酸測定方法，將唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品精確配制成5、10、20、40、60、80、100、1204g-mL的標(biāo)準(zhǔn)液待測液，分別取2mL于10mL試管中，同時用2mL超純水作為空白對照，加人顯色劑（用30%鹽酸溶解3.1mg硫酸銅，2mg.氯化鉻，0.1g間苯二酚，定容到50mL）2mL，振蕩，于沸水浴中加熱微沸15min，立即取出冰浴冷卻到室溫。向每管各加入4mL乙酸丁酯-正丁醇（85：15）萃取劑，旋渦混勻，靜置10min，立即取上層提取液，于586nm處測吸光度。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以唾液酸質(zhì)量濃度（ug*mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3唾液酸提取量的確定準(zhǔn)確稱取0.1g雞小腸黏膜凍干粉，加入體積比2：1：1的氯仿：甲醇：水混合液，旋渦混勻60min，4C15000rmin1混勻10min去除脂肪，取沉淀，分別以一定濃度一定體積的不同酸于80C下提取一定時間，然后立即放入碎冰中冷卻以終止反應(yīng)，4C15000r-min離心10min，取上清，旋千，復(fù)溶，按照1.3.2的方法測定吸光值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算唾液酸提取量。

2.3.3響應(yīng)面優(yōu)化分析等高線和響應(yīng)面圖能反映各個因素之間的交互作用及各因素對響應(yīng)值的影響。圖6是A、B、C任意2個因素與唾液酸提取量之間的三維立體響應(yīng)面圖及其等高線在水平面，上的投影作出的平面圖。響應(yīng)面曲面的坡度能反映各因素及其交互作用對響應(yīng)值影響的程度，曲面的坡度越陡，說明因素間的交互作用越強(qiáng)。等高線的形狀及密度能反映是否存在交互作用，若等高線呈橢圓形，兩因素間存在交互作用;若等高線呈圓形，則不存在交互作用叫。等高線圖表明，檸檬酸濃度與液料比之間，提取時間與液料比之間存在交互作用。這與方差分析的結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了模型的準(zhǔn)確性和可靠性。

2.3.4最佳提取工藝參數(shù)的確定與模型驗(yàn)證根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化分析結(jié)果，得到唾液酸提取的最佳工藝參數(shù)為：檸檬酸濃度0.1molL7'，提取時間4h，液料比32.20：1（mL：g'）時，唾液酸提取量最大，其預(yù)測值為1025.694gg'。為了實(shí)際操作的簡便，將提取工藝參數(shù)調(diào)整為檸檬酸濃度0.1mol：L'，提取時間4h，液料比30：1（mL：g'）。試驗(yàn)重復(fù)3次，3次平行試驗(yàn)結(jié)果為（1010.39土21.87）4g*g～，與預(yù)測值接近，兩者無明顯差異。說明模型的擬合度良子，能準(zhǔn)確預(yù)測唾液酸提取量，對實(shí)際應(yīng)用具有參考價值。

3討論與結(jié)論

雞小腸黏膜唾液酸制備工藝，對肉雞加工廢棄物開發(fā)再利用有重要影響，能實(shí)現(xiàn)一定的經(jīng)濟(jì)效益。研究表明，雞蛋殼膜嗎、燕碎"等天然原料中能提取出唾液酸，尋找制備唾液酸的安全廉價原料來源引起研究者的廣泛關(guān)注。本文以雞小腸黏膜為原材料，以唾液酸提取量為指標(biāo)，優(yōu)化唾液酸提取工藝。酸水解法由于不具有專一性、釋放唾液酸較徹底的優(yōu)點(diǎn)，因此采用酸水解法提取唾液酸。提取酸、酸濃度、提取時間、提取溫度、液料比等均是影響提取量的重要因素。試驗(yàn)結(jié)果顯示，檸檬酸與鹽酸、硫酸提取唾液酸的能力相近。檸檬酸作為常見有機(jī)酸，在提取過程中，沒有像鹽酸、硫酸一樣，由于酸性過強(qiáng)，出現(xiàn)破壞唾液酸結(jié)構(gòu)的情況。因此，提取唾液酸的最佳酸為檸檬酸，與袁玲的研究結(jié)果一致。酸濃度、提取時間、液料比等個因素對唾液酸提取工藝的影響較大，這3個因素影響唾液酸提取量能力大小依次為：液料比》提取時間》檸檬酸濃度。當(dāng)溶劑對唾液酸的溶解達(dá)到飽和時，再增加溶劑的量，唾液酸提取量不會，上H，反而因其他水溶性物質(zhì)的溶解增加，阻礙唾液酸的提取。另外，考慮到節(jié)約溶劑的使用，確定液料比30：1（mL：g）。提取時間過長，唾液酸在長時間的酸性環(huán)境下發(fā)生降解，唾液酸提取量反而下條。從提取工藝簡便的角度出發(fā)，確定提取時間4h。檸檬酸濃度過高，酸性過強(qiáng)，不僅會波壞唾液酸結(jié)構(gòu)，使提取率下降，還會引入更多的檸檬酸雜質(zhì)，因此，確定檸檬酸濃度0.1molL。經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝后，得到的唾液酸含量為（1010.39士21.87）ugg'，與雞蛋殼膜中的提取量相近。雞小腸黏膜作為肉雞加工廢棄物，具有經(jīng)濟(jì)成本低、方便大量收集的優(yōu)點(diǎn)，具有進(jìn)一步開發(fā)利用的價值。

本文通過單因素試驗(yàn)確定檸檬酸為提取唾液酸的最佳用酸，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)，上，采用Design-Expert8.0.6軟件，對檸檬酸濃度、提取時間、液料比三因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上，考慮實(shí)際操作的簡便易行，確定唾液酸提取的最佳工藝條件為：檸檬酸濃度0.1molL，提取時間4h，液料比30：1（mL：g'）。在此條件下，測得唾液酸提取量為（1010.39土21.87）yg'g'，與預(yù)測值基本相符，模型準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際參考價值，為雞小腸黏膜中唾液酸的提取提供了技術(shù)參考，從而為雞腸廢棄物的開發(fā)再利用開辟了新的方向。但雞小腸黏膜唾液酸的純化、結(jié)構(gòu)鑒定等仍需進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：張梅）

胡玥明，孫桂菊，姚宏亮.響應(yīng)面法優(yōu)化雞小腸黏膜唾液酸提取工藝[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2020，35（6）：665-672.