響應(yīng)面法優(yōu)化雪膽多酚提取工藝

周子舜 段柯兆 全瑞蘭

摘要：以雪膽（Hemsleya chinensis）為試驗(yàn)材料，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化的方法，優(yōu)化雪膽多酚的提取工藝條件。以多酚提取率作指標(biāo)，通過Design-Expert 8.0.6軟件，基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，建立雪膽多酚提取率與提取溫度、乙醇濃度、液料比、提取時間4因素3水平的數(shù)學(xué)模型。結(jié)果表明，雪膽多酚提取率模型擬合度較好，顯著性高，優(yōu)化后的最佳提取工藝條件為提取時間59 min、乙醇濃度（V/V）50%、提取溫度74 ℃、液料比16∶1（mL/g），此條件下雪膽多酚提取率為（1.479 6±0.004 1） mg/g。

關(guān)鍵詞：雪膽（Hemsleya chinensis）;多酚;提取;響應(yīng)面法

中圖分類號：R284 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）17-0112-07

Abstract： Taking Hemsleya chinensis as the experimental material， the Box-Behnken central composite design and response surface methodology were used to optimize the extraction conditions of polyphenols from Hemsleya chinensis. The extraction rate of polyphenols was used as index. Based on the results single factor experiments， a mathematical model of 4 factors and 3 levels center combinations was established with the Design-Expert 8.0.6 software on the extraction temperature， ethanol concentration， liquid to material ratio， extraction time. The results showed that the fitting degree of polyphenol extraction rate model was good and significant. The best process parameters were extraction time 59 min， ethanol concentration （V/V） 50 %， extraction temperature 74 ℃， and liquid to material ratio 16∶1（mL/g）. Under these conditions， the extraction rate of polyphenols from H. chinensis was （1.479 6±0.004 1） mg/g.

Key words： Hemsleya chinensis; polyphenols; extraction; response surface methodology

雪膽（Hemsleya chinensis）是葫蘆科雪膽屬植物，是常見的中草藥，主要分布于云南省、四川省、貴州省等地[1，2]。雪膽的主要有效成分有雪膽甲素、雪膽乙素和齊墩果酸等，能清熱解毒和消炎殺菌，并用于治療上呼吸道感染、支氣管炎、細(xì)菌性痢疾、腸炎等疾病[3，4]。多酚類化合物是一類具有多個酚基團(tuán)的次生代謝產(chǎn)物，廣泛分布于植物的皮、根、葉和果肉之中，具有清除自由基等生理功能，除了具有良好的抗氧化功能外，還具有降低血脂肪、增強(qiáng)人體免疫力、防止動脈硬化和血栓形成、促進(jìn)腸胃消化等作用[5-8]，所以含有多酚的植物作為天然抗氧化劑，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域受到廣泛的關(guān)注。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者對雪膽化學(xué)成分、藥理活性和作用機(jī)制等方面進(jìn)行了大量研究，并取得較大進(jìn)展[9，10]，但對雪膽多酚提取工藝的研究未見報道。為進(jìn)一步研究雪膽并有效利用雪膽資源，本研究以雪膽為試驗(yàn)材料優(yōu)化多酚提取工藝，回流提取法是多酚的主要提取方法[11-17]，為有效且充分提取多酚，選用乙醇作為提取溶劑，采用回流提取法提取雪膽多酚，探討利用響應(yīng)面優(yōu)化雪膽多酚的提取工藝，為其開發(fā)利用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料雪膽為葫蘆科雪膽屬雪膽，采自云南柯兆生物科技有限公司種植基地。經(jīng)粉碎過100目篩，密封于干燥器中備用。

福林-酚試劑購自國藥化工集團(tuán)有限公司，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品購自上海源葉生物科技有限公司，無水碳酸鈉購自西隴化工有限公司，無水乙醇購自天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

722N可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司;ISO9001電子天平，北京賽多利斯天平有限公司;DRHH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海雙捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;DC-600高速多功能粉碎機(jī)，浙江武義鼎藏日用金屬制品廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 雪膽多酚的提取 將雪膽塊莖放入粉碎機(jī)磨碎，過100目篩得到樣品置于干燥器備用。稱取4.00 g樣品進(jìn)行回流提取，提取結(jié)束后趁熱過濾，待濾液冷卻至室溫后用提取溶劑定容至100 mL，得雪膽多酚提取液。

1.3.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 根據(jù)Folin-Ciocalte法并稍作修改[18]。稱取0.01 g沒食子酸標(biāo)品溶解于10 mL乙醇中并用去離子水定容至100 mL，得到0.1 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別量取0、2、4、6、8、10 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于100 mL容量瓶中，再加入1 mL 福林-酚試劑，在室溫下反應(yīng)5 min后加入2 mL 10%的碳酸鈉溶液，用去離子水定容，避光反應(yīng)2 h，在765 nm處測定吸光度值，重復(fù)2次取平均值，以沒食子酸濃度和吸光度值分別為橫、縱坐標(biāo)，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計算雪膽提取液中多酚的含量和多酚濃度。

1.3.3 雪膽多酚提取率的計算 將沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用10 mL雪膽多酚提取液替代，按“1.3.2”方法測定吸光度值，雪膽多酚提取液中多酚濃度由沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計算得出，雪膽多酚提取率的計算公式如下：

[多酚提取率（mg/g）=C×Va×VbM×V] ? ? （1）

式中，C表示多酚濃度（mg/mL），Va表示容量瓶量程（mL），Vb表示提取液總體積（mL），M表示樣品質(zhì)量（g），V表示取液量（mL）。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

1）提取時間。為探討提取時間對雪膽多酚提取率的影響，以60%乙醇為提取劑，液料比10∶1（mL/g，下同），70 ℃恒溫水浴的提取條件下分別回流提取30、45、60、75、90 min。

2）提取溫度。為探討提取溫度對雪膽多酚提取率的影響，以60%乙醇為提取劑，液料比10∶1，提取時間60 min，恒溫水浴溫度分別為50、60、70、80、90 ℃的提取條件下回流提取。

3）液料比。為探討液料比對雪膽多酚提取率的影響，以60%乙醇為提取劑，提取時間60 min，70 ℃恒溫水浴，液料比分別為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1的提取條件下回流提取。

4）乙醇濃度。為探討乙醇濃度對雪膽多酚提取率的影響，設(shè)置提取時間60 min，液料比10∶1，乙醇濃度分別為20%、40%、60%、80%、100%，70 ℃恒溫水浴條件下回流提取。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合響應(yīng)面Box-Behnken的設(shè)計方法，以多酚提取率作響應(yīng)值，建立雪膽多酚提取率與提取溫度、液料比、提取時間、乙醇濃度之間的4因素3水平的數(shù)學(xué)模型（表1）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics 20軟件進(jìn)行LSD多重比較和方差分析（P<0.05），并用SigmaPlot 12.5和Design-Expert 8.0.6軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以沒食子酸濃度和吸光度值分別為橫、縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=69.086X+0.008 2，R2=0.999 6。由圖1可見，沒食子酸濃度在0～0.010 mg/mL與吸光度值線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取時間對雪膽多酚提取率的影響 由圖2可知，當(dāng)提取時間為60 min時，雪膽多酚提取率最高。當(dāng)提取時間小于60 min時，過短的提取時間可能會使雪膽多酚提取不完全，但延長提取時間也可能會導(dǎo)致提取液中多酚被氧化，使雪膽多酚提取率降低，故將響應(yīng)面試驗(yàn)的提取時間設(shè)定為45～75 min。

2.2.2 提取溫度對雪膽多酚提取率的影響 由圖3可知，當(dāng)提取溫度為80 ℃時，雪膽多酚提取率最高。當(dāng)提取溫度小于80 ℃時，溫度的升高可能會加快溶劑對雪膽樣品的滲透速度，氫鍵更容易被破壞，因此雪膽多酚提取率呈上升趨勢。當(dāng)溫度大于80 ℃時，高溫可能會引起樣品內(nèi)多酚發(fā)生氧化或降解反應(yīng)，使雪膽多酚提取率降低，故將響應(yīng)面試驗(yàn)提取溫度設(shè)定為60～80 ℃。

2.2.3 液料比對雪膽多酚提取率的影響 由圖4可知，當(dāng)液料比小于15∶1時，雪膽多酚提取率隨著液料比的增加而增大，可能原因是當(dāng)液料比增加后，樣品在溶液中的分散程度增大，增加了接觸面積從而提高提取率。當(dāng)液料比為15∶1時，雪膽多酚提取率達(dá)到最大。當(dāng)液料比達(dá)到15∶1后，溶劑趨于飽和，隨著液料比的增加雪膽多酚提取率反而減少，可能原因是當(dāng)液料比過大時，可溶性蛋白、多糖和果膠等物質(zhì)被提取出，多酚可能被這些物質(zhì)吸附或與之反應(yīng)，使多酚提取率減小，故將響應(yīng)面試驗(yàn)液料比設(shè)定為10∶1～20∶1。

2.2.4 乙醇濃度對雪膽多酚提取率的影響 由圖5可見，當(dāng)乙醇濃度小于40%時，隨著乙醇濃度的增加，雪膽多酚提取率逐漸增大，可能原因是低體積分?jǐn)?shù)乙醇無法有效斷裂多酚與其結(jié)合物之間的氫鍵，不利于多酚的提取。當(dāng)乙醇濃度大于40%時，雪膽多酚提取率隨著乙醇濃度的增加反而減小。當(dāng)乙醇濃度為40%時，雪膽多酚提取率達(dá)到最大，根據(jù)相似相溶原理，可能是由于雪膽多酚的極性與40%乙醇的極性相同，故將響應(yīng)面試驗(yàn)乙醇濃度設(shè)定為40%～80%。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 二次響應(yīng)面回歸模型的建立 根據(jù)Design Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件的分析，得到響應(yīng)面的試驗(yàn)設(shè)計，以雪膽多酚提取率作響應(yīng)值，設(shè)計提取溫度、液料比、提取時間和乙醇濃度4因素3水平的數(shù)學(xué)模型，結(jié)果見表2。

2.3.2 回歸方程及方差分析 對響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果使用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析可得表3，各因素與響應(yīng)值的二次多項(xiàng)式方程為Y=14.25+0.30A+0.39B - 0.15C + 0.48D + 0.25AB - 0.047AC + 0.012AD-0.099BC- 0.17BD + 0.17CD - 0.47A2 - 0.75B2 - 0.92C2 -0.45D2。P水平是檢驗(yàn)回歸系數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)P<0.01 時，回歸方程極顯著;當(dāng)P<0.05 時，回歸方程顯著;當(dāng)P>0.05 時，回歸方程不顯著。

由表3可知，該模型的P值小于0.000 1，模型極顯著，失擬誤差P值等于0.000 1，失擬誤差極顯著，表明模型與實(shí)際情況擬合較好，模型R2=0.957 4表明預(yù)測值和實(shí)測值之間存在高度相關(guān)性，并且能準(zhǔn)確反映試驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響，所以可以使用此回歸方程并預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果。回歸模型的顯著性檢驗(yàn)表明，A、B、D對多酚提取率有極顯著影響（P<0.01），C、AB對多酚提取率有顯著影響（P<0.05），AC、AD、BC、BD、CD對多酚提取率影響不顯著，二次項(xiàng)影響均為極顯著（P<0.01）。提取因素對雪膽多酚提取率的影響大小為：乙醇濃度>液料比>提取溫度>提取時間。

2.3.3 兩因子間交互作用分析 由圖6可知4個因素中任意2個變量在其余變量取零水平時對雪膽多酚提取率的影響，各圖交互作用的趨勢都是先增后減，從各圖的變化幅度及等高線的疏密可以看出，圖a、b、c、e、f的交互作用不顯著。圖d響應(yīng)面的坡度很陡，可以得出提取溫度和液料比的交互影響對多酚提取有顯著影響，從圖d可看出液料比軸的等高線變化稀疏，提取溫度軸的等高線變化密集，液料比變化曲面的變化幅度大于提取溫度，表明液料比變化對多酚提取率的影響大于提取溫度。

2.3.4 最佳工藝條件預(yù)測及驗(yàn)證 通過Design-Expert 8.06軟件分析可得雪膽多酚的最佳提取工藝條件為提取溫度74.04 ℃、乙醇濃度49.6 %、液料比16.4∶1、提取時間59.06 min，此時能夠得到的多酚理論提取率為1.485 3 mg/g。為方便具體操作，將條件修改為提取溫度74℃、乙醇濃度50%、液料比16∶1、提取時間59 min，并測定3次雪膽多酚提取率，所得平均提取率為（1.479 6±0.004 1） mg/g，與雪膽多酚理論提取率1.485 3 mg/g相比誤差小，所建立的回歸模型可靠，最佳提取工藝可行。

3 小結(jié)

多酚提取方法主要包括微波輔助萃取法、超聲波輔助萃取法、酶解提取法和有機(jī)溶劑萃取法等。本研究以乙醇作為提取劑，采用回流提取工藝，以多酚提取率作指標(biāo)，基于單因素（提取溫度、乙醇濃度、液料比和提取時間）試驗(yàn)結(jié)果，采用4因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化雪膽多酚的最佳提取工藝，結(jié)果表明，雪膽多酚提取率模型擬合度很好，雪膽多酚的最佳提取工藝條件為提取溫度74 ℃、乙醇濃度50%、液料比16∶1、提取時間59 min，此條件下雪膽多酚提取率為（1.479 6±0.004 1） mg/g，與雪膽多酚理論提取率1.485 3 mg/g相比誤差小，驗(yàn)證該模型是有效的。提取因素對雪膽多酚提取率的影響大小為：乙醇濃度>液料比>提取溫度>提取時間。

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