改進高效液相色譜法測水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量

朱志強 童文羽 曾智

摘要：孔雀石綠是一種合成的三苯基甲烷類工業(yè)染料，曾被作為殺蟲劑和殺菌劑廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量檢測的國標方法GB/T 20361—2006在多年檢測工作中發(fā)現(xiàn)有操作繁瑣、回收率和精密度較差的缺點。試驗比較了不同提取次數(shù)和凈化次數(shù)對回收率的影響，改進了GB/T 20361—2006的前處理和色譜條件，減少提取次數(shù)和凈化操作，降低了流速。改進后方法檢測限為0.40 μg/kg，回收率提升至81.8%～100.8%，精密度為0.93%～8.32%，均達到并優(yōu)于國標。

關(guān)鍵詞：水產(chǎn)品;孔雀石綠;高效液相色譜法

中圖分類號：TS254.7 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）17-0150-04

Abstract： Malachite green， as a synthetic industrial dye of triphenylmethane， has been widely used in aquaculture as an insecticide and fungicide. GB/T20361—2006 for the detection of malachite green residues in aquatic products was found that had some disadvantages， such as tedious operation， poor recovery and precision during years of testing. The effects of different extraction times and purification times on the recovery rate， and improved the pretreatment and chromatographic conditions of GB/T20361—2006，reducing the number of extractions and purification operations reduces the flow rate of the chromatographic method. The improved method has a detection limit of 0.40 μg/kg， a recovery rate of 81.8%～100.8%， and a precision of 0.93%～8.32%， which all meet and exceed the national standard.

Key words： aquatic products; malachite green; HPLC

孔雀石綠（Malachite green，MG）又名苯胺綠、堿性孔雀石綠、品綠、鹽基塊綠，是一種合成的三苯基甲烷類工業(yè)染料，被廣泛用于制陶業(yè)、紡織業(yè)和皮革業(yè)。在20世紀30年代被廣泛用作水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的殺蟲劑和殺菌劑，用來殺滅體外寄生蟲和魚卵中的霉菌[1]。但研究發(fā)現(xiàn)，MG的三苯甲烷結(jié)構(gòu)可致癌，在魚體脂肪組織中多以隱色孔雀石綠（Leucomalachite green，LMG）（圖1）形態(tài)長期殘留，可通過食物鏈對哺乳動物和人類產(chǎn)生致畸、致癌、致突變等作用[2-4]。2002年MG就被列入《食品動物禁用獸藥及其化合物清單》中，2005年7月7日，原農(nóng)業(yè)部下發(fā)《關(guān)于組織查處孔雀石綠等禁用獸藥的緊急通知》，隨后，原國家質(zhì)檢總局、國家標準委發(fā)布GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》規(guī)定了水產(chǎn)品中MG及LMG的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜和高效液相色譜的測定方法，其中規(guī)定MG在水產(chǎn)品的檢出濃度不得超過1.0 μg/kg。

目前，水產(chǎn)品中MG主流定量方法主要包括液相色譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的優(yōu)點是靈敏度高，缺點易受干擾，對人員和實驗室硬件要求高，檢測費用昂貴。液相色譜法中的GB/T 19857—2005[5]經(jīng)氧化鉛柱后衍生法操作繁瑣，檢出限較高，孔雀石綠（MG）與隱色孔雀石綠（LMG）檢出限均為2 μg/kg，不能滿足檢測要求。GB/T 20361—2006[6]方法檢出限為0.5 μg/kg，定性定量都較為準確，成為使用廣泛的檢測方法。該方法的缺點是操作較為繁瑣，回收率不穩(wěn)定，精密度較低。孫協(xié)軍等[7]、王陳園等[8]改進后前處理步驟還是較為繁瑣，劉少彬等[9]建立了超高效液相色譜法快速測定水產(chǎn)品中的MG和結(jié)晶紫方法，但該法對實驗室硬件要求也較高。為此，本研究圍繞改進現(xiàn)有方法GB/T 20361—2006的不足，通過優(yōu)化前處理的提取、凈化操作，提高回收率和精密度，為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督抽查提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

樣品：草魚、加州鱸魚、對蝦，樣品來源于某基地和市場。

試劑及耗材：MG（99.0%）和LMG（99.6%）標準品購于Dr.Ehrenstorfer公司;酸性氧化鋁及PRS固相萃取柱（3 mL，500 mg，bond Elut）購于安捷倫科技有限公司。分析純酸性氧化鋁、硼氫化鉀、乙腈、乙酸銨、對甲苯磺酸、鹽酸羥胺（氯化羥胺）均購于國藥試劑公司，色譜純乙腈和甲酸購于默克化工技術(shù)（上海）有限公司。

1.2 主要儀器

液相色譜儀為島津LC-20AD高效液相色譜儀，配熒光檢測器RF-20A， LC Solution工作站;Waters e2695高效液相色譜儀，配熒光檢測器2475，Empower 3工作站;色譜柱為Thermo Acclaim C18與安捷倫ZORBAX SB-C18，規(guī)格均為4.6 mm×250 mm，5 μm。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制 分別稱取MG和LMG標準品各0.01 g，用色譜純級乙腈溶解，必要時使用超聲波助融，定容至100 mL棕色容量瓶中，-18 ℃保存，有效期6個月，LMG標準品從固體溶解為液體需要加入極少量硼氫化鉀以防止被氧化為MG，由于硼氫化鉀不溶于純乙腈，因此還需要加入少量超純水。混合標準中間液使用乙腈稀釋并用棕色容量瓶盛裝，有效期3個月，上機使用的標準工作液使用乙腈稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 樣品制備 魚去鱗，沿背脊取可食肌肉部分，蝦去頭、殼，取可食肌肉部分，切為小塊，絞成魚糜或蝦糜，經(jīng)GB/T 19857—2005液質(zhì)法檢測確認陰性，待用。

1.3.3 提取 稱?。?.00±0.01） g魚糜于50 mL離心管中，加入5.00 g酸性氧化鋁和10 mL乙腈，振蕩1 min，超聲5 min，4 500 r/min離心5 min，將上清液倒入250 mL分液漏斗中;離心管中繼續(xù)加入 ? ?10 mL乙腈，3 mL 0.2 mol/L硼氫化鉀，振蕩1 min，超聲5 min，4 500 r/min離心5 min，上清液倒入 ? 250 mL分液漏斗中;離心管中繼續(xù)加入10 mL乙腈、1.5 mL 20%鹽酸羥胺、5 mL 濃度為0.125 mol/L乙酸銨緩沖液、10 mL乙腈，振蕩1 min，超聲5 min， ? 4 500 r/min離心5 min，上清液倒入250 mL分液漏斗中。往分液漏斗中加入3 mL 0.2 mol/L硼氫化鉀、2 mL二甘醇、20 mL二氯甲烷，蓋塞，劇烈振搖1 min，靜置分層，下層液體轉(zhuǎn)移至雞心瓶中，45 ℃旋轉(zhuǎn)減壓蒸餾至近干。

1.3.4 凈化 將PRS柱安裝在固相萃取裝置上，上端連接酸性氧化鋁小柱，下端連接PRS小柱，5 mL乙腈活化。雞心瓶中加入2.5 mL乙腈溶解殘渣，將乙腈轉(zhuǎn)移至萃取小柱上，依次過柱，再用乙腈清洗雞心瓶2次，每次2.5 mL，依次過柱，棄去氧化鋁小柱，在不抽真空的情況下，吹PRS柱至近干，然后加入3 mL等體積混合的乙腈和0.1 mol/L乙酸銨緩沖液洗脫，收集洗脫液，乙腈定容至3.0 mL，過0.45 μm濾膜，供液相色譜測定。

1.3.5 色譜條件 色譜柱Thermo Acclaim C18、安捷倫ZORBAX SB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm;柱溫35 ℃，流動相為乙腈∶0.125 mol/L乙酸銨緩沖液（9.64 g乙酸銨溶于1 L水，乙酸調(diào)pH為4.5）=80∶20，流速1 mL/min，進樣量20 μL，激發(fā)波長265 nm，發(fā)射波長360 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗結(jié)果

在草魚、加州鱸魚、對蝦陰性樣品中分別添加MG和LMG，添加濃度分別為0.5、1.5、2.5 μg/kg，每個添加水平設(shè)6個平行樣。加標后按照“1.3.3”的方法提取、“1.3.4”的方法凈化，在“1.3.5”色譜條件下上機分析，根據(jù)色譜圖各組分的峰面積，計算相應(yīng)加標濃度的平均回收率和相對標準偏差（RSD），加標回收結(jié)果見表1。陰性樣品色譜見圖2，LMG加標色譜見圖3，MG加標色譜見圖4。

配制濃度為1、2、4、16、30、100 μg/L標準工作液，按“1.3.5”色譜條件進樣測定，得到濃度（μg/L）與峰面積線性回歸方程為y=2.977 3×105x+4.375 2×102，R2 =0.999 3，在1～100 μg/L線性良好。按信噪比S/N≥3為檢測限，測得檢測限為0.40 μg/kg。

2.2 前處理優(yōu)化

按照GB/T 19857—2005[5]、GB/T 20361—2006[6]的提取方法稱取5.00 g已絞碎樣品至離心管中，加入提取劑超聲提取后再勻漿提取。但試驗發(fā)現(xiàn)，由于提取劑中主要成分是乙腈，能使樣品中蛋白質(zhì)變性，粘在勻漿機刀頭上，即便多次洗刀頭也很難洗凈，尤其在蛋白質(zhì)含量豐富的蝦樣前處理過程中特別嚴重。多次清洗刀頭、勻漿過程中提取劑飛濺損失，都會嚴重影響回收率[10]。因此，將勻漿提取改為超聲提取。

按照GB/T 20361—2006的方法共提取了4次，提取3次MG和LMG回收率為80%～90%;提取第4次時在液液萃取凈化出現(xiàn)有機相和水相混溶、倒置，造成回收率低，平行極差，回收率相對前3次反而降低，甚至無法檢出。劉少彬等[9]提出僅提取2次的前處理方法回收率在84.4%～98.4%，滿足檢測要求。但該方法省去了液液萃取步驟，需要真空濃縮，不能使用普通的減壓旋蒸儀，對硬件要求較高。本試驗加標回收發(fā)現(xiàn)，提取2次的提取回收率為42.0%～71.0%，明顯低于提取3次的81.6%～93.8%，不能滿足檢測要求，因此，選擇提取3次（表2）。

按照GB/T 20361—2006的方法使用二氯甲烷液液萃取凈化2次，實際操作中，因為樣品中脂肪等雜質(zhì)影響，第2次萃取過程中經(jīng)常出現(xiàn)乳化分層困難、有機相和水相混溶、倒置現(xiàn)象[11]，直接影響下一步旋轉(zhuǎn)減壓蒸餾，嚴重影響回收率和圖譜基線（圖5）。相比使用改進后方法（圖3、圖4），可以看出圖5不同樣品的基線和峰面積波動較大，直接影響檢測結(jié)果。但如果不采用液液萃取分離水相和有機相，直接旋蒸濃縮提取劑，因提取劑中水分含量高，旋轉(zhuǎn)減壓蒸餾時特別容易出現(xiàn)爆沸。如果采取氮吹濃縮，因為提取劑量太多，提取劑大部分為乙腈且含水量高，耗時太長（至少1 h）且很難吹干。該方法只使用20 mL二氯甲烷液液萃取1次，節(jié)約了時間，避免因萃取水相和有機相分層困難、混溶、倒置造成的回收率損失。

2.3 儀器方法的優(yōu)化

GB/T 20361—2006的方法流速為1.3 mL/min，容易造成色譜基線不穩(wěn)定，影響目標物質(zhì)的積分與定量（圖5、圖6）。改為1.0 mL/min后色譜基線相對平穩(wěn)，對目標物質(zhì)的積分影響較?。▓D7）。

3 小結(jié)與討論

比較了國標方法GB/T 20361—2006中孔雀石綠殘留量不同提取次數(shù)和凈化次數(shù)對回收率的影響，優(yōu)化了前處理和色譜條件，將原方法提取4次、液液萃取凈化2次的前處理操作減少為提取3次凈化1次，同時將色譜方法的流速從1.3 mL/min降低為1.0 mL/min，節(jié)省了前處理時間和試劑用量，提高了檢測效率，降低了基質(zhì)干擾，避免了原方法液液萃取造成的提取劑乳化、分層困難和回收率、精密度偏低的情況，同時使色譜基線更加穩(wěn)定，對目標峰積分的影響更小。改進后方法檢測限由原國標方法的0.50 μg/kg降低為0.40 μg/kg，回收率由原國標方法的70%～110%提升至81.8%～100.8%，精密度達到0.93%～8.32%，均達到并優(yōu)于國標，值得普及推廣。

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