三種莢蒾中香豆素提取工藝及含量比較分析研究

牛茵茵 廖騰飛 王麗

摘要：以皺葉莢蒾（Viburnum rhytidophyllum）、球核莢蒾（Viburnum propinquum）和雞樹(shù)條莢蒾（Viburnum sargentii）為原料，選取乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度和料液比為因素，吸光度為指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，選取適當(dāng)因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，并采用高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行試驗(yàn)，采用優(yōu)化后的工藝進(jìn)行提取，比較3種莢蒾（Viburnum dilatatum）中香豆素的提取率。結(jié)果表明，3種莢蒾中均含有香豆素，其中，皺葉莢蒾中香豆素的含量最高，球核莢蒾次之，雞樹(shù)條莢蒾最少;皺葉莢蒾和球核莢蒾香豆素最佳提取條件為乙醇濃度55%、提取時(shí)間60 min、提取溫度80 ℃、料液比1∶25（g∶mL）;雞樹(shù)條莢蒾香豆素最佳提取條件為乙醇濃度55%、提取時(shí)間80 min、提取溫度70 ℃、料液比1∶25（g∶mL）。不同品種莢蒾中香豆素的提取工藝和所提取的香豆素含量均存在差異。

關(guān)鍵詞：莢蒾（Viburnum dilatatum）;香豆素;提取優(yōu)化;測(cè)定比較

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.2 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）17-0107-05

Abstract： The raw materials are Viburnum rhytidophyllum，Viburnum propinquum and Viburnum sargentii. The single factor experiment was carried out by selecting ethanol concentration， extraction time， extraction temperature and ratio of material to liquid as factors， absorbance as index， and then orthogonal test analysis was carried out at appropriate factor level and HPLC was used to carry out the experiment. The yield of coumarin from three varieties of Viburnum was compared by the optimized extraction process. The results showed that coumarin was found in all three kinds of Viburnum， Viburnum rhytidophyllum was the highest，Viburnum propinquum was the second， and Viburnum sargentii was the least. The optimum conditions of Viburnum rhytidophyllum ?and Viburnum propinquum were as follows： The concentration of ethanol was 55%， the extraction time was 60 min， the extraction temperature was 80 ℃， and the ratio of material to liquid was 1∶25. The optimum conditions of Viburnum sargentii were as follows： The concentration of ethanol was 55%， the extraction time was 80 min， the extraction temperature was 70 ℃， and the ratio of material to liquid was 1∶25. The content of coumarin was different in the extraction process of different varieties of Viburnum.

Key words： Viburnum dilatatum; coumarin; extraction optimization; comparison of measurements

莢蒾屬（Viburnum）植物在中國(guó)廣泛分布，且西南部地區(qū)資源尤為豐富，一直以來(lái)都是重要的中藥材。莢蒾屬植物種類(lèi)繁多且多數(shù)處于野生狀態(tài)，具有抗塵埃和富集重金屬能力，在適宜的園林中廣為應(yīng)用[1-3]。在現(xiàn)代研究中發(fā)現(xiàn)莢蒾（Viburnum dilatatum）有極高的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其中有9種莢蒾的根、莖、葉及花果均可入藥，且莢蒾中的有機(jī)成分具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗腫瘤等功效[4-8]。值得關(guān)注的是，莢蒾中的氨基酸和微量元素的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高且具有止咳療效[9-12];其果實(shí)可用來(lái)制作果醬、飲品和釀酒，樹(shù)皮纖維可制成繩索，因此，莢蒾的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用非常有前景。莢蒾中主要含有多種天然活性物質(zhì)，如類(lèi)黃酮、糖類(lèi)、酚類(lèi)、香豆素和果皮紅色素。已有研究對(duì)莢蒾中的黃酮、多糖、葉綠原酸和果皮紅色素等天然活性物質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定并提取分析[13-15]，但尚未見(jiàn)到莢蒾中香豆素天然活性物質(zhì)的提取研究。

本研究以莢蒾屬植物中球核莢蒾（Viburnum propinquum）、皺葉莢蒾（Viburnum rhytidophyllum）和雞樹(shù)條莢蒾（Viburnum sargentii）為研究對(duì)象，對(duì)這3種莢蒾葉中香豆素的含量進(jìn)行測(cè)定并優(yōu)化提取，同時(shí)對(duì)其葉中香豆素的含量差異進(jìn)行比較分析，以期為保健品和化妝品提供更多的天然原料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

皺葉莢蒾和球核莢蒾均采自湖北省恩施市土家族苗族自治州，北緯30°18′47″，東經(jīng)109°16′4″，海拔1 420 m;雞樹(shù)條莢蒾采自湖北省恩施市土家族苗族自治州，北緯30°3′7″，東經(jīng)109°6′53″，海拔1 130 m;香豆素標(biāo)準(zhǔn)品（CAS RN為91-64-5，純度98%），購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司;無(wú)水乙醇（分析純），購(gòu)自北京化工廠;乙腈（色譜純），購(gòu)自科隆化學(xué)品有限公司;試驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（RT-02A），中誠(chéng)藥機(jī);電子天平（BSA224S），賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱（RT-02A），上海市博遠(yuǎn)實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;低速大容量離心機(jī)（DL-5-B），上海安亭科學(xué)儀器廠;超聲波清洗器（KQ5200E），昆山市超聲儀器有限公司;循環(huán)水式多用真空泵（SHB-III），鄭州長(zhǎng)城科貿(mào)有限公司;高效液相色譜儀（LC7050），海能儀器股份有限公司;雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（TU-1901），北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定條件 Ultimate AQ-C18 （4.6 mm × 250 mm，5 μm），柱溫35 ℃，流動(dòng)相乙腈與去離子水體積比為45∶55，流速 ? ? ?1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm，進(jìn)樣量5 μL。

1.3.2 供試品溶液的制備 選擇新鮮的莢蒾葉，首先置于50 ℃恒溫干燥箱內(nèi)烘干，之后將干燥的莢蒾葉碎成粉末，然后過(guò)60目篩，稱(chēng)取干燥至恒重的莢蒾葉粗粉約5.00 g置于錐形瓶中，并放入超聲波清洗器中超聲30 min，分別在不同時(shí)間、不同濃度、不同料液比和不同溫度條件下進(jìn)行乙醇水浴提取，離心后低溫保存。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱(chēng)取香豆素標(biāo)準(zhǔn)品3.5 mg，加乙腈（色譜純）定容至100 mL，即得濃度為35 μg/mL的香豆素標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取2、4、6、8 mL濃度為35 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL的容量瓶中，用乙腈（色譜純）定容，分別配成7、14、21、28 μg/mL的香豆素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.4 3種莢蒾中香豆素吸光度值的測(cè)定 將所提取的3種莢蒾中香豆素稀釋成不同濃度的待測(cè)液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值，比較單因素中提取時(shí)間、乙醇濃度、料液比、提取溫度3個(gè)水平的吸光度值大小。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立 在275 nm的波長(zhǎng)條件下測(cè)定香豆素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到線(xiàn)性方程Y=13.789X-4.308 5，R2 =0.999 6（圖1）。

1.3.6 單因素試驗(yàn)

1）乙醇濃度。稱(chēng)取干燥至恒重的莢蒾葉粉末約5.00 g于錐形瓶中，置于超聲波清洗器中30 min后進(jìn)行水浴加熱提取，在乙醇濃度分別為15%、35%、55%、75%、95%，料液比為1∶25（g∶mL，下同），提取溫度為70 ℃，提取時(shí)間為70 min的條件下制備供試品溶液，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品吸光度，研究不同乙醇濃度對(duì)吸光度的影響。

2）提取時(shí)間。稱(chēng)取干燥至恒重的莢蒾葉粉末約5.00 g于錐形瓶中，置于超聲波清洗器中30 min后進(jìn)行水浴加熱提取，在提取時(shí)間分別為40、50、60、70、80 min，料液比為1∶25，提取溫度為70 ℃，乙醇提取濃度為75%的條件下制備供試品溶液，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品吸光度，研究不同提取時(shí)間對(duì)吸光度的影響。

3）提取溫度。稱(chēng)取干燥至恒重的莢蒾葉粉末約5.00 g于錐形瓶中，置于超聲波清洗器中30 min后進(jìn)行水浴加熱提取，在提取溫度分別為40、50、60、70、80 ℃，料液比為1∶25，提取時(shí)間為70 min，乙醇提取濃度為75%的條件下制備供試品溶液，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品吸光度，研究不同提取溫度對(duì)吸光度的影響。

4）料液比。稱(chēng)取干燥至恒重的莢蒾葉粉末約5.00 g于錐形瓶中，置于超聲波清洗器中30 min后進(jìn)行水浴加熱提取，在料液比分別為1∶10、1∶25、1∶30、1∶40、1∶50，提取溫度為70 ℃，提取時(shí)間為70 min，乙醇提取濃度為75%的條件下制備供試品溶液，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品吸光度，研究不同料液比對(duì)吸光度的影響。

1.3.7 正交試驗(yàn)及含量測(cè)定 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，以莢蒾中總香豆素提取率為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取提取香豆素的最佳條件（表1）。

將正交試驗(yàn)制備的樣品溶液吸取約1 mL經(jīng)0.45 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾，裝樣進(jìn)行香豆素含量的測(cè)定，香豆素的提取率公式如下：

[α=X×VM×10-5×100%] ? （1）

式中，α 表示香豆素的提取率，X表示樣品液中香豆素的質(zhì)量濃度（μg/mL），V表示提取液的總體積（mL），M表示莢蒾葉的取樣質(zhì)量（g）。

1.3.8 驗(yàn)證試驗(yàn)及含量比較 對(duì)正交試驗(yàn)分析得出的最優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證。按照3種莢蒾品種分析得到的最優(yōu)試驗(yàn)條件對(duì)樣品中香豆素進(jìn)行提取測(cè)定，分析計(jì)算香豆素的提取率，并在此基礎(chǔ)上比較3種莢蒾中香豆素含量的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

分別在不同乙醇濃度、不同提取時(shí)間、不同提取溫度和不同料液比4種因素條件下，對(duì)提取3種莢蒾中香豆素溶液吸光度的影響進(jìn)行研究分析，結(jié)果如圖2至圖5所示。

由圖2可知，皺葉莢蒾和球核莢蒾中香豆素提取液的吸光度最大對(duì)應(yīng)的乙醇濃度為55%，在此之前，吸光度隨著乙醇濃度的增大而增大，當(dāng)乙醇濃度大于55%時(shí)，吸光度開(kāi)始減小，說(shuō)明在試驗(yàn)范圍內(nèi)，皺葉莢蒾和球核莢蒾的最佳乙醇提取濃度為55%;而雞樹(shù)條莢蒾中香豆素提取液的吸光度呈先增大后減小、再增大、再減小的趨勢(shì)，其最佳乙醇提取濃度為35%?？赡茉蚴钱?dāng)乙醇濃度達(dá)到一定程度時(shí)，對(duì)香豆素的分子結(jié)構(gòu)會(huì)造成不同程度的影響。

由圖3可知，當(dāng)提取時(shí)間在40～60 min時(shí)，香豆素提取液的吸光度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)60 min 時(shí)，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，3種莢蒾中香豆素提取液的吸光度反而減小，可能原因是長(zhǎng)時(shí)間的超聲機(jī)械作用使香豆素分子的某些鍵斷裂，從而破壞分子，考慮到時(shí)間越長(zhǎng)提取成本越高，所以提取時(shí)間宜選60 min。

由圖4可知，溫度對(duì)皺葉莢蒾和雞樹(shù)條莢蒾中香豆素提取液的吸光度影響不大，而對(duì)球核莢蒾中香豆素提取液的吸光度影響呈先增大后減小的趨勢(shì)，產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是高溫破壞了香豆素的結(jié)構(gòu)。

由圖5可知，料液比對(duì)3種莢蒾中香豆素提取液吸光度的影響明顯。吸光度隨著料液比的增大而不斷增大，但當(dāng)料液比大于1∶25時(shí)，吸光度隨料液比的增大而減小，因此，為了節(jié)約物料成本，選取料液比為1∶25提取較為合適。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

分別取皺葉莢蒾、球核莢蒾和雞樹(shù)條莢蒾各5.00 g，每個(gè)品種各取9份，按因素水平表采用超聲輔助水浴協(xié)同提取3種莢蒾的香豆素，以提取率作為考察指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，取平均值，結(jié)果見(jiàn)表2。極差R反映各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，極差R越大，表示該因素對(duì)提取率的影響越大。根據(jù)K分析各因素水平對(duì)提取率的影響，K越大，表示因素水平對(duì)提取率影響越大，由此可得影響3種莢蒾提取香豆素的因素大小和最優(yōu)提取組合。結(jié)果表明，皺葉莢蒾和球核莢蒾中香豆素的最佳提取條件為乙醇濃度55%、提取時(shí)間60 min、提取溫度80 ℃、料液比 ? 1∶25;雞樹(shù)條莢蒾中香豆素的最佳提取條件為乙醇濃度55%、提取時(shí)間80 min、提取溫度70 ℃、料液比1∶25。影響皺葉莢蒾提取香豆素的因素大小表現(xiàn)為乙醇濃度>料液比>提取時(shí)間>提取溫度;影響球核莢蒾提取香豆素的因素大小表現(xiàn)為乙醇濃度>提取時(shí)間>料液比>提取溫度;影響雞樹(shù)條莢蒾提取香豆素的因素大小表現(xiàn)為提取時(shí)間>料液比>乙醇濃度>提取溫度（表3）。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)及含量比較結(jié)果與分析

按照3種莢蒾提取香豆素的最優(yōu)組合進(jìn)行3次平行驗(yàn)證，由表4可知，3種莢蒾的最優(yōu)組合均能提取香豆素，但3種莢蒾所提取的香豆素含量差異較大，皺葉莢蒾中香豆素的含量最高，球核莢蒾次之，雞樹(shù)條莢蒾最少。

3 小結(jié)

通過(guò)單因素試驗(yàn)分別探索了提取時(shí)間、提取溫度、料液比和乙醇濃度4個(gè)因素對(duì)莢蒾中香豆素提取率的影響，并在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)，優(yōu)化3種莢蒾中香豆素的提取工藝，對(duì)比分析不同品種、不同提取工藝的香豆素提取率。結(jié)果表明，皺葉莢蒾和球核莢蒾中香豆素的最佳提取條件為乙醇濃度55%、提取時(shí)間60 min、提取溫度80 ℃、料液比1∶25;雞樹(shù)條莢蒾中香豆素的最佳提取條件為乙醇濃度55%、提取時(shí)間80 min、提取溫度70 ℃、料液比1∶25。3種莢蒾中均含有香豆素，其中，皺葉莢蒾中香豆素的含量最高，球核莢蒾次之，雞樹(shù)條莢蒾最少。

不同品種莢蒾中香豆素的提取工藝和含量存在差異，本研究為其他品種莢蒾中香豆素的含量測(cè)定和提取工藝奠定了基礎(chǔ)。未來(lái)可收集不同地區(qū)的莢蒾屬品種，分析地區(qū)差異性對(duì)香豆素含量的影響，并對(duì)莢蒾屬中香豆素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析鑒定，建立莢蒾屬香豆素高效液相特征圖譜，以期為莢蒾屬研究提供參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] 馮 翔，姚安慶，王文凱. 中國(guó)莢蒾屬植物研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2016（13）：172-173.

[2] 趙 越. 5種不同來(lái)源的歐莢蒾果實(shí)中有效成分的含量測(cè)定[D]. 長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[3] 吳麗娜，魯 海. 園林綠化樹(shù)種——雞樹(shù)條莢蒾[J]. 內(nèi)蒙古林業(yè)科技，2008，34（4）：59-60.

[4] 杜靈潔，楊晨娜，李爾敏，等. 莢蒾屬植物藥用資源研究進(jìn)展[J]. 臺(tái)州學(xué)院學(xué)報(bào)，2017，39（6）：6-9.

[5] В. Д. 伊萬(wàn)諾夫，段維和. 歐莢蒾果實(shí)化學(xué)成分的研究[J]. 特產(chǎn)科學(xué)實(shí)驗(yàn)，1984（2）：57-58.

[6] 李 敏，趙 權(quán)，武曉林. 雞樹(shù)條莢蒾抗炎活性研究[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科技，2012（11）：136-138.

[7] 彌春霞，陳 歡，任玉蘭，等. 雞樹(shù)條莢蒾果實(shí)提取物抑菌作用研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（22）：11767-11768，11782.

[8] 夏令先，王玉斌，黃文龍，等. 香豆素類(lèi)化合物的抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)新藥雜志，2013，22（20）：2392-2404.

[9] 杜鳳國(guó)，刁邵起. 天目瓊花果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)成分[J]. ?東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，35（1）：84-85.

[10] 王恩偉，李根有. 莢蒾屬植物研究進(jìn)展[J]. 江蘇林業(yè)科技，2009，36（1）：50-54.

[11] 李彥冰，張 琳，閆 靜. 雞樹(shù)條莢蒾果實(shí)止咳作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中醫(yī)藥信息，2002（4）：60.

[12] 范 鋒. 雞樹(shù)條莢蒾果實(shí)中總黃酮的含量測(cè)定及有效部位研究[D]. 哈爾濱：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，2007.

[13] 李登攀，李金玲，王宏偉，等. 雞樹(shù)條莢蒾化學(xué)成分測(cè)定分析[J]. 人參研究，2009，21（2）：16-19.

[14] 孟 鑫，胥莉莉，王 磊，等. 雞樹(shù)條莢蒾葉綠原酸的最佳提取工藝研究[J]. 中醫(yī)藥信息，2012，29（3）：57-59.

[15] 劉玉芬，夏海濤，姜延春. 野生雞樹(shù)條莢蒾果皮紅色素的提取及穩(wěn)定性研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（13）：3124-3128.