龍生蛭膠囊抗凝、抗血栓作用的實驗研究*

陳海紅 陳 冰 張弈舒 陳思邈 林敏秋 陳偉燕 張宇燕△

（1.浙江省杭州市中醫(yī)院，浙江 杭州 310007；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

血栓是由血小板大量聚集形成，腦缺血的發(fā)生與血栓的形成有著密不可分的關(guān)系。當血管中的纖維蛋白、血小板、白細胞和紅細胞異常聚集在一起，使血管壁變得狹窄，血流量減少，從而造成了缺血的癥狀［1］。而腦缺血則是缺血性疾病中最為危險的一種。腦缺血是一種病因復(fù)雜的疾病，許多因素例如高血壓、腦內(nèi)腫瘤、低血糖、腦出血等等都有可能發(fā)展為腦缺血疾病。腦缺血發(fā)生的病因諸多，目前沒有特效治療藥，但通過減少或抑制血栓的形成，對治療缺血性疾病有著重要的作用［2-3］。

龍生蛭膠囊是在補陽還五湯的基礎(chǔ)上所制成的，共含有12味中藥，以黃芪、水蛭為君，當歸、紅花、赤芍、桃仁和紅花為臣藥，桑寄生、刺五加和石菖蒲為佐，木香、地龍共為使藥。龍生蛭膠囊的主要藥理功效為補氣活血，逐瘀通絡(luò)?！侗静菪戮帯分休d黃芪“其功用甚多，而其獨效者，尤在補血”“黃芪用之于當歸之中，自能助之以生血也”，稱其為“補氣之圣藥”，這也是龍生蛭膠囊增補氣血，活絡(luò)血液的功效所在?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中記載水蛭“水蛭主逐惡血、瘀血，月閉、破血瘕積聚”，表明了水蛭具有逐血瘀，溶血栓的作用。地龍能夠抑制血小板集合，還能溶解血栓。當歸和赤芍的配伍也具有改善血流，減少血栓形成的作用［4］。這正是龍生蛭膠囊能夠抗血栓、抗凝的基礎(chǔ)所在，并且目前也有許多文獻報道了龍生蛭膠囊在抗血栓、抗凝中有著重要的作用［5-7］。本文采用體內(nèi)外實驗觀察龍生蛭膠囊的抗凝、抗栓作用，為其治療心腦血管病的臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)，有助于臨床合理使用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量（280±10）g；昆明種小鼠，雌鼠和雄鼠各半，體質(zhì)量為16～22 g。動物均購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心，合格證號：SYXK（浙）2018-0012。

1.2 實驗藥物

龍生蛭膠囊，陜西省咸陽市步長藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準字：Z20010059，成分為黃芪、水蛭、當歸、紅花、赤芍、桃仁、紅花、桑寄生、刺五加、石菖蒲、木香、地龍；阿司匹林片，拜耳醫(yī)藥公司。其余試劑均為分析純。

1.3 龍生蛭膠囊體外抗凝纖溶作用研究

1.3.1 龍生蛭膠囊對纖維蛋白溶解活性的影響 1）試液配制。0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH=7.4）的制備：精密稱取0.0904 g的NaH2PO4和0.3276 g的Na2HPO4，加入20 mL蒸餾水，使兩者充分溶解，即可得到磷酸緩沖液。20 μ/mL凝血酶液的制備：取1 mL配置好的0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH=7.4）放入小試管中，再稱取0.004 g凝血酶加入小試管，搖晃至充分溶解。龍生蛭溶液的配制：取龍生蛭膠囊，加純化水溶解，分別配制成0.5、1、2 g/L質(zhì)量濃度梯度的龍生蛭藥液。2）纖維蛋白平板的制備。取4.5 mL纖維蛋白原溶液置于平皿中，加入0.5 mL的凝血酶液，立即旋轉(zhuǎn)使其混合均勻，蓋上平皿蓋襯以濾紙，水平放置1 h。3）實驗步驟。取10 μL不同質(zhì)量濃度的龍生蛭藥液滴加到制備好的纖維蛋白平板上，每一點龍生蛭藥液之間的距離不得小于1.5 cm，再取10 μL生理鹽水滴在另一側(cè)，作為對照。將纖維蛋白平板水平放置于濕盒中，放進37℃恒溫箱中恒溫保存6 h，觀察溶液周圍溶解圈的形成，卡尺測量溶解圈的長、短徑，最后計算面積，并以溶解圈面積大小為標準，標定纖溶活性的強弱。不同質(zhì)量濃度的龍生蛭藥液均重復(fù)10次實驗，各組取平均值。溶解圈面積（mm2）=［（長徑+短徑）/4］2×π。

1.3.2 龍生蛭膠囊對大鼠血漿復(fù)鈣時間（PRT）的影響

1）對照組血漿復(fù)鈣時間：取3個離心管，并在3個離心管均加入0.1 mL SD大鼠血漿和0.1 mL生理鹽水，混合均勻后立即置于37℃水浴中，1 min后取出，然后分別加入0.1 mL氯化鈣溶液，完全混合后再次置于37℃水浴中，并同時使用計時器計時。記錄從加氯化鈣溶液到纖維蛋白形成所需的時間，計算3個離心管中纖維蛋白形成時間的平均值，即為對照組的血漿復(fù)鈣時間。

2）給藥組血漿復(fù)鈣時間：將對照組中的生理鹽水換成梯度質(zhì)量濃度龍生蛭藥液（質(zhì)量濃度為1、2、4、6、8 g/L），其余條件均不改變，計算不同質(zhì)量濃度的龍生蛭藥液的血漿復(fù)鈣時間，即為給藥組血漿復(fù)鈣時間。

1.3.3 龍生蛭膠囊對凝血酶原時間（PT）的影響 取玻璃試管6支，每支均加入0.05 mL凝血活酶、0.05 mL氯化鈣溶液、0.05 mL SD大鼠血漿，編號為1～6，在前5支玻璃試管中按照編號依次加入0.05 mL質(zhì)量濃度1、2、4、6、8 g/L的龍生蛭藥液，在最后一只玻璃試管（編號為6）中加入0.05 mL生理鹽水，作為對照組?；旌暇鶆蚝笾糜?7℃水浴中，并開始計時。每2～3s慢慢地將試管傾斜1次。記錄玻璃試管中液面保持不動所需的時間，即為纖維蛋白凝固所需的時間。每組重復(fù)10次，并取平均值。

1.4 龍生蛭膠囊對正常小鼠體內(nèi)抗凝、抗栓作用的研究

1.4.1 分組方法 將昆明種小鼠隨機分成5組，雌雄各半，每組10只，分別為正常組、龍生蛭膠囊低、中、高劑量組（1.32、2.64、5.28 g/kg）、陽性藥對照組（阿司匹林1.3 mg/kg），正常組灌胃等量生理鹽水，各組其余的飼養(yǎng)條件都相同，連續(xù)灌胃給藥7 d，每天1次。

1.4.2 龍生蛭膠囊對正常小鼠尾部凝血時間的影響 在最后1次灌胃結(jié)束1 h后，剪斷小鼠的1 cm尾尖，使血液能夠自動流出。第1滴血用濾紙擦干后，滴兩滴于潔凈載玻片的兩端，用干燥的6號針頭沿血滴的外緣向內(nèi)里慢慢地挑動，直至6號針頭能挑起纖維蛋白絲為止，即計為小鼠尾尖凝血時間。

1.4.3 龍生蛭膠囊對正常小鼠凝血系統(tǒng)的影響 最后1次灌胃結(jié)束1 h后，用眼科鑷摘除小鼠眼球取血，3.8%枸櫞酸鈉抗凝，1 500 r/min離心5 min，按照試劑盒說明書操作，分別測定小鼠凝血酶時間（TT）、PT、纖維蛋白原（FIB）水平、活化部分凝血酶原時間（APTT）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS25.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，進行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01為具有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 龍生蛭膠囊體外抗凝纖溶的作用

2.1.1 龍生蛭膠囊對纖維蛋白（平板）溶解活性的影響 見表1。與生理鹽水組比較，不同劑量的龍生蛭藥液均能促進纖維蛋白塊的溶解，且龍生蛭膠囊對于加熱纖維蛋白平板（破壞纖溶酶原）溶解無促進效果，表明龍生蛭藥液缺乏纖溶酶活性，它是通過激活纖溶酶原，使纖溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘睦w溶酶，從而促進了纖維蛋白塊的溶解。同時實驗結(jié)果也表明，龍生蛭膠囊質(zhì)量濃度越大，纖維蛋白（平板）溶解面積最大，對纖維蛋白溶解活性越強。

表1 龍生蛭膠囊對纖維蛋白（平板）溶解活性的影響

2.1.2 龍生蛭膠囊體外對大鼠PRT的影響 見表2。與生理鹽水組比較，龍生蛭藥液不同質(zhì)量濃度均能延長大鼠PRT，具有抑制血漿復(fù)鈣的作用，且隨著龍生蛭藥液質(zhì)量濃度升高，血漿凝固時間越長，其中質(zhì)量濃度8 g/L的龍生蛭藥液的血漿凝固時間最長。

表2 龍生蛭膠囊體外對大鼠PRT、PT的影響（s）

2.1.3 龍生蛭膠囊體外對大鼠PT的影響 見表2。與生理鹽水組比較，龍生蛭藥液不同質(zhì)量濃度均能延長PT，抗凝效果明顯，其中以6 g/L的龍生蛭藥液的抗凝效果更為明顯。體外抗凝纖溶的作用研究表明，龍生蛭膠囊能促進纖維蛋白塊溶解，延長血漿復(fù)鈣時間，能延長體外PT，具有較好的體外抗凝作用。

2.2 龍生蛭膠囊對正常小鼠體內(nèi)抗凝、抗栓的影響

2.2.1 龍生蛭膠囊對正常小鼠尾部凝血時間的影響見表3。與正常生理鹽水組比較，龍生蛭膠囊低、中、高劑量組均能明顯延長正常小鼠尾部血液凝固時間（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 龍生蛭膠囊對正常小鼠尾部凝血時間的影響（s，±s）

表3 龍生蛭膠囊對正常小鼠尾部凝血時間的影響（s，±s）

與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同

組別正常組龍生蛭低劑量組龍生蛭中劑量組龍生蛭高劑量組阿司匹林組n 10 10 10 10 10凝血時間127.25±28.32 153.05±48.27*162.20±52.04**188.30±53.91**138.05±42.68

2.2.2 龍生蛭膠囊對正常小鼠凝血4項指標的影響見表4。與正常組比較，龍生蛭膠囊能延長TT和PT，一定程度上延長活化部分APTT，能明顯提高血漿中FIB水平，且均具有劑量相關(guān)性，表明龍生蛭膠囊能使正常小鼠的凝血時間延長，具有較好的抗血栓和抗凝的功效。

3 討 論

近年來，腦缺血的發(fā)病率有逐年攀升的趨勢，且死亡率也在逐年增加［2］。其中血栓是導(dǎo)致腦缺血發(fā)生的重要原因。血小板的活化并聚集，造成腦血管堵塞并最終形成了腦血栓，從而發(fā)展成了腦缺血疾病［8］。因此，減少腦血栓的形成對于治療腦缺血有很大的幫助。目前腦血管病治療手段有溶栓治療、阿司匹林口服和抗凝治療等［9］。單純西醫(yī)在基礎(chǔ)研究方面取得了較大進展，常采用溶栓、降纖、抗凝、腦保護等治療，雖可降低患者死亡率，但無法調(diào)控其發(fā)病率、致殘率以及復(fù)發(fā)率，臨床治療進展不大，后期恢復(fù)并無良方，尚無修復(fù)性治療方法，功能恢復(fù)非常有限，許多患者可能會遺留有大腦某些功能的永久性損害［10］。隨著中醫(yī)藥的發(fā)展，利用中西醫(yī)結(jié)合手段進行腦血管疾病的診療療效頗豐。臨床實踐表明，中醫(yī)藥在腦血管疾病的理論、方法、效果、成本等方面具有明顯的應(yīng)用優(yōu)勢，發(fā)揮中醫(yī)簡、效、廉、便的特色，必將是我國腦血管病臨床實踐的必然趨勢［11-12］。中藥復(fù)方相對于單一成分為主的西藥，可發(fā)揮多成分、多靶點、多途徑的整合治療作用，發(fā)揮整體藥效，恢復(fù)人體多系統(tǒng)相互作用的穩(wěn)態(tài)平衡。

表4 龍生蛭膠囊對正常小鼠凝血4項指標的影響（±s）

表4 龍生蛭膠囊對正常小鼠凝血4項指標的影響（±s）

n組別正常組龍生蛭低劑量組龍生蛭中劑量組龍生蛭高劑量組阿司匹林組10 10 10 10 10 TT（s）24.30±4.50 29.78±8.90 35.07±8.74*47.04±9.41**36.63±6.77*PT（s）13.63±0.92 15.03±1.26 21.82±6.63*32.04±7.51**15.92±4.01 APPT（s）27.50±6.27 33.74±3.49 37.92±8.60 53.81±10.28**30.63±5.38 FIB（g/L）42.49±10.98 57.30±22.49 61.63±8.14*90.04±30.47**66.09±14.32**

中醫(yī)治療心腦血管病的中藥材都有活血化瘀、抗血栓形成、溶解血栓的作用，并有降脂抗凝、降低血小板聚集和黏附、改善血管內(nèi)皮功能、解除心腦血管痙攣，增加心腦血供的功效［13］。中醫(yī)治病求本，注重調(diào)整陰陽，重視患者體質(zhì)的差異性，辨證施治。氣虛可引起血液流變學(xué)異常，缺血性腦血管病血液流變性明顯異常，臨床研究也表明，氣虛血瘀證患者表現(xiàn)為明顯的血流變異常［14］，氣虛無以推動血液，可能是血液流變性異常的原因之一，也是中醫(yī)“氣為血帥”“氣虛致瘀”的理論依據(jù)。而益氣活血法及方藥能明顯改善血液流變學(xué)指標［14］，以黃芪、水蛭為君藥的龍生蛭膠囊，具有補氣活血，逐瘀通絡(luò)的功效，可強效活血，標本同治。臨床研究也表明，龍生蛭膠囊用于治療腦梗死恢復(fù)期、后遺癥期、血管性癡呆等，中醫(yī)辨證為氣虛血瘀型的患者，取得了較好的臨床療效［15-18］。本實驗通過血液流變學(xué)的觀察角度，為臨床中醫(yī)藥及中西醫(yī)結(jié)合治療缺血性中風提供中醫(yī)配伍、藥物聯(lián)合應(yīng)用等的實驗依據(jù)。

本研究通過體外抗凝實驗，表明龍生蛭膠囊主要通過激活纖溶酶原，進而活化纖溶酶，達到溶解纖維蛋白塊的作用。龍生蛭膠囊能促進纖維蛋白塊溶解，延長血漿復(fù)鈣時間，能延長體外PT，具有較好的體外抗凝作用，減緩血栓的形成。通過正常小鼠體內(nèi)抗凝和抗血栓實驗，表明龍生蛭膠囊能明顯延長TT、PT和APTT，明顯提高血漿中FIB水平，使正常小鼠的凝血時間延長，具有較好的抗血栓和抗凝的功效，從而能夠較好地抑制血栓的形成。龍生蛭膠囊以黃芪和水蛭為君藥，還有紅花、川芎、當歸等10味中藥。有研究表明黃芪和水蛭的提取物均具有抑制血栓形成的作用［19-21］。龍生蛭膠囊集多味活血化瘀中藥為一體，在以往的研究中也被證實有抗腦缺血及腦缺血后的神經(jīng)保護作用［22］。本研究通過多項指標的測量，其結(jié)果表明龍生蛭膠囊在體內(nèi)外均具有抗凝、抗血栓作用，可為龍生蛭膠囊在臨床中治療腦缺血疾病提供可靠的實驗依據(jù)。