基于細(xì)胞凋亡探討搜風(fēng)祛痰方對(duì)心肌缺血再灌注大鼠冠脈微循環(huán)的影響*

金頌峰 宮麗鴻 肖福龍 呂 童

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110079；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032）

近年來(lái)，由于急性冠脈綜合征入院的患者中，約40%其冠脈造影結(jié)果未見(jiàn)明顯異常，這與心外膜冠狀動(dòng)脈無(wú)狹窄被認(rèn)為不存在缺血的觀點(diǎn)不相吻合，說(shuō)明可能存在著冠脈微循環(huán)障礙（CMD）［1］。有充分證據(jù)說(shuō)明，心肌缺血再灌注損傷中存在著血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［2］，且細(xì)胞凋亡與心肌缺血再灌注損傷呈正比，這是造成血管內(nèi)皮功能障礙［3］，導(dǎo)致CMD發(fā)生的主要原因［4］。如何減少心肌細(xì)胞凋亡已成為心肌保護(hù)的研究熱點(diǎn)之一。前期研究結(jié)果表明［5-6］搜風(fēng)祛痰方具有保護(hù)血管內(nèi)皮功能的作用。因此，本研究將基于該結(jié)論進(jìn)一步探討搜風(fēng)祛痰方對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響，明確搜風(fēng)祛痰方保護(hù)血管內(nèi)皮功能進(jìn)而治療CMD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級(jí)SD大鼠140只，8周齡，體質(zhì)量（240±20）g，編號(hào)：21000092018010［長(zhǎng)生生物，許可證號(hào)：SYXK（遼）2013-0009］。遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，溫度20～25℃，相對(duì)濕度40%～70%，每日光照12 h，自由攝食飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 搜風(fēng)祛痰方：蜈蚣1條，全蝎5 g，白術(shù)15 g，水蛭15 g，陳皮15 g，地龍20 g，法半夏15 g。由遼寧省中醫(yī)院制成含生藥2 g/mL的中藥濃縮液。培哚普利片（施維雅制藥，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)：H20034053，4 mg/片）。

1.3 試劑與儀器 前列環(huán)素（PGI2）、血栓素A2（TXA2）試劑盒（AMEKO）；4%多聚甲醛固定液（碧云天生物，P0099-100mL）；柱式RNA提取試劑盒（生工生物）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（諾唯贊）；微量核酸蛋白測(cè)定儀（柏點(diǎn)）；PCR擴(kuò)增儀（賽默飛）；高通量組織研磨儀（萊馳，型號(hào)：MM400）；小動(dòng)物呼吸機(jī)（HX-100E型號(hào)，成都泰盟科技有限公司）；熒光定量PCR儀（Agilent Technologies）。

1.4 分組與給藥 適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠7 d，隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組、模型組、西藥組、中藥組，每組35只。假手術(shù)組、模型組給予10 mL/kg生理鹽水，中藥組（依照前期研究結(jié)果［5］）給予8.1 g/kg搜風(fēng)祛痰方，西藥組給予0.4 mg/kg培哚普利片，連續(xù)灌胃7 d。

1.5 造模方法 參考文獻(xiàn)［7］方法，末次灌胃1 h后，腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg麻醉大鼠。插入電極監(jiān)測(cè)心電圖，置入氣管導(dǎo)管，接呼吸機(jī)。剃毛消毒大鼠左側(cè)胸壁，將第三四肋間皮膚橫切口切開(kāi)，使心臟充分暴露。在左心耳下距根部2～3 mm處結(jié)扎左前降支及少量心肌組織，閉合胸腔。結(jié)扎成功后可見(jiàn)心電圖R波增寬、ST段抬高。缺血30 min后剪開(kāi)結(jié)扎線，再灌注120 min。造模成功的標(biāo)志為抬高的ST段下降1/2以上。假手術(shù)組與其他3組手術(shù)過(guò)程相同，但不結(jié)扎。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 采集前夜大鼠需禁食。通過(guò)腹主動(dòng)脈取血，靜置離心，取上清液，在-20℃中保存。將大鼠立即處死，無(wú)菌環(huán)境摘取心臟，由4%多聚甲醛固定后放入液氮中，-20℃凍存。1）心電圖。麻醉大鼠，仰臥固定，插入電極，在缺血及再灌注時(shí)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。2）ELISA法測(cè)定PGI2、TXA2含量。3）RT-PCR法測(cè)Bax mRNA、Bcl-2 mRNA。提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，構(gòu)建熒光PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。Bax引物序列為上游為5′-GGGCCTTTTTGCTACAGG GT-3′，下游為 5′-TTCTTGGTGGATGCGTCCTG-3′，長(zhǎng)度為106 bp。Bcl-2引物序列為上游為5′-GGATCCAGGATAACGGAGGC-3′，下游為 5′-ATGCACCCAGAGTGATGCAG-3′，長(zhǎng)度為141 bp。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0軟件。計(jì)量資料以（）表示。組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 共成功建立模型大鼠42只，其中模型組16只，西藥組12只，中藥組14只。假手術(shù)組大鼠25只。

2.2 各組大鼠PGI2、TXA2含量比較 見(jiàn)表1。相比假手術(shù)組，模型組TXA2含量增加，PGI2含量減少（P＜0.05）；相比模型組，西藥組和中藥組PGI2含量升高，TXA2含量下降（P＜0.05）。

表1 各組大鼠PGI2、TXA2含量比較（ng/L，±s）

表1 各組大鼠PGI2、TXA2含量比較（ng/L，±s）

與假手術(shù)組比較，▲P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同

n組別假手術(shù)組模型組西藥組中藥組25 16 12 14 PGI2 68.484±1.950 32.440±1.918▲58.257±5.934△54.507±5.351△TXA2 35.141±0.711 62.258±5.785▲42.471±1.012△49.514±3.426△

2.3 各組大鼠Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表2。相比假手術(shù)組，模型組Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)均升高（P＜0.05）；相比模型組，西藥組和中藥組Bcl-2 mRNA表達(dá)升高，Bax mRNA表達(dá)下降（P＜0.05）。

表2 各組大鼠Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組大鼠Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)水平比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組西藥組中藥組n 25 16 12 14 Bcl-2 mRNA 1.001±0.053 1.855±0.114▲3.594±0.571△3.618±0.224△Bax mRNA 1.008±0.160 3.006±0.290▲1.853±0.211△1.706±0.164△

3 討論

CMD是指在各種致病因素的作用下冠脈微血管的固有結(jié)構(gòu)及功能出現(xiàn)異常，引發(fā)心肌細(xì)胞灌注不足而出現(xiàn)以心肌缺血為主要癥狀的一種臨床綜合征［8］。該病涉及人群廣泛，其發(fā)病可引起冠心病不良事件的發(fā)生，并影響其發(fā)展、治療和預(yù)后，從而導(dǎo)致急性心血管事件的發(fā)生甚至引起死亡［9］。研究發(fā)現(xiàn)［10］，導(dǎo)致CMD發(fā)生的原因有血管內(nèi)皮功能障礙、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等方面，其中由血管內(nèi)皮功能障礙所引起的CMD最為常見(jiàn)。近年來(lái)，心肌缺血再灌注損傷中的細(xì)胞凋亡所引起的血管內(nèi)皮功能障礙已被越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)所證明［11］。因此，從抑制細(xì)胞凋亡的角度保護(hù)血管內(nèi)皮功能是保證冠脈微循環(huán)穩(wěn)定、治療CMD不可替代的基礎(chǔ)。

根據(jù)CMD的臨床表現(xiàn)，可將其歸屬為中醫(yī)學(xué)“胸痹”范疇?，F(xiàn)代人嗜食肥甘，導(dǎo)致脾氣虛弱，健運(yùn)失施，水濕內(nèi)阻，聚濕生痰。痰凝可致血瘀，二者膠結(jié)而生內(nèi)熱，進(jìn)而熱盛風(fēng)動(dòng)，導(dǎo)致脈絡(luò)絀急，這就與CMD血管栓塞痙攣的發(fā)病機(jī)制相似［5］。故治以搜風(fēng)祛痰方，作搜內(nèi)風(fēng)、消痰瘀、通脈絡(luò)之用。方中全蝎、蜈蚣與地龍共為君藥，可清熱息風(fēng)鎮(zhèn)痙、通絡(luò)散結(jié)；陳皮、半夏與白術(shù)共為臣藥，可燥濕化痰、寬胸散結(jié)；水蛭為佐藥，可破血消瘀通絡(luò)。全方共奏搜風(fēng)祛痰、祛瘀通絡(luò)之效。藥理方面，全蝎、蜈蚣與地龍具有保護(hù)內(nèi)皮、抗凝、改善血運(yùn)等功能［12-14］；陳皮、半夏與白術(shù)具有抗炎、抗血栓、抗心律失常和抗氧化等功效［15-17］；水蛭具有抗凋亡、預(yù)防血栓等功效［18］。

培哚普利片具有持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、耐受性好、無(wú)不良影響等優(yōu)點(diǎn)，可擴(kuò)張血管、加快修復(fù)病變小動(dòng)脈、減少血容量、降低血管阻力，有效改善血流動(dòng)力學(xué)［19］，故選用其為本實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照藥物。Bcl-2和Bax是目前公認(rèn)的一對(duì)調(diào)控凋亡的關(guān)鍵基因［20］。心肌缺血再灌注損傷時(shí)，Bax通過(guò)降低Bcl-2表達(dá)并升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；而B(niǎo)cl-2則通過(guò)抗氧化劑或抑制氧自由基生成，改變細(xì)胞內(nèi)Ca2+外流，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)cGMP含量，抑制細(xì)胞凋亡［21］。研究發(fā)現(xiàn)［22］，Bcl-2和Bax含量的增高與缺血再灌注過(guò)程中心肌細(xì)胞的反應(yīng)性表達(dá)、提高細(xì)胞內(nèi)在抵抗力相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：相比假手術(shù)組，模型組Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表達(dá)上升。說(shuō)明心肌缺血再灌注損傷時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞凋亡；相比模型組，中藥組Bcl-2 mRNA表達(dá)上升，Bax mRNA表達(dá)降低。說(shuō)明搜風(fēng)祛痰方具有抑制大鼠心肌缺血再灌注損傷冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用。PGI2與TXA2是一對(duì)具有調(diào)控血管舒縮與血小板聚集作用的相互拮抗的前列腺素因子，由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌［23］。因此，PGI2和TXA2的不平衡與冠脈微循環(huán)內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生有密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：相比假手術(shù)組，模型組PGI2含量下降，TXA2含量上升。說(shuō)明心肌缺血再灌注損傷發(fā)生時(shí)出現(xiàn)冠脈微循環(huán)內(nèi)皮功能障礙；相比模型組，中藥組TXA2含量明顯降低，PGI2含量明顯升高。說(shuō)明搜風(fēng)祛痰方可有效調(diào)節(jié)血管收舒平衡，保護(hù)內(nèi)皮功能。

綜上所述，搜風(fēng)祛痰方可上調(diào)Bcl-2 mRNA表達(dá)，下調(diào)Bax mRNA表達(dá)，調(diào)節(jié)PGI2與TXA2的含量，通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡保護(hù)大鼠心肌缺血再灌注冠脈微循環(huán)內(nèi)皮功能，實(shí)現(xiàn)對(duì)CMD的治療作用。