從心論治方上調(diào)PI3K/Akt磷酸化減輕HUVEC炎癥損傷的體外實驗研究*

李麗君 唐秋萍 顧毓艷 麥明朗 張 烯 趙海鷹 陳曉玲 周鳳華△

（1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八二醫(yī)院，河北 唐山 063000；2.南方醫(yī)科大學，廣東廣州 510515）

動脈粥樣硬化（AS）是急性心腦血管事件的共同病理基礎，對AS的防治工作尤為重要［1］。內(nèi)皮功能受損是AS的起始改變，并可作為預測心血管事件的一項指標［2］。中醫(yī)認為AS病位主要在血脈，屬本虛標實之證，本虛為氣陰兩虛，標實主要表現(xiàn)為“瘀毒”［3］，活血解毒兼以補氣扶正為AS的主要治則。因此，筆者從對AS有顯著療效的定心方中優(yōu)化出主入心經(jīng)的黃連、丹參、酸棗仁與靈芝4味藥材，重新組成從心論治方（CXLZF）。并在動物實驗中初步證實該方能減輕ApoE敲除小鼠斑塊損傷，調(diào)節(jié)血脂，然而其作用機制不清。本實驗主要觀察從心論治方對氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）損傷的影響，從體外水平探討其抗AS的部分藥理機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級成年雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量約200 g，購于南方醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證號：SCXK（粵）2016-0041。

1.2 試藥與儀器

從心論治方由黃連、丹參、酸棗仁及靈芝組成，中藥飲片購自南方醫(yī)院中藥房。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco公司，貨號：C11995500BT、10270-106；CCK-8購自日本同仁公司，貨號：CK04-500T；OX-LDL購自廣州奕源生物科技公司，批號：YB-002（1-002）；人源核因子-κB（NF-κB）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）與白介素-10（IL-10）ELISA檢測試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司，貨號分別為：CSB-E12107h、CSB-E04740h、CSB-E04725h、CSB-E04593h；磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）、蛋白激酶 B（Akt）、p-Akt Ser473、GAPDH 抗體，均購自Cell Signaling Technology，批號依次為C73F8、C67E7、D25E6、D16H11；LY294002購自美國 Sigma公司，批號L9908；EGFP Annexin V/PI凋亡染色試劑盒，購自Gene Copoeia公司，貨號：A025；微量谷胱甘肽（GSH）測試盒、乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，貨號：A006-2、A020-2。超凈臺（蘇凈集團安泰公司）；低溫高速離心機（美國Thermo Electron公司）；CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱（GALAXY公司）；全波長酶標儀（德國Thermo）；Eclipse Ti熒光倒置顯微鏡（日本尼康）；SDS電泳系統(tǒng)（北京君意東方電泳設備有限公司）；Kodak Image Station 2000MM成像系統(tǒng)（美國KODAK公司）；微量移液器（德國Eppendorf公司）。

1.3 細胞培養(yǎng)

HUVEC（ZQ00446）購自上海中喬生物科技公司。采用含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于5% CO2濃度、飽和濕度及37℃恒溫孵育箱中培養(yǎng)，待細胞鋪滿80%～90%培養(yǎng)皿底部時，用0.25%胰酶消化，進行細胞傳代，取對數(shù)增長期細胞進行實驗。

1.4 含藥血清制備

常規(guī)制備CXLZF標準水煎液，終質(zhì)量濃度為2.31 g/mL，置于4℃冰箱備用。取成年雄性SD大鼠，分為實驗組和對照組，實驗組20只，對照組10只。實驗組大鼠每日早晚各灌胃2 mL CXLZF藥液，對照組灌胃同體積生理鹽水，連續(xù)7 d。麻醉大鼠后行腹主動脈取血，靜置30 min后3 500 r/mim離心15min，取上清，并滅活過濾，分裝保存在-80℃冰箱。

1.5 細胞分組

在預實驗中，已對大鼠血清濃度梯度進行篩選，根據(jù)預實驗結(jié)果，將對數(shù)生長期細胞以4×106/mL的密度接種于6孔板，正常培養(yǎng)12 h，待細胞貼壁后隨機分為6組：對照組（加入10%空白組大鼠血清正常培養(yǎng)）、模型組（加入100 μg/mL ox-LDL干預24 h）、從心論治方藥物血清組（分別預先加入2.5%、5%、10%、20%含藥血清孵育2 h，再加入100 μg/mL ox-LDL干預24 h）。

1.6 指標檢測

1.6.1 細胞活力檢測及形態(tài)觀察 1）細胞活力檢測：采用CCK-8法，取1×104/mL單細胞懸液100 μL接種到96孔板，按實驗分組進行處理后，每孔加入10 μL CCK-8繼續(xù)孵育4 h，用酶標儀檢測OD值（波長450 nm）。2）細胞形態(tài)觀察：將HUVEC接種于6孔板中，并制作細胞爬片，按分組對細胞進行相應處理后，棄培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛室溫下固定10 min。用PBS洗滌細胞2次，每次5 min，取出細胞爬片倒扣于載玻片上，置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照。

1.6.2 細胞凋亡檢測 細胞干預后離心收集，用PBS洗2次，每次5 min，加入100 μL 1×binding buffer重懸細胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染色液，輕輕混勻，室溫避光反應10 min。然后加入400 μL 1×binding buffer，混勻，樣品立即上流式細胞儀檢測（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm），計算細胞凋亡指數(shù)。

1.6.3 LDH和GSH含量測定 取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板，作以上分組和處理。收集細胞培養(yǎng)液，按照試劑盒說明書分別檢測LDH和GSH含量。

1.6.4 炎性因子水平檢測 收集細胞后用超聲破裂，離心取上清液，按照ELISA試劑盒說明書進行操作，再分別計算細胞內(nèi)NF-κB、TNF-α、TGF-β與IL-10等炎性因子的水平。

1.6.5 p-Akt Ser473、Akt以及PI3K蛋白水平檢測 棄去細胞培養(yǎng)液，用4℃預冷的PBS洗滌細胞2次，將細胞培養(yǎng)皿置于冰板上，加入裂解液裂解細胞30 min，用細胞刮匙充分刮取細胞，收集所有的細胞裂解液分別置于1.5 mL離心管，12 000 r/min，4℃離心15 min，取上清液并用BCA法定量，98℃金屬浴變性5 min，取等量蛋白樣品，經(jīng)10%的SDS-PAGE電泳分離，蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% BSA封閉1 h，加入相應一抗，4℃過夜或孵育12 h，次日用TBST洗膜3次，每次5 min。加入二抗，室溫孵育2 h后，用TBST洗膜3次，每次5 min，用化學發(fā)光法檢測目的蛋白，凝膠成像儀拍照后，用Gel-Pro analyzer軟件分析灰度。

1.6.6 阻斷PI3K/Akt通路炎性因子水平檢測 將HUVEC接種于6孔板中，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。實驗分為對照組、模型組（ox-LDL，100 μg/mL）、CXLZF組（10%含藥血清）、LY294002組（50 μM）、CXLZF+LY294002組。其中，LY294002是PI3K/Akt特異性抑制劑，需加入細胞預處理2 h。除對照組外，其余4組分別用CXLZF含藥血清或LY294002預處理2 h后，再加入ox-LDL干預細胞24 h復制模型。收集細胞進行炎性因子的ELISA檢測。

1.7 統(tǒng)計學處理

應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，單因素方差分析組間差異的顯著性。P＜0.05表示組間差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HUVEC活力和凋亡情況的比較

見表1，圖1～圖2。如圖1所示，與對照組比較，模型組細胞變圓，體積增大，而含藥血清2.5%、5%、10%、20%組細胞逐漸恢復正常形態(tài)。CCK8結(jié)果顯示，ox-LDL對HUVEC活力影響不顯著，隨著含藥血清濃度加大，細胞活力降低，與對照組相比，含藥血清10%、20%組細胞活力差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。如圖2所示，與對照組相比，模型組細胞紅色熒光表達量多且強度高，說明模型組凋亡和壞死的細胞比對照組多；與模型組相比，含藥血清組紅色熒光表達量均有所降低，說明藥物血清可顯著減輕HUVEC細胞的凋亡。

表1 各組HUVEC細胞增殖、LDH和GSH分泌比較（±s）

表1 各組HUVEC細胞增殖、LDH和GSH分泌比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對照組比較，△P＜0.05。下同

組別對照組模型組含藥血清2.5%組含藥血清5%組含藥血清10%組含藥血清20%組n 6 6 6 6 6 6光密度1.02±0.22 1.16±0.15 0.96±0.15 0.93±0.08 0.89±0.18△0.75±0.13△AI（%）5.73±0.82 16.38±3.1 12.77±1.53 13.25±3.04 7.92±1.24**9.03±2.37**LDH（U/L）232.78±39.63 415.29±73.9 296.40±10.08*281.30±29.57*225.40±9.63**236.11±5.08**GSH（μmol/L）30.36±2.70 30.45±2.05 45.07±0.77**59.93±2.02**38.47±2.92*31.25±3.47

2.2 各組HUVEC分泌LDH和GSH的比較

如表1所示，與對照組相比，模型組HUVEC分泌GSH沒有顯著差異，而LDH則顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，含藥血清10%、20%組分泌GSH顯著增加（P＜0.01），而LDH分泌量顯著減少，尤其是含藥血清10%、20%組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖1 各組HUVEC細胞形態(tài)的比較（200倍）

圖2 各組HUVEC凋亡的比較（200倍）

2.3 各組HUVEC內(nèi)炎性因子水平的比較

見表2。與對照組比較，模型組促炎因子NF-κB和TNF-α含量顯著增加，抗炎因子TGF-β與IL-10水平明顯降低，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。5%、10%、20%含藥血清降低了細胞內(nèi)NF-κB和TNF-α水平，同時升高了TGF-β與IL-10的含量，與模型組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。提示含藥血清能有效降低ox-LDL誘導的HUVEC內(nèi)促炎因子的釋放，同時促進抗炎因子的分泌，能有效維持細胞穩(wěn)態(tài)。

表2 各組HUVEC內(nèi)炎性因子水平的比較（pg/mL，±s）

表2 各組HUVEC內(nèi)炎性因子水平的比較（pg/mL，±s）

組別對照組模型組含藥血清2.5%組含藥血清5%組含藥血清10%組含藥血清20%組n 6 6 6 6 6 6 NF-κB 75.33±9.25 290.42±31.03 256.00±28.57 213.36±19.88*178.09±25.52**133.75±21.47**TNF-α 122.70±9.38 545.91±37.29 436.43±26.84 388.36±12.79*307.68±29.62**278.10±15.44**TGF-β 327.42±25.09 157.50±18.45 172.74±22.28 229.13±15.63*278.47±35.02**261.25±19.47**IL-10 215.33±14.52 87.51±23.79 92.46±12.83 165.77±29.13**178.82±19.07**189.54±11.63**

2.4 各組HUVEC內(nèi)PI3K、Akt、p-Akt蛋白水平的比較

見圖3，表3。如圖3所示，與對照組相比，模型組細胞PI3K、p-Akt的表達量明顯降低；含藥血清預處理組PI3K、p-Akt的表達量明顯增加，與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖3 各組HUVEC中PI3K、p-Akt表達的比較

表3 各組HUVEC內(nèi)PI3K與p-Akt蛋白相對表達量比較（±s）

表3 各組HUVEC內(nèi)PI3K與p-Akt蛋白相對表達量比較（±s）

組別對照組模型組含藥血清2.5%組含藥血清5%組含藥血清10%組含藥血清20%組n 3 3 3 3 3 3 PI3K 1.00±0.17**0.54±0.09 1.09±0.15**0.91±0.10*0.53±0.04 0.80±0.10 p-Akt 1.00±0.14**0.62±0.12 1.08±0.09**1.68±0.24**0.92±0.11*1.46±0.06**

2.5 各組阻斷PI3K/Akt通路對炎性因子水平的影響

見表4。為進一步探討CXLZF是否通過PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)炎癥因子表達，我們采用PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002預先加入細胞內(nèi)孵育2h，阻斷該通路后發(fā)現(xiàn)，CXLZF對細胞內(nèi)NF-κB和TNF-α的下調(diào)作用受到抑制，同時升高TGF-β與IL-10作用也低于單獨應用CXLZF組。提示CXLZF減輕HUVEC炎癥損傷可能是通過激活PI3K/Akt信號通路起作用。

表4 各組阻斷PI3K/Akt通路對炎性因子水平的影響（pg/mL±s）

表4 各組阻斷PI3K/Akt通路對炎性因子水平的影響（pg/mL±s）

組別對照組模型組CXLZF組LY294002組CXLZF+LY294002組n 6 6 6 6 6 NF-κB 92.47±7.53 342.85±38.19 186.01±16.25**273.37±29.08*214.70±19.49**TNF-α 105.24±12.06 514.83±48.31 275.62±21.38**390.74±42.9*321.55±37.48**TGF-β 279.33±21.84 123.05±12.57 231.76±28.39**159.55±18.73 225.4±24.68**IL-10 240.18±19.27 95.67±8.22 193.07±26.34**144.79±10.35 177.64±29.15**

3 討 論

AS是大多數(shù)心腦血管疾病的共同病理基礎，炎癥是貫穿AS發(fā)病全過程的重要病機［4-5］。因此，抑制炎癥一直是AS臨床防治中的一項重要舉措。AS中醫(yī)辨證為痰濕瘀毒互結(jié)之證，治則以祛濕解毒活血為要。中藥從心論治方從對冠心病及AS療效顯著的定心方優(yōu)化而來［6-7］，主要依據(jù)“心主血脈”的中醫(yī)理論，取定心方中主入心經(jīng)的4味藥材組合而成。君藥為入中焦脾胃肝膽經(jīng)之黃連，取其清熱祛濕解毒功效，臣以入心、肝經(jīng)之丹參活血化瘀消癰，佐以酸棗仁養(yǎng)心補肝，寧心安神，以靈芝滋補強壯為使藥，以緩和君藥黃連之苦寒。4味藥材共奏清熱祛濕、活血解毒、扶正益氣之功效。

實驗表明，從心論治方能有效減輕高脂誘導ApoE敲除小鼠主動脈AS損傷，延緩粥樣斑塊進展，降低血清TC、TAG與LDL-C濃度，升高HDL-C水平，減輕小鼠肝臟脂肪變性損傷，并且能顯著調(diào)節(jié)T淋巴細胞免疫網(wǎng)絡［8］，提示從心論治方抗AS損傷的機制可能與抗炎與調(diào)脂有關。

AS是一種慢性炎癥性疾病，其早期階段與血管內(nèi)皮細胞中ox-LDL、氧化應激、黏附分子和炎性細胞因子水平的升高有關［9-10］。本研究發(fā)現(xiàn)，100 μg/mL ox-LDL對HUVEC細胞活力無顯著影響，但能明顯促進細胞凋亡，并且誘導細胞分泌促炎因子NF-κB和TNF-α，增加細胞內(nèi)LDH釋放。CXLZF含藥血清干預后，能顯著抑制細胞凋亡、增加細胞內(nèi)抗炎因子TGF-β與IL-10的濃度，上調(diào)GSH水平，增強細胞抗氧化能力。本實驗結(jié)果提示，CXLZF含藥血清能減輕ox-LDL誘導HUVEC損傷，可能與抗炎及抗氧化損傷有關。

細胞凋亡是由基因控制的細胞自主的有序的死亡，在AS小鼠體內(nèi)，其水平顯著增加［11］。本實驗使用eGFP Annexin V/PI檢測試劑盒觀測各組HUVEC凋亡情況，發(fā)現(xiàn)ox-LDL能顯著增加HUVEC凋亡程度，含藥血清10%、20%組凋亡率明顯降低，提示CXLZF藥物血清能減輕ox-LDL誘導的HUVEC凋亡，能有效保護細胞，但其機制不清。

為進一步明確CXLZF是否能改善HUVEC的抗氧化能力，分別檢測了細胞內(nèi)LDH和GSH水平。LDH存在于正常細胞的胞質(zhì)中，一旦細胞膜受損即被釋放到細胞外。GSH是一種低分子自由基清除劑，可以清除O2、H2O2、LOOH?；謴蜋C體GSH水平，可以抑制單核細胞分化和炎癥因子的產(chǎn)生，部分地減輕動脈粥樣硬化損傷［12］。本實驗顯示ox-LDL能顯著誘導細胞分泌LDH，而對GSH含量影響不大，而含藥血清10%、20%組能明顯增加細胞GSH分泌量，而減少LDH分泌量，顯著提高細胞抗氧化能力，提示CXLZF具有抗氧化作用。

ox-LDL不僅能誘導細胞氧化應激，還能導致其炎癥損傷。既往研究已證實CXLZF能減輕ApoE敲除小鼠血清NF-κB和TNF-α水平，但對HUVEC作用未知。本研究中，10%、20% CXLZF含藥血清能顯著抑制細胞內(nèi)促炎因子NF-κB、TNF-α分泌，增加抗炎因子TGF-β與IL-10濃度，從而有效減輕ox-LDL誘導的HUVEC炎癥損傷。炎癥的發(fā)生受一系列細胞信號通路調(diào)控，其中PI3K/Akt通路研究最廣泛。激活PI3K/Akt信號通路可抑制HUVEC細胞凋亡，減輕氧化應激，提高細胞活力改善細胞形態(tài)，并抑制AS斑塊的發(fā)展［10，13-17］。Western blotting結(jié)果顯示，CXLZF能顯著誘導Akt Ser473位點磷酸化，激活PI3K/Akt通路，從而減輕ox-LDL誘導的細胞炎癥損傷。采用LY294002特異性阻斷PI3K/Akt通路后，NF-κB和TNF-α水平升高、而TGF-β與IL-10濃度降低，CXLZF能部分逆轉(zhuǎn)LY294002的致炎作用，說明CXLZF減輕HUVEC炎癥損傷可能主要通過激活PI3K/Akt通路實現(xiàn)。

綜上所述，CXLZF可減輕ox-LDL所造成的HUVEC損傷，機制可能涉及抗炎和抗氧化兩方面，主要通過誘導Akt Ser473位點磷酸化，激活PI3K/Akt通路來起作用。