劉 璐，王雪梅，王 巖，席紅梅，郭建多，黃求進(jìn)

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腦卒中癲癇病房，哈爾濱 150001

膠質(zhì)瘤是源自神經(jīng)上皮的惡性腫瘤，研究表明，電磁輻射及環(huán)境致癌因素與其發(fā)生有關(guān)[1]。由于惡性腫瘤較強(qiáng)的侵襲性特征，其預(yù)后通常較差。傳統(tǒng)化療藥物對增生旺盛的細(xì)胞及生長活躍的組織有毒性，且易發(fā)生耐藥反應(yīng)，因此，選擇一種不良反應(yīng)少、可高效抑制膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞增殖的藥物，對患者預(yù)后極為重要。吳茱萸堿具有利尿、消炎、鎮(zhèn)痛、降血壓、抗腫瘤等藥理作用，臨床上已經(jīng)用于乳腺癌、宮頸癌、肝癌、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌及白血病的治療[2- 3]。本研究觀察了吳茱萸堿對體外培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其可能機(jī)制。

材料和方法

材料人膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所)，吳茱萸堿注射液(上海源葉生物科技有限公司)，RPMI- 1640培養(yǎng)基(杭州四季青公司)，CCK- 8試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，F(xiàn)ITC Annexin V凋亡檢測試劑盒(南京建成生物研究所)，Cleaved Caspase- 3及Cleaved Caspase- 9(上海碧云天公司)。

細(xì)胞培養(yǎng)將膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞用含10 %胎牛血清的RPMI- 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml，培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5 %。

膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞分組將SHG- 44細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中，分為4組，每組5個(gè)復(fù)孔，具體為：(1)對照組：以正常培養(yǎng)液培養(yǎng)；(2)吳茱萸堿組：依吳茱萸堿濃度不同分為1、10、100 μg/ml 3個(gè)亞組。

CCK- 8法觀察細(xì)胞活性膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞接種于96孔板中，每孔200 μl，細(xì)胞密度為1×104個(gè)/ml，觀察細(xì)胞貼壁后按上述分組方法加入濃度不同的吳茱萸堿，同時(shí)設(shè)置空白孔(有培養(yǎng)基，無細(xì)胞)，孵育24 h后將藥物吸出，PBS輕輕沖洗3次，每孔分別加入20 μl已配置含10%CCK- 8溶液，培養(yǎng)1 h后測定450 nm各孔的吸光值。

FITC Annexin V細(xì)胞凋亡檢測用不含EDTA的胰酶消化膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞后制備細(xì)胞懸液，1000 r/min(r=10 cm)離心5 min并收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，收集細(xì)胞并用100 μl緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V 和10 μl PI，輕輕混勻，避光反應(yīng)10 min后再次加入100 μl緩沖液，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后用PBS洗滌細(xì)胞2次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min后PBS充分沖洗固定液，加入2 μl Hoechst 33258染色液，避光反應(yīng)10 min后PBS充分沖洗，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)2.5%戊二醛溶液固定膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞2 h，PBS清洗細(xì)胞3次后用1%～2%的鋨酸固定3 h，PBS清洗細(xì)胞3次，乙醇梯度脫水后丙酮置換3次，將樣品放入盛有純包埋劑的包埋板中，1%四氧化鋨后固定并做成厚度50～90 nm的超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛分別染色10 min。

Western blot法檢測細(xì)胞內(nèi)Cleaved Caspase- 3及Cleaved Caspase- 9的蛋白表達(dá)提取蛋白質(zhì)后以Brandford法測定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。加入上樣緩沖液，行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后5%的脫脂奶粉4℃封閉2 h，加一抗(稀釋濃度1∶1000)過夜，室溫下孵育二抗(稀釋濃度1∶2000)1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法自顯影并采集圖像，利用樣本目的蛋白的光密度比內(nèi)參條帶的光密度，比較不同樣本的相對表達(dá)率。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差，兩兩比較采用LSD-t法，組間比較采用單因素方差分析；趨勢分析采用python對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，兩兩比較采用OLS-F假設(shè)性檢驗(yàn)法；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

不同濃度吳茱萸堿對膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞增殖率的影響MTT法檢測結(jié)果顯示，1、10、100 μg/ml吳茱萸堿組膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞的增殖率分別為(66.33±4.32)%(t=4.935，P=0.0078)、(54.09±4.05)%(t=5.399，P=0.0057)、(33.67±3.37)%(t=15.360，P=0.0001)，均明顯低于對照組的(94.00±3.11)%。趨勢檢驗(yàn)結(jié)果顯示，多元回歸相關(guān)性系R值為0.712，計(jì)算出的F值為0.8290，遠(yuǎn)大于理論F值的0.0987，多元線性回歸顯著，膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞增殖率隨吳茱萸堿濃度升高而下降。

吳茱萸堿促進(jìn)膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡流式檢測結(jié)果顯示，1、10、100 μg/ml吳茱萸堿組的SHG- 44細(xì)胞凋亡率分別為(21.48±3.11)%(t=4.337，P=0.0123)、(42.67±4.47)%(t=15.900，P=0.0007)、(65.54±4.06)%(t=18.030，P=0.0001)，均明顯高于對照組的(1.00±0.45)%(圖1)。趨勢檢驗(yàn)結(jié)果顯示，多元回歸的相關(guān)性系數(shù)R值為0.839，計(jì)算出的F值為0.1736，遠(yuǎn)大于理論F值的0.0987，多元線性回歸顯著，膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞增殖凋亡率隨吳茱萸堿濃度的升高而升高。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測吳茱萸堿對膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞凋亡率的影響

Hoechst 33258核染色法觀察各組膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞凋亡Hoechst 33258核染色結(jié)果顯示，隨著吳茱萸堿作用濃度遞增，發(fā)生凋亡反應(yīng)的膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞核數(shù)量亦遞增(圖2)。1、10、100 μg/ml吳茱萸堿組的SHG- 44細(xì)胞凋亡率分別為(15.00±2.31)%(t=4.260，P=0.0131)、(41.33±4.07)%(t=12.151，P=0.0003)、(42.00±4.22)%(t=13.330，P=0.0002)，均明顯高于對照組的(4.00±1.16)%。

圖2 細(xì)胞染色檢測吳茱萸堿對膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞凋亡率的影響(×200)

電鏡檢測結(jié)果對照組膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞形態(tài)正常，胞體飽滿，核膜、質(zhì)膜完整；吳茱萸堿組膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞腫脹，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器碎片樣分散，可觀察到空泡樣結(jié)構(gòu)(自噬溶酶體水解其內(nèi)容物后的產(chǎn)物)，伴隨吳茱萸堿濃度升高，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)破壞明顯(圖3)。

圖3 電鏡觀察膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞改變(×10 000)

吳茱萸堿對Cleaved Caspase- 3及Cleaved Caspase- 9蛋白的影響Western blot檢測結(jié)果顯示，吳茱萸堿對膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞中Cleaved Caspase- 3及Cleaved Caspase- 9蛋白表達(dá)具有明顯的上調(diào)作用(圖4)。1、10、100 μg/ml吳茱萸堿組Cleaved Caspase- 3的蛋白相對表達(dá)量分別為(68.91±4.86)%(t=4.176，P=0.014)、(80.06±2.73)%(t=8.450，P=0.0011)、(106.30±4.52)%(t=11.160，P=0.0004)，均明顯高于對照組的(44.67±3.17)%。對照組，1、10、100 μg/ml吳茱萸堿組Cleaved Caspase- 9的相對表達(dá)量分別為(25.81±3.00)%、(27.33±3.71)%、(78.17±5.50)%、(103.60±6.83)%，其中，10(t=8.358，P=0.0011)、100 μg/ml吳茱萸堿組(t=10.43，P=0.005)明顯高于對照組，1 μg/ml吳茱萸堿組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.319，P=0.7657)。

圖4 吳茱萸堿對膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞內(nèi)Cleaved Caspase- 3及Cleaved Caspase- 9表達(dá)的影響

討 論

由于膠質(zhì)瘤生長位置的特殊性及侵襲性浸潤的特性，手術(shù)和放療仍難免復(fù)發(fā)，化療及靶向治療在膠質(zhì)瘤的治療中逐漸發(fā)揮重要作用[4- 5]。手術(shù)切除病灶及放射治療均為局部治療，而化學(xué)藥物治療是全身治療，對于臨床檢查不能發(fā)現(xiàn)的潛在性病灶也有治療作用。治療膠質(zhì)瘤的化療藥物種類較多，均有不同程度的不良反應(yīng)，而且化療藥物選擇性不強(qiáng)，在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對人體正常免疫防御系統(tǒng)中的細(xì)胞及組織(軟骨細(xì)胞、淋巴組織細(xì)胞、生長發(fā)育旺盛的血液)也有殺傷作用，而人體免疫系統(tǒng)遭到破壞后，癌癥會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)散，造成嚴(yán)重后果[6- 7]。

吳茱萸堿是由中藥吳茱萸提取加工而制成的吲哚喹唑啉生物堿，其抗腫瘤作用體現(xiàn)在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)自噬、阻滯腫瘤細(xì)胞生長周期和抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等多個(gè)方面[8- 10]。而且吳茱萸堿是一種天然易獲得的抗癌藥物，具備低毒、價(jià)格低廉的特點(diǎn)，擁有廣闊的研究和應(yīng)用前景。以往研究顯示，吳茱萸堿可以通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，激活MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡[11]，但是對膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞的作用及機(jī)制尚未見報(bào)道。本研究選擇膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞作為研究對象，該細(xì)胞貼壁生長，經(jīng)傳代后3 d時(shí)間可長滿培養(yǎng)板，易于形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果顯示，吳茱萸堿對膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞的增殖抑制作用呈劑量依賴性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證吳茱萸堿對膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，本研究分別采用流式細(xì)胞技術(shù)及Hoechst 33258核染色法觀察細(xì)胞凋亡，兩種檢測結(jié)果均表明，吳茱萸堿可以劑量依賴性促進(jìn)膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞凋亡。此外，電鏡觀察結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)吳茱萸堿對膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞形態(tài)的改善作用。

為探明吳茱萸堿促進(jìn)膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，本研究采用Western blot方法檢測了細(xì)胞內(nèi)凋亡指標(biāo)Cleaved Caspase- 3及Cleaved Caspase- 9的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，吳茱萸堿促進(jìn)凋亡信號(hào)分子Cleaved Caspase- 3及Cleaved Caspase- 9的表達(dá)從而發(fā)揮相關(guān)生物學(xué)效應(yīng)。

綜上，本研究結(jié)果顯示，吳茱萸堿可能是通過改變Cleaved Caspase- 3及Cleaved Caspase- 9蛋白的表達(dá)，抑制膠質(zhì)瘤SHG- 44細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，這為吳茱萸堿在膠質(zhì)瘤中的治療提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。