沉默miRNA210可能通過低氧誘導(dǎo)因子-血管內(nèi)皮生長因子途徑減輕心肌炎時心肌細(xì)胞的損傷

李海文，楊志明，高福萍，張瑞琴，柴蟬娟

1山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科，太原 030001 2中國科學(xué)院高能物理研究所納米生物效應(yīng)與安全性研究室，北京 100049

心肌炎是一種與心功能不全相關(guān)的心肌炎癥性疾病，可通過組織病理學(xué)、免疫學(xué)和免疫組織化學(xué)來診斷[1]。心肌炎由多種病因引起，會導(dǎo)致心臟功能障礙，并可降低收縮和舒張功能及引起心律失常，常由感染、過敏反應(yīng)或免疫相關(guān)損傷引起[2]。細(xì)菌性心肌炎通常由細(xì)菌直接感染心肌或由細(xì)菌對心肌產(chǎn)生的毒素作用或細(xì)菌產(chǎn)物引起的過敏反應(yīng)引起，雖然致病因子多樣，但引起細(xì)菌性心肌炎的病原體主要是金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌、肺炎球菌和腦膜炎奈瑟菌等。細(xì)菌性心肌炎的臨床表現(xiàn)往往取決于病變的程度，病變較輕可能沒有癥狀，但嚴(yán)重者可能會造成患者猝死。目前關(guān)于心肌炎的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，因此加強(qiáng)心肌炎的研究具有重要意義。

miRNA是20～26個核苷酸組成的小分子，具有保守的單鏈編碼RNA序列[3]，參與機(jī)體調(diào)節(jié)功能，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、血管生成、腫瘤形成和造血等[4]。研究表明，miRNA210是一種缺氧誘導(dǎo)的miRNA，在細(xì)胞面臨缺氧環(huán)境時上調(diào)，可在缺氧相關(guān)現(xiàn)象中發(fā)揮作用，如血管生成、細(xì)胞凋亡、分化、增殖、細(xì)胞周期調(diào)控、線粒體代謝、DNA損傷修復(fù)和腫瘤生長[5]。miRNA也存在于細(xì)胞分泌的外泌體中，作為干細(xì)胞-外泌體miRNA的一種，miRNA210可通過增強(qiáng)心肌細(xì)胞存活和功能及減弱心臟纖維化而具有心臟保護(hù)作用[6]，能在多種低氧組織和細(xì)胞中表達(dá)，并在低氧環(huán)境中受到低氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor 1，HIF1)的調(diào)節(jié)。本研究觀察了miRNA210在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)心肌炎時對于心肌細(xì)胞大鼠原代心肌的作用及其內(nèi)在機(jī)制。

材料和方法

材料ELISA試劑盒購自銳博生物技術(shù)有限公司，凋亡試劑盒(貨號：556547)購自美國BD公司，抗(大鼠)bcl- 2(3498T)、bax(2772T)、caspase- 3(9662S)、HIF1(36169T)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抗體購自德國CST公司，DMEM和FBS三抗培養(yǎng)基購自碧云天生物技術(shù)有限公司，2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol，2ME)購自美國Selleck公司。

大鼠原代心肌細(xì)胞的分離提取和分組用于分離原代心肌細(xì)胞的3 d新生SD大鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，動物許可證號碼：SCXK-(軍)2012- 0004。 SD大鼠經(jīng)尾靜脈注射麻醉劑后取心房和心室，采用膠原酶Ⅰ(美國Sigma-Aldrich公司)將心臟組織解離為單細(xì)胞懸液。將分離的細(xì)胞置于含20%FBS、美國洛根和抗生素(100 U/U)的DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)中培養(yǎng)。在6孔板中以鋪板密度為5×105/ml，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h。隨后用心肌細(xì)胞特異性標(biāo)記輔肌動蛋白α2(recombinant actinin alpha 2，ACTN2)的抗體進(jìn)行免疫熒光染色鑒定。大鼠原代心肌分為以下4組：(1)對照組：離體培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中滴加生理鹽水100 μl；(2)LPS組：離體培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中滴加10 μmol/L LPS 100 μl；(3)LPS+miRNA210 mimic組：離體培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中滴加10 μmol/L LPS 100 μl和miRNA210 mimic 100 μl；(4)LPS+miRNA199a siRNA組：離體培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中滴加10 μmol/L LPS 100 μl和miRNA199a siRNA 100 μl。

CCK8法觀察細(xì)胞活力細(xì)胞鋪板貼壁后進(jìn)行siRNA感染，感染24 h后，進(jìn)行100 nmol/L模擬物藥物干預(yù)及10 μmol/L LPS干預(yù)，24 h時采用CCK8(日本同仁公司)法于450 nm波長處測量吸光度。

ELISA法測量大鼠原代心肌細(xì)胞白細(xì)胞介素1β和腫瘤壞死因子α含量干預(yù)處理后，收集各組大鼠原代心肌細(xì)胞上清，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。隨后在酶標(biāo)儀450 nm波長處測量標(biāo)準(zhǔn)品及樣品。

流式細(xì)胞儀檢測大鼠原代心肌細(xì)胞凋亡率細(xì)胞鋪板后進(jìn)行干預(yù)處理24 h，收集上清，無EDTA胰酶消化收集細(xì)胞沉淀后，用200 μl AV Buffer重懸；取30 μl，加入5 μl AV抗體10 μl避光，常溫孵育30 min。上機(jī)前，孵育PI，上機(jī)測量凋亡率。

Western blot檢測各凋亡蛋白及內(nèi)在通路HIF1-VEGF蛋白表達(dá)情況細(xì)胞鋪板干預(yù)處理后，提取蛋白裂解液后，15000 r/min(r=15 cm)離心15 min，取上清與上樣緩沖液按5×比例混合后置于100℃水浴鍋中使蛋白變性10 min，進(jìn)行蛋白凝膠電泳及顯像分析。

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

大鼠原代心肌細(xì)胞活力檢測結(jié)果CCK8法檢測結(jié)果顯示，經(jīng)過miRNA210模擬物和siRNA干預(yù)后，大鼠原代心肌細(xì)胞活力分別為(0.32±0.02)%(t=0.000，P=1.000)和(0.51±0.01)%(t=0.686，P=0.500)，與對照組的(0.89±0.02)%差異無統(tǒng)計學(xué)意義。對照組、LPS組、LPS+miRNA210 mimic組和LPS+miRNA199a siRNA組的心肌細(xì)胞活力分別為(0.89±0.02)%、(0.23±0.01)%、(0.18±0.01)%和(0.42±0.02)%，其中，LPS組低于對照組(t=8.764，P<0.001)，LPS+miRNA210 mimic組低于LPS組(t=6.995，P<0.001)，LPS+miRNA199a siRNA組高于LPS+miRNA210mimic組(t=3.576，P=0.012)。

心肌細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)情況ELISA檢測結(jié)果顯示，對照組、LPS組、LPS+miRNA210 mimic組、LPS+miRNA199a siRNA組的白細(xì)胞介素(interleukin，IL)- 1β和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α表達(dá)水平分別為(20.15±2.25)和(6.85±1.16)、(42.09±2.56)和(20.18±1.76)、(64.32±5.67)和(31.46±3.09)、(31.02±3.07)pg/ml和(12.96±2.12)pg/ml。其中，LPS組的IL- 1β(t=4.166，P=0.014)和TNF-α(t=6.309，P=0.003)表達(dá)水平明顯高于對照組，LPS+miRNA210 mimic組的IL- 1β(t=4.096，P=0.015)和TNF-α(t=4.424，P=0.011)表達(dá)水平明顯高于LPS組，LPS+miRNA199a siRNA組的IL- 1β(t=4.287，P=0.012)和TNF-α(t=3.577，P=0.023)水平明顯低于LPS組。

大鼠原代心肌細(xì)胞凋亡情況流式細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，對照組、LPS組、LPS+miRNA210 mimic組和LPS+miRNA199a siRNA組的細(xì)胞凋亡率分別為(20.31±2.61)%、(50.24±2.59)%、(64.60±3.94)%和(33.78±3.27)%，其中，LPS組的凋亡率明顯高于對照組(t=32.780，P<0.001)，LPS+miRNA210 mimic組明顯高于LPS組(t=7.412，P=0.002)，LPS+miRNA199a siRNA組明顯低于LPS組(t=11.720，P<0.001)(圖1)。

圖1 大鼠原代心肌細(xì)胞的凋亡情況

大鼠原代心肌細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)情況Western blot檢測結(jié)果顯示，對照組、LPS組、LPS+miRNA210 mimic組和LPS+miRNA199a siRNA組的bcl- 2相對表達(dá)水平分別為1252.69±96.79、521.82±50.39、320.18±35.77和856.32±72.10，bax相對表達(dá)水平分別368.27±36.95、892.36±72.69、1120.85±90.26和612.85±52.10，caspase- 3相對表達(dá)水平分別268.76±30.27、650.12±55.39、811.96±62.30和429.86±39.65。其中，LPS組的bcl- 2表達(dá)明顯低于對照組(t=8.346，P=0.001)，bax(t=12.890，P<0.001)和caspase- 3表達(dá)(t=4.331，P=0.012)明顯高于對照組；LPS+miRNA210 mimic組的bcl- 2表達(dá)明顯低于LPS組(t=6.074，P=0.003)，bax(t=5.376，P=0.022)和caspase- 3表達(dá)(t=5.859，P=0.004)明顯高于LPS組；而LPS+miRNA199a siRNA組bcl- 2表達(dá)明顯高于LPS組(t=3.873，P=0.017)，bax(t=5.205，P=0.006)和caspase- 3表達(dá)(t=2.800，P=0.040)明顯低于LPS組。對照組、LPS組、LPS+miRNA210 mimic組、LPS+miRNA199a siRNA組的HIF1和VEGF相對表達(dá)水平分別為456.58±49.85和526.86±55.29、1119.71±85.99和901.20±75.12、1589.65±129.71和1123.80±102.57、685.63±60.20和650.12±56.05。其中，LPS組的HIF1(t=10.380，P=0.001)和VEGF表達(dá)(t=4.973，P=0.008)明顯高于對照組，LPS+miRNA210 mimic組的HIF1(t=8.952，P=0.001)和VEGF表達(dá)(t=11.203，P=0.001)明顯高于LPS組，LPS+miRNA199a siRNA組的HIF1(t=3.893，P=0.017)和VEGF表達(dá)(t=3.181，P=0.033)明顯低于LPS組(圖2)。

VEGF：血管內(nèi)皮生長因子；HIF1：低氧誘導(dǎo)因子1

HIF1抑制劑2ME對大鼠原代心肌細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響2ME應(yīng)用后逆轉(zhuǎn)了miRNA210模擬物的加重性效應(yīng)，LPS+miRNA210 mimic+2ME的bax(t=4.899，P=0.008)、HIF- 1α(t=2.833，P=0.047)、caspase- 3(t=2.877，P=0.045)和VEGF(t=2.994，P=0.040)表達(dá)明顯低于LPS組，bcl- 2表達(dá)明顯高于LPS組(t=3.392，P=0.017)(圖3)。

圖3 HIF1抑制劑2ME可以抑制miRNA210對LPS誘導(dǎo)大鼠原代心肌細(xì)胞凋亡蛋白的影響

討 論

HIF1是調(diào)節(jié)基因表達(dá)以響應(yīng)氧水平降低(缺氧)的轉(zhuǎn)錄因子[7]。在常氧狀態(tài)下，HIF1可以被脯氨酸羥化酶降解，因而在常氧下HIF1的表達(dá)水平降低[8]。一旦機(jī)體遭受損傷、炎癥等引起缺血缺氧狀態(tài)，機(jī)體內(nèi)脯氨酸羥化酶即可被降解進(jìn)而引起HIF1表達(dá)升高，隨后激活HIF1下游調(diào)控序列。有研究表明，在遭受輻射誘導(dǎo)的腸道損傷后，HIF1可以抑制凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，保護(hù)腸道上皮細(xì)胞免遭損傷[9]，表明HIF1在凋亡的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的作用。但目前在心血管系統(tǒng)中關(guān)于HIF1調(diào)控的凋亡損傷少有研究。有研究表明，在DSS誘導(dǎo)的小鼠腸炎中，敲除HIF1后腸道上皮細(xì)胞凋亡更加嚴(yán)重[10]，提示HIF1可能對于凋亡蛋白的調(diào)控具有重要作用。

人VEGF基因全長14kb，由8個外顯子和7個內(nèi)顯子組成。VEGF經(jīng)剪切后可以分為VEGF145、VEGF165、VEGF121、VEGF189和VEGF206 5個異構(gòu)體。目前發(fā)現(xiàn)的VEGF受體有VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、NP- 1和NP- 2共 5種[11]。VEGFR2是VEGF發(fā)揮生物學(xué)作用的主要受體，當(dāng)VEGF與VEGFR2結(jié)合后導(dǎo)致自身磷酸化位點(diǎn)被磷酸化進(jìn)而介導(dǎo)下游目的基因的轉(zhuǎn)錄，從而對機(jī)體細(xì)胞增殖、血管生成和細(xì)胞存活產(chǎn)生重要影響[12]。最近研究表明，LPS誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡是通過下調(diào)VEGFR實(shí)現(xiàn)的，其介導(dǎo)了bcl- 2、bax等相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)[13]。心肌細(xì)胞均表達(dá)HIF1與VEGF蛋白，Mathew等[14]研究認(rèn)為，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)的HIF1可以促進(jìn)VEGF的表達(dá)，提示HIF1-VEGF通路可能在心肌炎中扮演重要的作用[15]。心肌炎發(fā)生時，心肌細(xì)胞可能處于炎性滲出、耗氧量增加、心肌缺血等狀態(tài)，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，心肌細(xì)胞凋亡增加，引發(fā)惡性臨床事件。

近來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在心血管事件中可發(fā)揮重要作用，miRNA介導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷也被廣泛地進(jìn)行研究。本研究結(jié)果顯示，miRNA210可以抑制心肌炎心肌細(xì)胞的活力，因此我們推測miRNA210在心肌炎進(jìn)展時是一個不良信號。本研究還發(fā)現(xiàn)，在心肌炎發(fā)生時，miRNA210不僅可以促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡，還可進(jìn)一步促進(jìn)IL- 1β和TNF-α等炎癥因子的滲出，表明miRNA210不僅是一種不良信號，更是一種加重?fù)p傷的警示，miRNA210可能介導(dǎo)了心肌炎時心肌細(xì)胞的凋亡過程，促進(jìn)了心肌細(xì)胞不可逆的損傷。此外本研究結(jié)果顯示，在心肌炎時，缺血、缺氧或炎癥狀態(tài)可以上調(diào)HIF- 1α的表達(dá)，HIF- 1α在心肌炎時具有重要的研究意義。不僅如此，miRNA210還可以上調(diào)凋亡蛋白caspase- 3和bax的表達(dá)，下調(diào)bcl- 2蛋白的表達(dá)，并抑制HIF1介導(dǎo)的VEGF表達(dá)，表明沉默miRNA210可能是通過HIF1-VEGF途徑減輕心肌炎時心肌細(xì)胞的損傷。