槲皮素對人前列腺癌PC- 3細胞自噬及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路的影響

宋 靜，白吉祥，王書惠，劉倫翠，趙志軒

牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院 1泌尿外科 2中西醫(yī)結合·老年病科，黑龍江牡丹江 157011

前列腺癌是泌尿生殖系統(tǒng)好發(fā)的腫瘤之一，近年來在我國成為發(fā)病率、病死率升高最快的腫瘤，嚴重威脅男性健康[1- 2]。因此，尋找療效確切的抗前列腺癌藥物，可能成為提高前列腺癌治愈率的重要研究方向。近年來，天然藥物及其單體成分在抗腫瘤方面的研究取得很大進展。具有多靶點、低毒性、良好療效等的抗腫瘤中藥受到越來越多的關注。槲皮素是一種廣泛存在于蔬菜、水果及谷物等植物中的植源性黃酮類化合物，也存在于多種中草藥中，如款冬花、三七、高良姜、銀杏等。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有抗炎、抗過敏、抗病毒、擴張冠狀動脈，抗血小板聚集和抗氧化等藥理作用[3]。隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)槲皮素具有較強的腫瘤預防及治療作用，如宮頸癌、胰腺癌、直腸癌、胃癌、口腔癌、乳腺癌和肺癌等[4- 10]。也有研究表明，槲皮素可抑制人前列腺癌PC- 3細胞增殖，并誘導其凋亡[11- 13]。但是，目前關于槲皮素誘導PC- 3細胞自噬的研究卻鮮見報道。本研究觀察了槲皮素對PC- 3細胞活力、凋亡、自噬及磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路的影響，以期為槲皮素抗前列腺癌作用的深入研究和臨床應用提供參考。

材料和方法

材料人前列腺癌細胞株PC- 3購自中國科學院細胞庫，復蘇PC- 3 細胞，用10% FBS和1%青鏈雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。槲皮素(純度>98.0%)購自美國Sigma公司，槲皮素溶解于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，終濃度≤0.01%)配成200 μmol/L母液，-20℃保存，臨用時以RPMI1640培養(yǎng)基稀釋到所需濃度。FBS、RPMI1640培養(yǎng)基、GFP-LC3和雙抗生素均購自江蘇碧云天生物技術研究所，DMSO購自上海士鋒生物科技有限公司。CCK- 8檢測試劑盒和TUNLE凋亡檢測試劑盒均購自美國Abbkine公司，BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司。3-甲基腺嘌呤(3-MA，自噬抑制劑)、吖啶橙購自美國Sigma 公司，LC3 抗體、Beclin- 1 抗體、PI3K抗體、磷酸化-PI3K(p-PI3K)抗體、Akt抗體、磷酸化-Akt(p-Akt)抗體、mTOR 抗體、磷酸化-mTOR(p-mTOR)抗體及HRP標記二抗均購自美國Cell Signaling Technology公司。

CCK- 8細胞活力實驗檢測PC- 3細胞活力將處于對數(shù)生長期的PC- 3細胞以1×104個細胞/孔密度接種于96孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁后，加入不同濃度槲皮素(0、50、100、150、200 μmol/L)于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h后，在相應時間點分別加入10 μl/孔CCK- 8混勻，37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育90 min。酶標儀測定在450nm處的OD值。以空白培養(yǎng)液作為空白對照組，計算細胞活力：細胞活力(%)=(OD實驗組-OD空白對照組)/(OD0 μmol/L槲皮素-OD空白對照組)×100%。每組設6個復孔，取平均值。

TUNEL法檢測PC- 3細胞凋亡參照CCK- 8細胞活力實驗結果，將處于對數(shù)生長期的PC- 3細胞以5×105個細胞/孔密度接種于6孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2飽和濕度下過夜培養(yǎng)。加入不同濃度槲皮素[0(對照組)、50、100、150、200 μmol/L]，37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。嚴格按照TUNEL凋亡檢測試劑盒說明書檢測PC- 3細胞凋亡指數(shù)。凋亡細胞核發(fā)出綠色熒光，未凋亡細胞核發(fā)出藍色熒光。熒光顯微鏡下觀察PC- 3細胞核熒光變化并計數(shù)，計算凋亡指數(shù)：凋亡指數(shù)(%)=(凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù))×100%。每個劑量組隨機選取6個高倍視野(×200)，取平均值。

吖啶橙染色觀察PC- 3細胞自噬小泡將處于對數(shù)生長期的PC- 3細胞以4×106個細胞/ml密度爬片，綜合CCK- 8細胞活力實驗和TUNEL染色結果，隨機分為：(1)對照組：給予0 μmol/L槲皮素；(2)槲皮素組：給予100 μmol/L槲皮素；(3)3-MA組：給予5 mmol/L 3-MA；(4)槲皮素+3-MA組：給予100 μmol/L槲皮素+5 mmol/L 3-MA。37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用PBS漂洗3次后，滴加新配制的1 mg/L吖啶橙染色液，37℃避光孵育15 min，吸去吖啶橙染色液，用PBS漂洗3次。50%甘油封片，置于倒置熒光顯微鏡下觀察酸性的自噬小泡，每個劑量組隨機選取6個視野。

GFP-LC3質(zhì)粒轉染分析觀察PC- 3細胞自噬小體將處于對數(shù)生長期的PC- 3細胞以4×106個細胞/ml密度爬片，待細胞生長融合度達到50%后，根據(jù)Lipofectamine TM2000說明書將GFP-LC3質(zhì)粒轉染PC- 3細胞，6～8 h后更換新的培養(yǎng)液，37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將轉染后的PC- 3細胞分組及給藥同“吖啶橙染色實驗”。37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，置于倒置熒光顯微鏡下觀察酸性的自噬小體，每個劑量組隨機選取6個視野。

Western blot分析檢測自噬相關蛋白和PI3K/Akt/mTOR 信號通路蛋白的表達將處于對數(shù)生長期的PC- 3細胞以5×105個細胞/孔密度接種于6孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細胞貼壁后，分別加入0(對照組)、100、150 μmol/L槲皮素，37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；棄去培養(yǎng)液，PBS漂洗3 次；用RIPA細胞裂解液在冰上進行裂解，提取總蛋白；4℃16 000×g離心5 min，取上清。BCA法測定總蛋白濃度，按4∶1加入Loading Buffer，100℃煮樣5 min；取30 μg蛋白上樣進行10%SDS-PAGE凝膠電泳；轉印到PVDF上；5%脫脂牛奶或牛血清白蛋白室溫封閉1 h；一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min；加入相應二抗室溫慢搖孵育1 h，TBST 洗膜3次，每次10 min。ECL化學發(fā)光試劑顯色，凝膠成像系統(tǒng)對各組條帶進行計值及統(tǒng)計分析。每組設6個復孔，取平均值。

統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗；采用bonforroni多重校正方法進行多組間差異的兩兩比較；P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

槲皮素抑制PC- 3細胞活力CCK- 8細胞活力實驗檢測結果顯示，隨著處理濃度增大和處理時間延長，槲皮素對PC- 3細胞活力的抑制作用明顯增強，且呈一定的濃度-時間依賴關系(圖1)。處理24、48、72 h后，槲皮素對PC- 3細胞IC50分別為158.6、107.8、79.1 μmol/L。

圖1 槲皮素抑制PC- 3細胞活力

槲皮素促進PC- 3細胞凋亡TUNEL染色結果顯示，槲皮素50、100、150、200 μmol/L組的凋亡指數(shù)分別為(7.91±0.84)%、(20.69±2.34)%、(48.74±5.55)%、(62.91±6.69)%，其中，100(t=5.437，P=0.016)、150(t=7.390，P=0.002)、200 μmol/L組(t=7.944，P=0.001)的凋亡指數(shù)明顯高于對照組的(7.26±0.78)%，50 μmol/L組與對照組差異無統(tǒng)計學意義(t=0.559，P=0.605)(圖2)。

A.對照組；B.槲皮素50 μmol/L；C.槲皮素100 μmol/L；D.槲皮素150 μmol/L；E.槲皮素200 μmol/L

槲皮素增加PC- 3細胞自噬小泡數(shù)量吖啶橙染色結果顯示，槲皮素組PC- 3細胞中的紅色熒光明顯較強；槲皮素+3-MA組PC- 3細胞中也可見紅色熒光，但是較槲皮素組弱；對照組和3-MA組PC- 3細胞中基本未見紅色熒光，幾乎無自噬小泡(圖3)。

A.對照組；B.槲皮素組；C.3-MA組；D.槲皮素+3-MA組

槲皮素增加PC- 3細胞自噬小體形成GFP-LC3質(zhì)粒轉染分析結果顯示，槲皮素組轉染GFP-LC3的PC- 3細胞中可見綠色點狀自噬小體；槲皮素+3-MA組轉染GFP-LC3的PC- 3細胞中也可見出現(xiàn)綠色點狀的自噬小體，但是較槲皮素組少；對照組和3-MA組PC- 3細胞中極少有自噬小體形成(圖4)。

A.對照組；B.槲皮素組；C.3-MA組；D.槲皮素+3-MA組

槲皮素升高PC- 3細胞自噬相關蛋白表達Western blot檢測結果顯示，槲皮素組PC- 3細胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(t=6.007，P=0.004)和Beclin- 1表達(t=4.778，P=0.009)均顯著高于對照組，3-MA組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(t=0.900，P=0.419)和Beclin- 1表達(t=2.485，P=0.068)與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，槲皮素+3-MA組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(t=0.139，P=0.896)和Beclin- 1表達(t=2.710，P=0.054)與對照組相比差異也無統(tǒng)計學意義；3-MA組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(t=5.564，P=0.005)和Beclin- 1表達(t=6.608，P=0.003)顯著低于槲皮素組，槲皮素+3-MA組PC- 3細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(t=6.022，P=0.004)和Beclin- 1表達(t=6.737，P=0.003)也顯著低于槲皮素組(圖6)。

槲皮素通過PI3K/Akt/mTOR 信號通路誘導PC- 3細胞發(fā)生自噬Western blot檢測結果顯示，槲皮素100 μmol/L組PC- 3細胞的PI3K(t=0.103，P=0.925)、Akt(t=0.241，P=0.821)和mTOR表達(t=0.206，P=0.847)與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，p-PI3K(t=4.613，P=0.010)、p-Akt(t=4.506，P=0.011)和p-mTOR表達(t=3.578，P=0.0.023)顯著低于對照組；槲皮素150 μmol/L組PC- 3細胞的PI3K(t=0.271，P=0.795)、Akt(t=0.512，P=0.636)和mTOR表達(t=0.277，P=0.795)與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，p-PI3K(t=5.798，P=0.004)、p-Akt(t=6.071，P=0.004)和p-mTOR表達(t=4.553，P=0.011)顯著低于對照組(圖6)。

與對照組比較，aP<0.01；與槲皮素組比較，bP<0.01

PI3K：磷脂酰肌醇3激酶；p-PI3K：磷酸化磷脂酰肌醇3激酶；Akt：蛋白激酶B；p-Akt：磷酸化蛋白激酶B；mTOR：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；p-mTOR：磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01

討 論

本研究結果發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有呈濃度-時間依賴性抑制PC- 3細胞活力的作用，亦具有明顯誘導PC- 3細胞凋亡的作用，以上結果均與以往研究結果相一致[11-13]。用槲皮素處理PC- 3細胞24 h后，當槲皮素濃度(50、100、150 μmol/L)較低時，對PC- 3細胞未見明顯細胞毒性作用，而濃度(200 μmol/L)較高時，PC- 3細胞活力顯著受到抑制。為了探討槲皮素自身沒有細胞毒性的處理濃度對PC- 3細胞自噬的影響，綜合TUNEL染色實驗結果，本研究后續(xù)實驗采用100、150 μmol/L為槲皮素的處理濃度。

自噬是一種將細胞中需要降解的細胞器及未折疊的蛋白等在溶酶體內(nèi)分解代謝的生物學過程[14]。大多數(shù)學者認為自噬是一種重要的細胞死亡機制。促進腫瘤細胞自噬活性甚至誘導自噬性死亡可以起到抗腫瘤作用[15]。LC3是自噬發(fā)生過程中非常重要的一個標志性蛋白。前體LC3蛋白合成之后經(jīng)過加工修飾形成LC3-Ⅰ型蛋白，自噬活化時LC3-Ⅰ酯化形成LC3-Ⅱ 型蛋白，并定位于自噬泡，因此其水平在一定程度上反映了自噬體的數(shù)量和自噬程度，也常作為自噬發(fā)生的一個指標[16- 17]。而Beclin- 1是哺乳動物參與自噬的特異性蛋白，是自噬的直接執(zhí)行者[18]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有明顯誘導PC- 3細胞自噬小泡數(shù)量和自噬小體形成的作用及明顯增加PC- 3細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin- 1的表達量，加入3-MA后自噬小泡數(shù)量和自噬小體形成則明顯減少及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin- 1的表達水平明顯下降。以上結果提示，槲皮素可能具有誘導PC- 3細胞自噬作用。

為闡明槲皮素誘導PC- 3細胞發(fā)生自噬的可能機制，本研究對PI3K/Akt/mTOR 信號通路中所涉及的一些關鍵蛋白進行了檢測。結果發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt/mTOR信號通路在自噬中發(fā)揮關鍵的調(diào)節(jié)作用，針對該信號通路選擇抑制性藥物治療腫瘤已經(jīng)取得較為滿意的效果[19]。PI3K屬于脂類激酶家族，是一種廣泛存在于胞質(zhì)內(nèi)的磷脂酰肌醇激酶，能被許多細胞因子受體活化，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類。PI3K/Akt/mTOR信號通路中PI3K主要指Ⅰ類PI3K，Ⅰ類PI3K激活絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt，之后通過一系列調(diào)控使mTOR磷酸化，從而抑制自噬[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有明顯抑制PC- 3細胞p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表達的作用。以上結果提示，槲皮素可能具有抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的作用。

綜上，本研究結果顯示，槲皮素可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導PC- 3細胞發(fā)生自噬。至于是否與其他機制有關，如Janus激酶/信號轉導子與轉錄激活子信號通路，今后將會做進一步探討。