miRNA132在抑郁癥患者及慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激抑郁模型大鼠中的表達(dá)

徐小紅，余正和，李 靜，李 軼，王姝琪，閆 盼，宋明芬，王晟東

杭州市第七人民醫(yī)院 1精神科 2心身科 3分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室 4影像科，杭州 310013

重度抑郁癥(major depressive disorder，MDD)是一個(gè)重要的社會公共衛(wèi)生問題，影響著全世界的患者。MDD可能導(dǎo)致患者社會心理障礙、生活質(zhì)量下降，發(fā)病率高，并伴隨著高致殘率和高死亡率[1]。盡管使用各種抗抑郁藥物治療抑郁癥，但至少50%的患者表現(xiàn)出較差的反應(yīng)[2]?？挂钟羲帉伟纺芟到y(tǒng)的快速作用已得到廣泛認(rèn)可，但對于長期治療的作用機(jī)制，目前尚無共識?？紤]到MDD的嚴(yán)重程度，了解其病因病理機(jī)制以及抗抑郁藥物的確切作用機(jī)制至關(guān)重要。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，miRNAs已經(jīng)成為一系列發(fā)育、生理和認(rèn)知過程的重要效應(yīng)物[3-4]。其中，miRNA132被認(rèn)為在神經(jīng)精神疾病過程中，特別是抑郁癥的發(fā)病機(jī)制和神經(jīng)機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5- 8]。此外，幾個(gè)與抑郁癥相關(guān)基因如MECP2、CREB和period基因被驗(yàn)證為miRNA132的靶點(diǎn)[9- 11]。慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)能夠下調(diào)腦源性生神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)，在抑郁癥的病理過程中起著至關(guān)重要的作用。miRNA132已經(jīng)被證明可通過BDNF，在腦神經(jīng)元可塑性和應(yīng)激反應(yīng)的基本機(jī)制中及在一些神經(jīng)精神疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。因此，推測miRNA132也可能在抑郁癥癥狀的發(fā)病機(jī)制和神經(jīng)機(jī)制中發(fā)揮重要作用。本研究觀察了抑郁癥患者外周血白細(xì)胞及抑郁癥模型大鼠血液和前額葉皮層中miRNA132的表達(dá)情況。

材料和方法

臨床樣本采集2017年3月至2018年5月在杭州市第七人民醫(yī)院精神科門診治療的首發(fā)抑郁癥患者(抑郁組)41例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《美國精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊》第5版抑郁的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)漢密爾頓抑郁量表(Hamilton depression scale，HAMD)評分≥17分；(3)漢族；(4)年齡18～45歲；(5)本人知情并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他精神疾??；(2)合并心腦血管及其他軀體疾??；(3)孕婦和哺乳期婦女；(4)酗酒、吸煙史≥1年、服用過精神活性物質(zhì)或鎮(zhèn)靜藥物。同期招募的健康志愿者(對照組)31例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～45歲的中國漢族；(2)HAMD評分≤7分；(3)體檢各項(xiàng)指標(biāo)合格；(4)本人知情并同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)心腦血管疾病及其他軀體疾??；(2)有精神障礙史；(3)孕婦及哺乳期婦女；(4)酗酒、吸煙量大、喝濃茶或咖啡依賴者、服用過精神活性物質(zhì)或鎮(zhèn)靜藥物。本研究經(jīng)杭州市第七人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者或近親屬知情并簽署同意書。

HAMD量表評估：HAMD量表評估由兩位副主任醫(yī)師完成。

血液樣本采集及處理：受試者入組后取靜脈血5 ml于EDTA抗凝管中，工作人員必須在2 h內(nèi)處理血液樣本，期間必須保存于低溫(4℃)。血液處理：加入3倍體積的紅細(xì)胞裂解液(天根生化科技)，混勻后室溫靜置5 min，10 000 r/min(r=5 cm)離心5 min，去上清取沉淀(白細(xì)胞)，加入Trizol(TaKaRa)試劑1 ml，混勻后于-80℃冰箱內(nèi)保存，待后續(xù)一起提取總RNA。

動物實(shí)驗(yàn)雄性SD大鼠24只，7周齡，體質(zhì)量200～250 g，購于浙江斯萊克實(shí)驗(yàn)動物中心。用白色塑料籠飼養(yǎng)，室溫控制在(22±2)℃，濕度為(50±10)%，保持12 h(6∶00～18∶00)循環(huán)照明，大鼠自由攝取食物與水。SD大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)區(qū)后先飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境，然后再開始后續(xù)實(shí)驗(yàn)。所有動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)杭州市第七人民醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過程盡量減少動物痛苦。

采用配對比較法將SD大鼠隨機(jī)分為對照組和CUMS組，每組12只。對照組大鼠每籠3只(糖水偏好實(shí)驗(yàn)時(shí)每籠1只)，CUMS組大鼠孤養(yǎng)。對照組大鼠正常喂食飼養(yǎng)，CUMS組大鼠在4周內(nèi)接受各種應(yīng)激，且對照組與其CUMS組大鼠分開不同房間飼養(yǎng)。CUMS的應(yīng)激方法參照以往文獻(xiàn)中的方法[12]，并做了部分調(diào)整，應(yīng)激方法包括以下幾種：(1)禁食24 h；(2)禁水24 h；(3)夜間傾斜籠子(45°)；(4)24 h晝夜顛倒；(5)冰水浴5 min；(6)潮濕墊料(100 g鋸末墊中溢出300 ml水)24 h；(7)1 min尾部擠壓(燕尾夾夾尾巴近體端1/3處)；(8)45℃熱水浴5 min；(9)水平振動(搖床，每秒1次)15 min。每天隨機(jī)選擇其中1或2種應(yīng)激，2 d內(nèi)不連續(xù)施加相同的應(yīng)激，應(yīng)激持續(xù)進(jìn)行4周。

在最后一次行為學(xué)檢測后，用戊巴比妥鈉(1%溶液，0.6 ml/100 g，腹腔注射)深度麻醉、犧牲大鼠。將軀干血收集到含有EDTA的冰預(yù)冷管中，部分以3000 r/min(r=5 cm)離心20 min，然后分離血漿分裝后于-80℃保存，用于后續(xù)皮質(zhì)酮水平測量；部分用紅細(xì)胞裂解液處理，分離出白細(xì)胞，用于提取RNA。同時(shí)，將大鼠的大腦迅速從顱骨中取出，在冰預(yù)冷的PBS緩沖液中清洗，置于預(yù)冷的金屬板上快速解剖大腦，分離前額葉皮層。將前額葉皮層在液氮中速凍后，于-80℃下保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

糖水偏好實(shí)驗(yàn)：同時(shí)給所有大鼠(每籠1只)2%蔗糖溶液和普通飲用水，大鼠可以在2%蔗糖溶液和飲用水中自由選擇，通過稱重計(jì)算出大鼠在2 h內(nèi)攝取蔗糖水和飲用水的量，并采用以下公式計(jì)算糖水偏好：糖水偏好=蔗糖溶液攝入量/(蔗糖溶液攝入量+飲用水?dāng)z入量)×100%。糖水偏好<65%的大鼠認(rèn)為快感缺失[13]。

強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)：強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swimming test，F(xiàn)ST)主要參考Ji等[14]所描述的方法，并進(jìn)行了一定的修改，具體為：在高為50 cm、直徑為30 cm的透明圓柱形塑料容器中加入約30 cm深的水，水溫保持在(22±2)℃(同室溫)。將大鼠放入容器中后，用EthoVision XT軟件記錄視頻，并分析大鼠7 min內(nèi)的不動時(shí)間(s)。

相關(guān)分子檢測

大鼠血漿皮質(zhì)酮水平檢測：大鼠血漿皮質(zhì)酮水平用皮質(zhì)酮(可的松酮)酶聯(lián)免疫試劑盒(德國IBL公司)測定，檢測方法參照試劑盒說明書，檢測不同樣本中所含皮質(zhì)酮水平(nmol/L)。

miRNA132表達(dá)水平測定：采用Trizol試劑進(jìn)行總RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(TaKaRa)進(jìn)行定量檢測，儀器為ABI公司的StepOne Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。miRNA132人源引物和大鼠引物均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。比較各組間miRNA132相對表達(dá)量。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

抑郁癥患者外周血白細(xì)胞miRNA132表達(dá)高于對照組抑郁癥患者外周血白細(xì)胞miRNA132水平為2.37±0.36，明顯高于對照組的1.34±0.16(t=2.355，P=0.0213)(圖1)。抑郁癥組患者外周血白細(xì)胞miRNA132表達(dá)水平與HAMD17得分呈顯著正相關(guān)(P=0.0004，rs=0.5303，n=41)(圖2)。

CUMS建模情況建模4周后，F(xiàn)ST顯示CUMS組大鼠不動時(shí)間為(72.67±2.95)s，明顯多于對照組的(40.00±5.49)s(t= 2.366，P=0.0395)；糖水偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CUMS組大鼠蔗糖消耗為(55.67±6.42)%，明顯低于對照組的(98.21±1.28)%(t=6.502，P<0.0001)；大鼠血漿皮質(zhì)酮水平檢測結(jié)果顯示，CUMS組大鼠血漿皮質(zhì)酮水平為(1396.0±254.9)nmol/L，明顯高于對照組的(557.3±158.4)nmol/L(t=2.795，P=0.0190)。

大鼠miRNA132的表達(dá)情況CUMS組大鼠血液中白細(xì)胞和前額葉皮層中的miRNA132表達(dá)水平分別為2.32±0.88和2.80±0.76，明顯高于對照組的1.18±0.36(t=2.273，P=0.0463)和0.99±0.23(t=2.553，P=0.0287)。

MDD：重度抑郁癥

HAMD：漢密爾頓抑郁量表

討 論

研究表明，miRNA132表達(dá)具有組織特異性，在神經(jīng)組織中高度表達(dá)，參與軸突生長、突觸增殖分化和神經(jīng)腫瘤形成過程[15]。神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中miRNA132的表達(dá)介導(dǎo)了BDNF的作用，而BDNF低水平與抑郁癥有關(guān)[16- 17]。本結(jié)果表明，MDD患者外周血樣本中miRNA132表達(dá)升高，與以往研究結(jié)果一致[2，11，18- 19]；相關(guān)性分析結(jié)果也提示抑郁癥患者的HAMD17評分與miRNA132水平呈正相關(guān)，且CUMS模型大鼠血液和前額葉皮層miRNA132表達(dá)升高，提示miRNA132可能是控制抑郁癥應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)元可塑性和神經(jīng)元存活的關(guān)鍵因素。

越來越多的證據(jù)表明，miRNAs對抑郁、焦慮和抗抑郁藥物的作用有重要作用。在一定的病理生理?xiàng)l件下，miRNAs被釋放到細(xì)胞外，可能通過出芽和微囊脫落等途徑進(jìn)入血液循環(huán)[20]。miRNA132參與軸突生長、增殖和突觸分化[15]。miRNA132在免疫系統(tǒng)中也有潛在的作用[21]。利用動物模型的行為學(xué)研究也表明miRNA132的重要作用：Hansen等[22]在小鼠前腦中過表達(dá)miRNA132，導(dǎo)致小鼠的識別記憶受損；Scott等[23]發(fā)現(xiàn)，miRNA132在大鼠嗅周皮層選擇性特異過表達(dá)與短期識別記憶損傷相關(guān)。而miRNA132與抑郁癥之間的因果關(guān)系還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究結(jié)果表明，臨床抑郁癥患者外周血miRNA132表達(dá)趨勢與抑郁模型大鼠的miRNA132表達(dá)趨勢一致；此外在抑郁模型大鼠中，血液中miRNA132表達(dá)與前額葉皮層中的表達(dá)也是一致的，血液中miRNA132表達(dá)可以在一定程度上反映前額葉皮層的miRNA132表達(dá)變化趨勢。

本研究存在以下局限性：(1)人群樣本量相對較??；(2)本組MDD患者沒有隨時(shí)間隨訪，因此很難確定miRNA132表達(dá)在抑郁癥狀改善中的變化。本研究結(jié)果僅僅觀察到抑郁癥患者及抑郁模型大鼠miRNA132表達(dá)變化情況，然而要進(jìn)一步證實(shí)這些現(xiàn)象并闡明其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)：如通過尸檢抑郁癥患者相應(yīng)腦區(qū)相關(guān)分子的表達(dá)水平，從而更準(zhǔn)確地觀察其變化情況；通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以及在體動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)的分子機(jī)制研究等。