蛋白磷酸酶PHLPP2通過線粒體凋亡途徑加重順鉑誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷

陳 麗 朱美娟 陳 娟 應(yīng)海玲 唐文莊

急性腎損傷(AKI)是臨床上一種較為常見的危急重癥，由各種致病原因造成雙腎功能在短期內(nèi)(數(shù)小時(shí)至數(shù)周)急劇減退[1-2]，可進(jìn)展為慢性腎臟病及終末期腎病，嚴(yán)重威脅患者的生命安全及生活質(zhì)量[2]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)線粒體相關(guān)的細(xì)胞凋亡通路是AKI早期腎小管細(xì)胞功能受損及丟失的重要因素[3]。Pleckstrin同原序列富亮氨酸重復(fù)片段蛋白磷酸酶(pleckstrin homology domain leucine-rich repeat protein phosphatase,PHLLP)家族成員PHLPP2[4]，是靶向調(diào)控Akt磷酸化的特異性分子，已在多種細(xì)胞證實(shí)能影響線粒體功能，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[5]。有研究證實(shí)，PHLLP在炎癥性腸病中通過抑制Akt活性，導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞的過度凋亡，加重腸上皮屏障功能損傷[6]。而在桑色素對肝損傷的保護(hù)機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，桑色素能夠通過干預(yù)PHLPP2的活性，繼而通過PHLPP2-Akt-Gsk3β信號通路抑制氧化應(yīng)激和線粒體功能損傷來保護(hù)肝功能[7]。上述研究均提示PHLPP2可能通過影響線粒體功能參與AKI的發(fā)病過程中，但關(guān)于PHLPP2在AKI中的研究尚無相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬通過PHLPP2敲除(PHLPP2-/-)小鼠以順鉑(cisplatin,CDDP)誘導(dǎo)經(jīng)典小鼠AKI模型，觀察并探究PHLPP2在AKI過程中的作用及其相關(guān)機(jī)制。

材料與方法

材料SPF級成年雄性C57BL/6小鼠20只，8～12周齡，購自海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；PHLPP2-/-小鼠20只由上海南方模式生物科技公司定制；4%甲醛(武漢博士德生物公司)；順鉑(cisplatin,CDDP)(宜昌人福藥業(yè)有限公司)；CCK-8試劑盒(北京索萊寶生物公司)；戊巴比妥鈉(美國Sigma公司)；大鼠抗PHLPP2、GAPDH單克隆抗體(美國Abcam公司)；Alexa Fluor 647標(biāo)記的兔抗大鼠抗體(美國Biolegend公司)； TUNEL凋亡檢測試劑盒(美國Roche公司)；FITC標(biāo)記的麥胚凝集素(WGA)(美國Invitrogen公司);BAC 法蛋白質(zhì)定量試劑、DAPI染料、磷酸化蛋白提取試劑盒、HE染色試劑盒(江蘇碧云天生物公司); 免疫組織化學(xué)染色試劑盒(北京博奧森生物公司)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB) 染色劑購自(北京中杉金橋)；JC-1線粒體膜電位試劑盒(美國Biovision公司)；其余均為國產(chǎn)分析純。

方法

AKI動(dòng)物模型建立和分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為WT對照組、WT CDDP處理組、PHLPP2-/-對照組和PHLPP2-/-CDDP處理組(每組10只)。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，參考相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行制備AKI小鼠模型：術(shù)前12h禁食不禁水，經(jīng)腹注射戊巴比妥鈉(150 mg/kg)進(jìn)行麻醉后，將稀釋后的CDDP(1 g/L)按20 mg/kg的劑量進(jìn)行單次腹腔注射，對照組注射相同體積的生理鹽水。造模后自由攝食水。3d后心尖采血后處死小鼠，取雙腎組織，右腎置于-80℃保存?zhèn)溆?，左腎剝除腎臟外膜后固定于4%甲醛中。

血尿素氮(BUN)、血清肌酐(SCr)及總蛋白含量測定 于本院羅氏全自動(dòng)生化分析儀中分析各組小鼠血清中BUN、SCr及總蛋白含量。

病理學(xué)染色 取固定于甲醛溶液24h后的腎組織，進(jìn)行處理切片后行HE染色，每只小鼠隨機(jī)選取3張切片，光鏡下觀察其組織學(xué)變化。

反轉(zhuǎn)錄PCR檢測腎組織中PHLPP2 mRNA表達(dá) 將小鼠腎組織置于液氮中研磨為組織勻漿后按照TRIzol法提取組織中總RNA，分光光度計(jì)檢測濃度與純度后，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA.再按照RT-PCR試劑說明書及預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的反應(yīng)時(shí)間與溫度進(jìn)行實(shí)時(shí)定量。上述實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

TUNEL試劑盒檢測腎組織中凋亡細(xì)胞 各組小鼠腎組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片后按照TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行檢測腎皮質(zhì)組織的細(xì)胞凋亡情況。在各組小鼠的腎組織切片中加入FITC標(biāo)記的WGA(10 μg/ml)，孵育30 min后，Hank’s平衡液洗滌未結(jié)合的凝集素，加入TUNEL反應(yīng)液及DAPI染液，繼續(xù)孵育1h后，加入防熒光淬滅劑進(jìn)行封片，熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。細(xì)胞凋亡率計(jì)算為：高倍視野下每100個(gè)細(xì)胞中TUNEL染色陽性的細(xì)胞數(shù)。以上實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

熒光免疫組織化學(xué)染色檢測腎組織中PHLPP2的定位與表達(dá) 各組小鼠腎組織中切片常規(guī)脫蠟水化、抗原修復(fù)后， PBS漂洗組織，加入5% BSA于室溫下孵育20 min進(jìn)行封閉，滴加稀釋后的兔抗PHLPP2多克隆抗體(1∶ 200)并于4℃下進(jìn)行孵育過夜，次日37℃復(fù)溫后，PBS漂洗組織，加入Alexa Fluor 647標(biāo)記的山羊抗兔抗體(1∶ 800)并在室溫下孵育30 min，再次PBS漂洗后加入5 μg/ml的DAPI染液，室溫孵育30 min，PBS漂洗后加入防熒光猝滅劑，熒光顯微鏡觀察。

小鼠腎小管上皮細(xì)胞(renal tubular epithelium cells，RTECs)分離 參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道方法[8]分離各組小鼠腎小管上皮細(xì)胞。FITC標(biāo)記的抗E黏連蛋白于室溫孵育分離的RTECs 20 min，隨后應(yīng)用FITC標(biāo)記細(xì)胞角蛋白18/DAPI進(jìn)行免疫染色進(jìn)行鑒定RTECs。RTECs培養(yǎng)于含10%FBS、1%ITS、10%EGFG、100 ng/ml氫化可的松及1%青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液中。

透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu) 取上述各組小鼠腎臟皮質(zhì)組織，常規(guī)處理后制成超薄切片，于電子顯微鏡下觀察腎臟組織超微結(jié)構(gòu)變化。

JC-1法檢測RTECs中線粒體膜電位 取各組小鼠RTECs，參考JC-1試劑盒說明方法應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測細(xì)胞線粒體膜電位變化。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

Western Blot實(shí)驗(yàn) 利用蛋白質(zhì)提取試劑盒提取各組小鼠腎臟總蛋白。BCA法進(jìn)行蛋白定量，按照1∶ 4向上清液中加入5×上樣緩沖液，并于沸水中加熱變性10 min。取30 μg的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白，采用濕轉(zhuǎn)法將分離蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%的脫脂牛奶于室溫下封閉2h后，分別加入PHLPP2(1∶ 500)、GAPDH(1∶ 2 000)一抗，4℃搖床孵育過夜。加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶ 5 000)室溫孵育1h，最后在載有蛋白條帶的PVDF膜上均勻滴加ECL發(fā)光液后于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照。Image J軟件測定條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參GAPDH的比值作為其相對含量。以上實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

統(tǒng)計(jì)分析采用《SPSS 19.0》和《GraphPad Prism 5.0》進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較進(jìn)行分析；P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

敲除PHLPP2改善CDDP誘導(dǎo)的AKI 與WT對照組小鼠相比，WT CDDP組與PHLPP2-/-CDDP組小鼠BUN、SCr含量顯著升高(P<0.05)，總蛋白含量顯著降低(P<0.05)，PHLPP2-/-對照組無明顯變化(P>0.05)；WT CDDP組小鼠相比，PHLPP2-/-CDDP組小鼠血清中BUN、SCr含量明顯降低(P<0.05)，而總蛋白含量顯著升高(P<0.05)(表1)；光鏡下見WT對照組與PHLPP2-/-對照組小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)正常，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊；WT CDDP組小鼠的腎臟組織中腎小管出現(xiàn)壞死，上皮細(xì)胞腫脹、變性，腎小管腔內(nèi)可見玻璃樣管型，管腔明顯擴(kuò)張，而PHLPP2-/-CDDP組小鼠的腎組織損傷較WT CDDP組明顯減輕(圖1)。

表1 各組小鼠血清中BUN、SCr和總蛋白含量檢測結(jié)果

圖1 各組小鼠腎臟組織病理學(xué)改變(A～D：HE×200;E～H:HE×400)WT:野生型小鼠;PHLPP2:Pleckstrin同原序列富亮氨酸重復(fù)片段蛋白磷酸酶2；CDDP:順鉑

PHLPP2在CDDP誘導(dǎo)的AKI中顯著高表達(dá)RT-PCR與Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示，WT CDDP處理組小鼠腎組織中PHLPP2的mRNA(4.35±0.33)與蛋白(0.71±0.16)較與WT對照組的PHLPP2 mRNA(1.05±0.04)和蛋白(0.16±0.04)表達(dá)均顯著增高(P<0.01);免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示PHLPP2在WT CDDP處理組小鼠腎皮質(zhì)組織處的腎小管上皮中的表達(dá)明顯增加(圖2)。

圖2 小鼠腎組織中PHLPP2的表達(dá)及定位(IHC,×200)PHLPP2:Pleckstrin同原序列富亮氨酸重復(fù)片段蛋白磷酸酶2；CDDP:順鉑;WT:野生型小鼠;**:與WT組相比,P<0.01

敲除PHLPP2減輕CDDP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡各組小鼠腎組織經(jīng)TUNEL染色后結(jié)果顯示，WT對照組與PHLPP2-/-對照組小鼠腎臟組織中無明顯凋亡現(xiàn)象發(fā)生；與WT對照組相比，WT CDDP組小鼠的腎組織的凋亡細(xì)胞顯著增加(P<0.01)；與WT CDDP組小鼠的腎組織相比，PHLPP2-/-CDDP組小鼠腎組織凋亡細(xì)胞明顯減少(P<0.05，圖3)。

圖3 各組小鼠腎組織的TUNEL染色(TUNEL,×40)PHLPP2:Pleckstrin同原序列富亮氨酸重復(fù)片段蛋白磷酸酶2；CDDP:順鉑;WT:野生型小鼠；*:與WT組相比， P<0.05，**:P<0.01；#:與WT CDDP組相比，P<0.05

敲除PHLPP2改善CDDP誘導(dǎo)的線粒體損傷免疫熒光鑒定分離的RTECs，結(jié)果顯示分離的細(xì)胞80%以上均表達(dá)腎小管上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志分子角蛋白18，這提示分選的RTECs純度能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。透射電鏡觀察各組小鼠RTECs超微結(jié)構(gòu)改變，結(jié)果表明WT與PHLPP2-/-組小鼠線粒體結(jié)構(gòu)完整，外膜光滑無腫脹；WT CDDP組小鼠RTECs線粒體結(jié)構(gòu)大量破壞，數(shù)目顯著減少，棘突排列紊亂，線粒體膜破損嚴(yán)重；PHLPP2-/-CDDP組小鼠可見RTECs線粒體結(jié)構(gòu)多數(shù)完整，棘突變短，其線粒體損傷介于WT組與WT CDDP組之間(圖4)。

圖4 透射電鏡觀察各組小鼠腎組織中線粒體結(jié)構(gòu)變化(EM)PHLPP2:Pleckstrin同原序列富亮氨酸重復(fù)片段蛋白磷酸酶2；CDDP:順鉑;WT:野生型小鼠；RTECs:腎小管上皮細(xì)胞

敲除PHLPP2減輕CDDP誘導(dǎo)的線粒體損傷JC-1法檢測各組小鼠RTECs的線粒體膜電位變化，其中FL2與FL1雙陽性象限為線粒體膜電位較高的正常細(xì)胞，而FL1單陽性象限為線粒體膜電位降低的受損細(xì)胞。JC-1實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示結(jié)果表明與WT組相比，WT CDDP組、PHLPP2-/-CDDP組小鼠RTECs線粒體膜電位顯著下降(P<0.05)；但與WT CDDP組相比，PHLPP2-/-CDDP組細(xì)胞線粒體膜電位下降趨勢明顯緩解(P<0.05，圖5)。

圖5 PHLPP2誘導(dǎo)CDDP介導(dǎo)急性腎損傷中RTECs線粒體膜電位降低(JC-1法檢測)PHLPP2:Pleckstrin同原序列富亮氨酸重復(fù)片段蛋白磷酸酶2；CDDP:順鉑;RTECs:腎小管上皮細(xì)胞;WT:野生型小鼠；與WT組相比，*：P<0.05，**:P<0.01；#:與WT CDDP組相比，P<0.05

PHLPP2基因?qū)Φ蛲龅鞍妆磉_(dá)的影響Western Blot檢測各組小鼠RTECs中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3及Akt的Thr308與Ser473位點(diǎn)磷酸化水平，結(jié)果顯示與WT對照組與PHLPP2-/-對照組細(xì)胞相比，WT CDDP組和PHLPP2-/-CDDP組RTECs中促凋亡蛋白Bax、Caspase-3 表達(dá)顯著增加(P<0.05)，而凋亡抑制蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)；與WT CDDP組相比，PHLPP2-/-CDDP組中Bax、Caspase-3 表達(dá)明顯減少(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)；Akt的Thr308與Ser473位點(diǎn)磷酸化水平的檢測結(jié)果顯示，與WT對照組與WT CDDP組的相比，PHLPP2-/-對照組及PHLPP2-/-CDDP組的RTECs中上述位點(diǎn)磷酸化水平顯著增加(P<0.05)，這提示PHLPP2基因通過對Akt的Thr308與Ser473位點(diǎn)去磷酸化發(fā)揮上述作用(圖6)。

圖6 PHLPP2基因?qū)DDP介導(dǎo)急性腎損傷中RTECs凋亡蛋白表達(dá)的影響(Western印跡)PHLPP2:Pleckstrin同原序列富亮氨酸重復(fù)片段蛋白磷酸酶2；CDDP:順鉑;RTECs:腎小管上皮細(xì)胞;*：A：WT對照組;B:WT CDDP組;C:PHLPP2-/-對照組;D:PHLPP2-/-CDDP組；*：與WT組相比， P<0.05；#:與WT CDDP組相比，P<0.05

討 論

AKI是臨床常見的危急重癥，其在重癥監(jiān)護(hù)室患者中的發(fā)病率超過50%[9]。此外，AKI還會(huì)增加慢性腎臟病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)并且是其進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[10]。AKI發(fā)病原因復(fù)雜，其中缺血、感染以及腎毒性藥物等原因是導(dǎo)致AKI發(fā)生及死亡率增高的重要影響因素[11]。

線粒體是廣泛存在于細(xì)胞中的一種重要細(xì)胞器，在生理水平下線粒體處于穩(wěn)定狀態(tài)，但當(dāng)其損傷時(shí)，可產(chǎn)生大量超氧化物和活性氧，導(dǎo)致鈣超載和氧化應(yīng)激等不良刺激，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死[12]。腎臟線粒體含量豐富，其密度僅次于心臟，諸多數(shù)據(jù)表明AKI模型中可見腎小管上皮細(xì)胞線粒體嵴消失、線粒體碎片化及數(shù)量減少、膜損傷等現(xiàn)象，這提示線粒體結(jié)構(gòu)損傷及功能障礙在AKI發(fā)病過程中可能起著重要的作用[13]。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)是線粒體功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其能夠決定線粒體通透性，在細(xì)胞受到不良刺激后MPTP異常開放可導(dǎo)致線粒體膜電位下降乃至消失，繼而引發(fā)線粒體腫脹，外膜破裂并致使線粒體結(jié)構(gòu)損害，影響線粒體功能，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[14]。在缺血再灌注的小鼠AKI模型中，以環(huán)孢素A處理同樣能夠抑制MPTP的開放，保護(hù)線粒體功能而改善AKI損傷，且在敲除CypD基因表達(dá)的AKI模型小鼠中也觀察到MPTP開放介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡途徑被抑制[15-16]。

PHLPP2是基于對Akt磷酸化調(diào)控的機(jī)制分析，通過理論推斷和實(shí)驗(yàn)鑒定所得的蛋白[4]。Akt激酶通過磷酸化級聯(lián)反應(yīng)可直接調(diào)控下游促凋亡和抗凋亡兩類轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而決定細(xì)胞命運(yùn)歸向[17]。PHLLP主要通過使Akt的Thr308與Ser473位點(diǎn)去磷酸化而終止下游的信號傳導(dǎo)[4]。在多種實(shí)體瘤中(如乳腺癌、結(jié)腸癌)PHLPP2的缺失導(dǎo)致細(xì)胞中的Akt持續(xù)磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，并抑制其發(fā)生凋亡。在本實(shí)驗(yàn)在PHLPP2基因敲除的小鼠通過順鉑誘導(dǎo)AKI模型，該操作簡單，侵入性損害較小且所誘導(dǎo)的AKI效果明顯。隨后實(shí)驗(yàn)鑒定AKI模型小鼠BUN、SCr和總蛋白水平均呈現(xiàn)異常，且PHLPP2-/-小鼠中PHLPP2的mRNA及蛋白表達(dá)均顯著降低，免疫組化顯示PHLPP2在損傷較嚴(yán)重的皮質(zhì)部位顯著增加，而PHLPP2-/-小鼠中腎組織損傷明顯減輕，TUNEL染色同樣證實(shí)在PHLPP2-/-的小鼠中細(xì)胞的凋亡發(fā)生率顯著降低，進(jìn)一步的線粒體結(jié)構(gòu)及功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明敲除小鼠PHLPP2基因表達(dá)能夠抑制腎小管上皮細(xì)胞中線粒體MPTP的開放，抑制線粒體膜電位的下降，從而保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)及功能，最后Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示敲除PHLPP2基因表達(dá)可顯著促進(jìn)小鼠RTECS中Bcl-2蛋白表達(dá)，而抑制Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)，且PHLPP2基因是通過對Akt的Thr308與Ser473位點(diǎn)去磷酸化而調(diào)節(jié)上述蛋白表達(dá)。這與既往的研究結(jié)果一致[5]。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)敲除PHLPP2表達(dá)能夠減輕線粒體膜電位的下降，保護(hù)線粒體的結(jié)構(gòu)及功能，從而通過抑制線粒體途徑的凋亡改善AKI損傷。本研究不僅為PHLPP2與線粒體功能之間的相互作用關(guān)系提供了新的思路，同時(shí)也對AKI發(fā)展的分子機(jī)制提供了新的見解，因此PHLPP2有望成為治療AKI的潛在研究靶點(diǎn)。