102例系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性患者骨髓漿細(xì)胞遺傳學(xué)特征

撒 琪 任貴生 徐孝東 陳文萃 郭錦洲 趙 亮 劉志紅 黃湘華

系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性(systemic light chain amyloidosis)，簡稱AL型淀粉樣變性，由單克隆的免疫球蛋白輕鏈錯(cuò)誤折疊成淀粉樣不溶性纖維在組織器官沉積而致病[1-2]。目前，許多AL型淀粉樣變性的治療方案是從多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)借鑒而來，但二者在生物學(xué)上有很大不同。在MM中，細(xì)胞遺傳學(xué)異常對疾病風(fēng)險(xiǎn)分層有深遠(yuǎn)影響，可指導(dǎo)治療決策。細(xì)胞遺傳學(xué)在MM治療中的重要性已經(jīng)明確，并且這些遺傳學(xué)標(biāo)志物現(xiàn)已納入修訂的國際分期系統(tǒng)中。據(jù)報(bào)道，AL型淀粉樣變性存在與MM相似的染色體異常，例如t(11;14)、t(4;14)、t(14;16)，13或13q缺失，17p缺失和非整倍體型[3-6]。

細(xì)胞染色體畸變對AL型淀粉樣變性的影響尚不十分明確。本研究利用間期熒光原位雜交技術(shù)(iFISH)分析AL型淀粉樣變性漿細(xì)胞遺傳學(xué)特征，探索其與患者臨床特征、漿細(xì)胞免疫表型間的相關(guān)性。

對象與方法

研究對象選取2015年5月至2018年10月國家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心收治的確診AL型淀粉樣變性患者102例。所有病例均符合《系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性診斷和治療指南(2016年)》[7]診斷標(biāo)準(zhǔn)。

一般資料收集患者性別、年齡、24h尿蛋白定量、血清白蛋白、球蛋白、尿素氮、血清肌酐、尿酸、堿性磷酸酶、白細(xì)胞、血紅蛋白、血小板、免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)、血游離輕鏈差值(dFLC)、N-末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)、肌鈣蛋白T(TnT)、血免疫固定電泳等實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果及器官受累情況。

相關(guān)定義器官受累診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]：(1)腎臟：尿蛋白定量>0.5 g/d，以白蛋白為主。(2)心臟：心臟超聲平均心室壁厚度>12 mm，排除其他心臟疾病；或是在沒有腎功能不全及心房顫動時(shí)NT-proBNP>332 ng/L。(3)肝臟：無心力衰竭時(shí)肝臟上下徑(肝叩診時(shí)鎖骨中線上量的肝上界到肝下界的距離)>15 cm；或堿性磷酸酶大于正常值上限的1.5倍。(4)外周神經(jīng)：臨床出現(xiàn)對稱性雙下肢感覺運(yùn)動神經(jīng)病變。

細(xì)胞遺傳學(xué)異常檢測方法

主要試劑 GLP RB1 DNA 探針、GLP P53 DNA探針、GLP D13S319 DNA 探針、GLP Iq21 DNA 探針、GLP IGH DNA 探針、IGH/CCND1探針，購自北京金菩嘉公司。 免疫CD19、CD38、CD45、CD56、CD117、CD138、κ和λ游離輕鏈熒光抗體，購自Beckman Coulter公司。CD138磁珠、分選柱、分選器購自德國美天旎公司。

iFISH檢測 無菌操作抽取患者骨髓液，裂解紅細(xì)胞，磁珠分選富集CD138+細(xì)胞；應(yīng)用RB1、1q21、D13S319、P53、IGH熒光探針對富集的細(xì)胞進(jìn)行檢測，若IGH異常再進(jìn)行CCND1/IGH融合基因探針檢測；熒光顯微鏡觀察結(jié)果(圖1)。

免疫表型檢測 抽取患者骨髓液，裂解紅細(xì)胞，CD19、CD38、CD56、CD117、CD138、κ和λ游離輕鏈抗體染色處理。用流式細(xì)胞儀(MoFlo XDP，Beckman Coulter公司)采用CD38/CD138設(shè)門策略圈定雙陽性細(xì)胞，分析該群細(xì)胞各抗原的表達(dá)情況。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用《SPSS 25》軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示。計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

臨床特征102例AL型淀粉樣變性患者診斷時(shí)的中位年齡55歲，男性57例(55.88%)。存在iFISH異常68例(66.67%)，iFISH無異常34例(33.33%)。兩組患者臨床基線特征見表1。

表1 102例系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性患者 iFISH 檢測基線資料

與iFISH無異常的患者相比，存在iFISH異常的患者dFLC更高(P=0.001)，但兩組患者形態(tài)學(xué)檢測骨髓漿細(xì)胞數(shù)量無差別，而多參數(shù)流式細(xì)胞(multiparametric flow cytometry,MFC)檢測iFISH異常患者骨髓中漿細(xì)胞比例為0.65%(0.05%～7.07%)，高于iFISH檢測無異?；颊叩?.42%(0.02%～1.59%)(P=0.04)。器官受累與疾病危險(xiǎn)分層兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

iFISH檢測異常的分布68例iFISH異?；颊咧校?5例(80.88%)存在IgH異常，其中t(11;14) 35例(占51.47%)。其余染色體異常類型為：1q21擴(kuò)增22例(32.35%)，RB1缺失19例(27.94%)，D13S319缺失20例(29.41%)，P53缺失4例(5.88%)。

在68例iFISH異?；颊咧校?9例(57.35%)僅檢測出1種染色體異常，11例(16.18%)檢出2種染色體異常，13例(19.12%)檢出3種染色體異常，5例(7.35%)檢出4種染色體異常。其中最多見的是單獨(dú)存在t(11;14)，共計(jì)25例(36.76%)。存在RB1缺失或D13S319缺失的患者均合并有其他iFISH異常類型(表2)。

表2 間期熒光原位雜交技術(shù)(iFISH)異常的分布

存在4種染色體異常的患者血小板計(jì)數(shù)低于其他患者(P=0.005)，血清白蛋白低于僅1種染色體異常的患者(P=0.033)，而血清dFLC更高(P=0.026)；乳酸脫氫酶高于存在2種(P=0.020)和3種染色體異常的患者(P=0.027)(表3)。比較不同染色體異常類型患者實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，發(fā)現(xiàn)存在RB1缺失和D13S319缺失的患者相較其他存在2種染色體異常的患者血清dFLC更高(P=0.022)。

表3 不同數(shù)目染色體異常患者臨床特征比較

細(xì)胞遺傳學(xué)與免疫表型相關(guān)性6例患者未行MFC檢測，剩余96例患者中有16例漿細(xì)胞CD117分子檢測結(jié)果缺失。按照漿細(xì)胞表面CD19、CD56、CD117各分子表達(dá)與否將患者分成陰性組與陽性組，比較不同組內(nèi)細(xì)胞遺傳學(xué)差異。結(jié)果顯示，CD19陰性組iFISH異?；颊弑壤哂贑D19陽性組(73.53%vs50.00%，P=0.026)。除了1q21擴(kuò)增，其余各種iFISH異?；颊咚急壤荂D19陰性組高于CD19陽性組(表4)。而CD56、CD117兩組內(nèi)未見明顯差異。

表4 CD19、CD56、CD117分組間期熒光原位雜交技術(shù)(iFISH)檢測結(jié)果

討 論

AL型淀粉樣變性與MM同屬漿細(xì)胞起源的疾病，但二者生物學(xué)方面有所不同，AL型淀粉樣變性的漿細(xì)胞發(fā)育異常通常處于較早階段[8]，并且疾病的進(jìn)程取決于淀粉樣蛋白的毒性和游離輕鏈的數(shù)量，而不是異常克隆性漿細(xì)胞負(fù)荷[9]。AL型淀粉樣變性患者iFISH異常發(fā)生率高于MM患者。在腫瘤負(fù)荷通常低于MM的情況下，iFSIH異常的高發(fā)生率可能會導(dǎo)致AL型淀粉樣變性治療結(jié)局的復(fù)雜性。例如存在t(11:14)的患者治療反應(yīng)較差，總體生存(OS)也更低[10]。通過iFISH檢測我們發(fā)現(xiàn)，68例存在染色體異常的患者中有55例(53.92%)檢測出IgH異常。IgH異常[包括斷裂、缺失和(或)重排]是B淋巴細(xì)胞腫瘤的特征之一，在B淋巴細(xì)胞白血病、MM、淋巴瘤中均可見。對于AL型淀粉樣變性來說，IgH異常是其最常見的染色體結(jié)構(gòu)改變之一[11]。IgH基因定位于染色體14q32。研究發(fā)現(xiàn)，IgH易位是非隨機(jī)的特異性細(xì)胞學(xué)變化，在MM中隨著病情進(jìn)展，其發(fā)生頻率逐漸升高[12]。我們對檢測出IgH異常的患者再進(jìn)行CCND1/IGH融合基因探針檢測，發(fā)現(xiàn)存在t(11;14)的患者有35例，占IgH異常的63.64%。t(11;14)是AL型淀粉樣變性常見的染色體異常，與細(xì)胞周期蛋白D1(CCND1)表達(dá)增加所導(dǎo)致的游離輕鏈分泌有關(guān)[13]。CCND1通過在細(xì)胞周期的早期激活細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK-4或CDK-6，使得細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)變，從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白磷酸化失活。正常漿細(xì)胞不表達(dá)CCND1，而在MM腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)[14]。在Bryce等[15]的研究中，AL型淀粉樣變性患者中存在t(11;14)的具有較高的肌鈣蛋白水平和更短的OS。此外，t(11;14)常與治療反應(yīng)相關(guān)：Muchtar等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，與無t(11;14)的患者相比，具有t(11;14)患者接受硼替佐米和免疫調(diào)節(jié)聯(lián)合治療的緩解率較低；但t(11;14)對接受硼替佐米治療的患者所產(chǎn)生的不良影響僅存在于臨床特征良好(年齡<65歲，受累器官≤2，低dFLC)和疾病風(fēng)險(xiǎn)較低(Mayo分期I期/II期)的患者中。另一項(xiàng)研究對101例接受硼替佐米和地塞米松聯(lián)合治療的AL 型淀粉樣變性患者進(jìn)行 FISH 檢測發(fā)現(xiàn)，具有t(11;14)的患者反應(yīng)率較低，無進(jìn)展時(shí)期和總生存期較短[17]。根據(jù)已有的報(bào)道，無論是MM還是AL型淀粉樣變性，t(11;14)均與疾病緩解率較低相關(guān)，但其是否為獨(dú)立的預(yù)后影響因素尚未十分明確。t(11;14)在AL型淀粉樣變性中很常見，但目前尚不清楚該異常是否與淀粉樣蛋白的產(chǎn)生有關(guān)。

1q21擴(kuò)增區(qū)域約為10～15Mb，其中包含CKS1B和PSMD4基因，研究發(fā)現(xiàn)，在MM中前者與疾病進(jìn)展有關(guān)，后者與耐藥性高度相關(guān)[18]。CKS1B和PSMD4基因的表達(dá)水平可隨1q21拷貝數(shù)增加而提高，從而導(dǎo)致腫瘤增殖能力增強(qiáng)。Bochtler等[19]對103例接受馬法蘭和地塞米松治療的AL型淀粉樣變性患者進(jìn)行iFISH檢測發(fā)現(xiàn)，有23%的患者存在1q21擴(kuò)增，并且存在1q21擴(kuò)增的患者OS較短。此外，存在1q21擴(kuò)增的患者表現(xiàn)出更高的骨髓漿細(xì)胞負(fù)荷和較高的dFLC值。明確了1q21擴(kuò)增是一個(gè)獨(dú)立的不良預(yù)后因素。13q14缺失是MM中常見的染色體異常類型，在AL型淀粉樣變性中同樣存在。RB1和D13S319是13q14最常檢測的區(qū)域，RB1探針對應(yīng)13q14.1-14.2區(qū)域，D13S319對應(yīng)13q14.3區(qū)域。RB1缺失或D13S319缺失均提示13q14缺失，二者同時(shí)存在提示13q14的大片段缺失。RB1是一種抑癌基因，存在于13號染色體的長臂1區(qū)4帶，其突變后容易導(dǎo)致視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，在某些進(jìn)展期的MM中存在RB1缺失。一項(xiàng)研究對692例AL型淀粉樣變性患者進(jìn)行iFISH檢測發(fā)現(xiàn)有41%的患者出現(xiàn)一種以上異常，13號染色體缺失的患者有95%合并其他類型染色體異常，存在t(11;14)的患者中有34%至少合并一種其他染色體異常[16]。本研究中13q14缺失的患者均合并有其他類型的iFISH異常：有11例患者合并伴1q21擴(kuò)增，5例患者合并t(11;14)。有1例患者僅存在13q14缺失一種染色體異常。此前有研究報(bào)道13q14染色體缺失與1q21擴(kuò)增間高度相關(guān)[20]。13號染色體的缺失似乎和心臟受累有關(guān)，與漿細(xì)胞負(fù)荷無關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，存在13q14大片段缺失(合并RB1缺失和D13S319缺失)的患者相較其他染色體畸變類型的患者dFLC值更高(P=0.022)。血清dFLC值是衡量AL型淀粉樣變性患者預(yù)后的指標(biāo)之一，染色體13q14缺失是否為影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素尚待觀察。 P53位于17號染色體短臂1區(qū)3帶，17p13缺失可導(dǎo)致P53基因突變。P53基因作為經(jīng)典的抑癌基因，其突變與多種惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。

結(jié)合患者臨床特征，我們發(fā)現(xiàn)合并有4種染色體異常的患者實(shí)驗(yàn)室檢查血小板計(jì)數(shù)更高，與僅存在1種染色體異常的患者相比血清白蛋白較低，而血dFLC較高，提示合并染色體異常類型越多，疾病嚴(yán)重程度更高。此外，存在RB1缺失和D13S319缺失的患者相較其他存在2種染色體異常的患者血清dFLC更高。

結(jié)合單克隆漿細(xì)胞免疫表型，本研究發(fā)現(xiàn)骨髓漿細(xì)胞表面CD19陰性或CD56陽性的患者P53缺失的發(fā)生率更高；CD19陰性的漿細(xì)胞除1q21擴(kuò)增外，其余類型的染色畸變發(fā)生率均高于CD19陽性的漿細(xì)胞，提示CD19陰性的漿細(xì)胞惡性程度更高。目前研究發(fā)現(xiàn)異常漿細(xì)胞多表現(xiàn)為CD19陰性，因此，免疫表型與細(xì)胞遺傳學(xué)異常具有一定的相關(guān)性，但二者聯(lián)系的具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步的探索。

本研究尚存在一些不足之處：(1)樣本量小，結(jié)果可能存在偏倚；(2)存在IgH異常的患者僅進(jìn)行t(11;14)的檢測，其他易位類型尚未檢測；(3)患者細(xì)胞遺傳學(xué)異常與臨床治療、生存和預(yù)后之間的關(guān)系尚待進(jìn)一步觀察。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)AL型淀粉樣變性患者骨髓漿細(xì)胞遺傳學(xué)異常發(fā)生率高，且與漿細(xì)胞負(fù)荷和dFLC更高相關(guān)。其中最常見的染色體異常為 t(11:14)，其次為1q21擴(kuò)增、RB1缺失、D13S319缺失。合并2種iFISH異常的患者中，存在RB1缺失和D13S319缺失的患者dFLC更高 。CD19陰性的漿細(xì)胞其遺傳學(xué)異常發(fā)生率較CD19陽性的漿細(xì)胞更高。