• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    三相萃取法分離純化竹黃多糖工藝優(yōu)化*

    2020-11-08 13:41:52俞婷婷計(jì)瑋瑋鈕為民
    中國食用菌 2020年8期
    關(guān)鍵詞:叔丁醇三相去除率

    朱 煒,俞婷婷,計(jì)瑋瑋,黃 玲,鈕為民**

    (1.湖州市生態(tài)林業(yè)保護(hù)研究中心,浙江 湖州 313000;2.湖州市梁希森林公園管理處,浙江 湖州 313000;3.湖州市國營林場,浙江 湖州 313000)

    竹黃菌(Shiraia bambusicola P.Henn.)又名竹花、竹赤團(tuán)子、竹三七、竹繭等,是一種寄生于竹子細(xì)嫩枝桿上的子囊菌[1],其子座竹黃為傳統(tǒng)中藥,具有止咳祛痛、舒筋活絡(luò)、祛風(fēng)利濕、補(bǔ)中益氣、活血補(bǔ)血、散瘀通經(jīng)等功效[2]。竹黃菌主要分布于我國南部的江西、浙江、四川、湖南、安徽、貴州、福建、云南等地區(qū)[3]。竹黃多糖是竹黃的有效成分之一,近年來研究表明竹黃多糖具有良好的抗氧化性能和清除自由基能力,對小鼠的四氯化碳急性肝損傷具有保護(hù)作用,具有良好的開發(fā)利用價(jià)值[4]。

    目前,多糖的傳統(tǒng)提取工藝為乙醇沉淀法,此方法雖然能提取出大量的多糖,但是存在提取不徹底、原料利用率低、乙醇用量大等問題[5]。三相萃取法原理是通過在粗提液中加入無機(jī)鹽和有機(jī)溶劑使其形成三相,上相為有機(jī)層,主要提取色素、脂類等極性較小的物質(zhì);中間相為蛋白質(zhì)提取層;下相為水層,主要提取一些水溶性物質(zhì)[6]。此外,體系中無機(jī)鹽和有機(jī)溶劑都可回收,且具有操作簡單、高效、體系容量大、可連續(xù)操作、條件溫和等特點(diǎn)[7-8]。三相分離法應(yīng)用了傳統(tǒng)鹽析、共溶劑、等離子體和蛋白質(zhì)滲透沉淀等多種原理,最近幾年才被用到多糖的分離純化中[9-10]。

    1 材料和方法

    1.1 材料與試劑

    竹黃子實(shí)體采自浙江省湖州市梅峰鎮(zhèn)短穗竹上;苯酚、硫酸、葡萄糖、鹽酸、氫氧化鈉、亞硝酸鋁、無水乙醇、(NH4)2SO4、叔丁醇均為國產(chǎn)分析醇,購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白購于上海索萊寶生物科技有限公司。

    1.2 儀器

    R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海申勝生物技術(shù)有限公司;20B型中藥粉碎機(jī),南京邦斯特制藥設(shè)備有限公司;JY92-ⅡDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;DKZ-2型電熱恒溫振蕩水槽,上海?,攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;PL602-S電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV-2600紫外分光光度計(jì),日本島津公司。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 竹黃多糖提取液的制備

    將10 g干燥的竹黃子實(shí)體粉碎后過40目篩,按料液比1∶40(g·mL-1)加入蒸餾水,90℃下水浴攪拌提取60 min;連續(xù)提取2次,過濾,合并2次濾液,濾液經(jīng)50℃、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至200 mL;濃縮液供三相萃取法分離多糖使用。

    1.3.2 三相萃取體系

    參照Yan等[10]的方法,取10 mL食用菌水提取濃縮液加入一定量的(NH4)2SO4,然后加入一定體積的叔丁醇配制所需三相體系。磁力攪拌10 min使兩相充分混勻,調(diào)節(jié)pH,以5 000 r·min-1離心10 min加速萃取劑分離過程,于一定溫度下靜置60 min,上相主要為叔丁醇,含有一些色素等雜質(zhì);中間相主要為蛋白質(zhì);下相主要是(NH4)2SO4和竹黃多糖[10]。使用移液器將三相各層的溶液分別吸出存于微量量筒中測定體積,后用水稀釋各相溶液,上相、中間相、下相檢測指標(biāo)為蛋白質(zhì)和多糖濃度。

    1.3.3 萃取條件的單因素試驗(yàn)

    1)(NH4)2SO4添加量的確定

    取5組各10 mL提取濃縮液,分別加入(NH4)2SO4使其質(zhì)量濃度為10%、20%、30%、40%、50%后,再各加入15 mL叔丁醇(叔丁醇∶樣液體積比為1.5∶1);在萃取溫度為25℃,pH 6的條件下萃取60 min;靜置2 h形成三相后,測定各相的相應(yīng)指標(biāo),考察不同(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對體系中多糖萃取率與蛋白質(zhì)去除率的影響。

    2)叔丁醇與樣液體積比的確定

    吸取10 mL提取濃縮液于5組試管中,分別加入20%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的(NH4)2SO4后,加入不同體積叔丁醇 (0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1);在萃取溫度為25℃,pH 6的條件下萃取60 min,靜置2 h形成三相后,測定各相的相應(yīng)指標(biāo);考察不同體積叔丁醇對體系中多糖萃取率與蛋白質(zhì)去除率的影響。

    3)萃取溫度的確定

    吸取10 mL提取濃縮液于5組試管中,加入(NH4)2SO4,使其質(zhì)量濃度為20%后加入15 mL的叔丁醇(叔丁醇∶樣液體積比為1.5∶1),在萃取溫度為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃,pH 6的條件下萃取60 min后測定各相的相應(yīng)指標(biāo),考察不同萃取溫度對體系中多糖萃取率與蛋白質(zhì)去除率的影響。

    1.3.4 響應(yīng)面法分析試驗(yàn)

    選擇萃取溫度、叔丁醇添加量、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)3個(gè)因素所確定的水平范圍。運(yùn)用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,采用3因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)。利用Design Expert 8.05軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。自變量的試驗(yàn)水平分別以-1,0,1進(jìn)行編碼,試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見表1。

    表1 響應(yīng)面分析因子及水平Tab.1 Factors and levels of response surface analysis

    1.3.5 分析方法

    1)多糖萃取率的測定

    采用苯酚-硫酸比色法[11],制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,在490 nm處測定樣品吸光度,通過純化前后樣品中多糖含量來確定多糖萃取率(M,%),計(jì)算公式為:

    式中:C1為純化后提取液中多糖含量(g);C2粗提液中多糖含量(g)。

    2)蛋白質(zhì)去除率的測定

    采用考馬斯亮藍(lán)比色法[12],制作牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線,在595 nm處測定樣品吸光度,通過純化前后樣品中蛋白質(zhì)含量來確定蛋白質(zhì)去除率(N,%),計(jì)算公式為:

    式中:M1為純化后提取液中蛋白質(zhì)含量(g);M2粗提液中蛋白質(zhì)含量(g)。

    3) 數(shù)據(jù)處理

    利用Design Expert 8.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理[13]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.1.1 (NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對竹黃多糖萃取率和蛋白質(zhì)去除率的影響

    (NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對多糖萃取率及蛋白質(zhì)去除率的影響見圖1。

    由圖1可知,隨著(NH4)2SO4添加量從10%增加到20%,多糖的萃取率增加,當(dāng)(NH4)2SO4添加量為20%時(shí),多糖的萃取率最大為87.50%。這可能是由于NH4+和SO42-可以穩(wěn)定大分子間的相互作用,使萃取體系更加穩(wěn)定,多糖能更好地溶解在溶劑中[10];當(dāng)(NH4)2SO4添加量超過20%,竹黃多糖的萃取量呈減少趨勢,可能由于鹽濃度過高會使多糖和水分子之間的氫鍵作用力被減弱,從而降低了多糖的萃取率。同時(shí),隨著提取液中(NH4)2SO4添加量的增加,蛋白質(zhì)去除率呈先上升后下降趨勢。在較低鹽濃度范圍內(nèi)蛋白質(zhì)去除率上升緩慢,當(dāng)(NH4)2SO4添加量到達(dá)20%時(shí),蛋白質(zhì)去除率最高為84.81%,鹽離子在較低濃度時(shí)的“鹽溶”效應(yīng)對相的分離有一定的促進(jìn)作用;然而,隨著提取液中(NH4)2SO4添加量繼續(xù)增加,水分子被鹽離子吸引,從而產(chǎn)生強(qiáng)烈的鹽析效應(yīng)[14]。因此提取液中最適(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 20%。

    2.1.2 叔丁醇與樣液體積比對竹黃多糖萃取率及蛋白質(zhì)去除率的影響

    叔丁醇與樣液體積比對竹黃多糖萃取率及蛋白質(zhì)去除率的影響見圖2。

    由圖2可知,隨著叔丁醇添加量的增加,竹黃多糖的萃取率也相應(yīng)增加,當(dāng)叔丁醇與樣液體積比為0.5~1.0時(shí),竹黃多糖萃取率增加幅度較大,在叔丁醇與樣液體積比為1∶1時(shí)竹黃多糖的萃取率最大為84.32%。這可能是增加的叔丁醇和(NH4)2SO4相互作用的結(jié)果,使多糖萃取率增加;但是當(dāng)叔丁醇與樣液體積比超過1.0后,竹黃多糖的萃取率大幅下降,這可能是叔丁醇的含量過高不利于三相體系的穩(wěn)定;可溶性蛋白質(zhì)去除率隨叔丁醇的添加量增加而逐漸下降[15],因此提取液中最適叔丁醇∶樣液體積比為 1∶1。

    2.1.3 萃取溫度對竹黃多糖萃取率的影響

    萃取溫度對竹黃多糖萃取率及蛋白質(zhì)去除率的影響見圖3。

    由圖3可知,當(dāng)竹黃多糖萃取溫度自20℃升高至40℃,竹黃多糖的萃取率逐漸增大至83.70%,這可能是因?yàn)殡S著溫度的升高大量的羥基暴露促進(jìn)了更多的氫鍵或鏈接形成。三相萃取溶液體系中分子熱運(yùn)動加快,從而使多糖的親水性增強(qiáng),這樣竹黃多糖更容易從食用菌中進(jìn)入到萃取溶液中,從而竹黃多糖的萃取率增加;當(dāng)萃取溫超過40℃以后,竹黃多糖的萃取率出現(xiàn)下降。同時(shí),隨著萃取溫度的增加,蛋白質(zhì)去除率呈先上升后下降趨勢。當(dāng)溫度為30℃時(shí)蛋白質(zhì)萃取率最大為73.10%,因此綜合考慮選擇萃取溫度為40℃為宜。

    2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

    2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

    根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。選擇萃取溫度(A)、叔丁醇與樣液體積比(B)、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)(C)作為自變量,以竹黃多糖萃取率作為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn),結(jié)果見表2。

    表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Experiment design and results of response surface analysis

    利用Design Expert 8.05軟件對表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[13],獲得多糖萃取率對萃取溫度、叔丁醇與樣液體積比和(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的多元二次回歸方程,確定以多糖萃取率(P,%)為目標(biāo)函數(shù)的二次多項(xiàng)回歸模型為:

    對上述方程進(jìn)行方差分析,見表3。

    表3 回歸模型方差分析Tab.3 Analysis variance of regression model

    由表3可知,以多糖萃取率為目標(biāo)函數(shù)的回歸方程的回歸效果達(dá)到極顯著水平,P<0.000 1;模型的決定系數(shù)R2為0.987 9,說明模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好;校正決定系數(shù)R2adj為0.972 4,說明該模型能解釋97.24%響應(yīng)值的變化;模型的失擬項(xiàng)表示模型預(yù)測值與實(shí)際值不擬合的概率,表3中模型失擬項(xiàng)的P=0.333 6>0.05,表明模型的失擬項(xiàng)不顯著;根據(jù)表3的顯著性分析結(jié)果,叔丁醇添加量、萃取溫度對響應(yīng)值影響顯著 (P<0.05),(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)(C)、A2、B2、C2以及AC、BC的交互項(xiàng)對多糖萃取率的影響極顯著(P<0.01)。各個(gè)因素對多糖萃取率影響大小順序依次為:(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)>叔丁醇與樣液體積比>萃取溫度。

    2.2.2 響應(yīng)面圖形分析

    根據(jù)回歸方程作響應(yīng)曲面圖,并根據(jù)擬合的響應(yīng)曲面形狀,探討萃取溫度、叔丁醇添加量及(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對竹黃多糖萃取率的影響。分別將萃取溫度、叔丁醇添加量及(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的其中一個(gè)因素固定在0水平,得到另外2個(gè)因素的交互影響結(jié)果,二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線見圖4~圖6。

    從圖4~圖6可以看出,影響竹黃子實(shí)體多糖萃取率的最顯著因素為(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù),極值條件應(yīng)該在等高線的圓心處,表現(xiàn)為響應(yīng)面變化弧度較大。其次是叔丁醇與樣液體積比。萃取溫度響應(yīng)面弧度變化平緩,說明其對響應(yīng)值影響較小。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱,橢圓形表示二因素交互作用顯著,而圓形則與之相反[16]。從圖4~圖6可以看出,叔丁醇與樣液體積比與(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)相互之間,萃取溫度與(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)相互之間對多糖萃取率有交互作用的影響。

    2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

    根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)所得的結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程,利用Design-Expert 8.05分析,得到最佳提取條件為:萃取溫度35.16℃,叔丁醇∶樣液體積比為0.96∶1,(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)26.10%,多糖萃取率理論值可達(dá)93.51%。

    為檢驗(yàn)?zāi)P皖A(yù)測值與實(shí)際試驗(yàn)值之間的相關(guān)性,即檢驗(yàn)響應(yīng)面優(yōu)化模型的可靠性,對竹黃子實(shí)體中多糖萃取率進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。試驗(yàn)中萃取溫度、叔丁醇∶樣液體積比和(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的優(yōu)化值分別為35.16℃,0.96∶1,26.10%。通過3次平行試驗(yàn),測得多糖萃取率分別為90.38%、90.25%、90.67%。實(shí)際多糖萃取率平均值為90.43%,達(dá)到了回歸模型預(yù)測理論值的96.70%。試驗(yàn)結(jié)果與模型符合良好,說明該模型能較好地模擬和預(yù)測竹黃子實(shí)體多糖萃取率。

    3 結(jié)論

    以竹黃為原料進(jìn)行試驗(yàn),利用三相萃取法分離純化竹黃多糖,考察叔丁醇-(NH4)2SO4-水提液體系的三相萃取性質(zhì),研究了三相體系中的提取液中(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、叔丁醇添加量、萃取液溫度對竹黃提取液中多糖萃取率和蛋白質(zhì)去除率的影響;在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過Box-Benhnken組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化了三相萃取的最優(yōu)工藝。響應(yīng)面分析結(jié)果表明,竹黃子實(shí)體中多糖的最佳提取條件為:萃取溫度35.16℃,叔丁醇∶樣液(體積)為0.96∶1,(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)26.10%,此條件下的多糖萃取率可得90.43%,蛋白質(zhì)去除率可達(dá)88.45%。三相萃取體系中的無機(jī)鹽和有機(jī)溶劑都可以回收重復(fù)使用,三相萃取法分離純化竹黃活性成分是一種具有前景的高效分離方法。

    猜你喜歡
    叔丁醇三相去除率
    高效減排環(huán)己酮氨肟化技術(shù)的開發(fā)及其工業(yè)化應(yīng)用
    氨肟化裝置叔丁醇回收系統(tǒng)雙效精餾的節(jié)能改造
    氣相色譜法快速測定環(huán)境水中叔丁醇的含量
    不同溫度下彈性填料對ABR處理生活污水的影響
    三相異步電動機(jī)保護(hù)電路在停車器控制系統(tǒng)中的應(yīng)用
    基于遺傳BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的內(nèi)圓磨削ZTA陶瓷材料去除率預(yù)測
    金剛石多線切割材料去除率對SiC晶片翹曲度的影響
    環(huán)己烷-叔丁醇-水共沸精餾模擬研究
    天津化工(2015年4期)2015-12-26 08:11:47
    兩級式LCL型三相光伏并網(wǎng)逆變器的研究
    三相PWM整流器解耦與非解耦控制的對比
    在线亚洲精品国产二区图片欧美| 亚洲av男天堂| 久久久久精品人妻al黑| 亚洲精品一区蜜桃| 久久久久国产精品人妻一区二区| 一二三四中文在线观看免费高清| av一本久久久久| 美女扒开内裤让男人捅视频| 成人国产av品久久久| 亚洲美女搞黄在线观看| 人妻一区二区av| 男女下面插进去视频免费观看| 日本午夜av视频| 在线观看三级黄色| 精品少妇内射三级| 久久久精品区二区三区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 成年人免费黄色播放视频| 满18在线观看网站| 成年女人毛片免费观看观看9 | 在线观看三级黄色| 久久久久精品性色| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产成人精品久久二区二区91 | 美女视频免费永久观看网站| 久久精品国产亚洲av涩爱| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | av不卡在线播放| 亚洲美女搞黄在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 少妇人妻久久综合中文| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久久国产精品麻豆| 黄片无遮挡物在线观看| 日韩精品有码人妻一区| 91国产中文字幕| 老司机深夜福利视频在线观看 | 美女国产高潮福利片在线看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 在线精品无人区一区二区三| 国产野战对白在线观看| 搡老岳熟女国产| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 日韩视频在线欧美| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| a级片在线免费高清观看视频| 女人精品久久久久毛片| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 伊人亚洲综合成人网| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 亚洲成色77777| 99国产综合亚洲精品| 高清黄色对白视频在线免费看| 高清黄色对白视频在线免费看| 香蕉国产在线看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 日韩大片免费观看网站| 国产精品一区二区在线不卡| av国产精品久久久久影院| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 2018国产大陆天天弄谢| www.熟女人妻精品国产| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲精品日本国产第一区| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲第一av免费看| 成年人免费黄色播放视频| 精品福利永久在线观看| av福利片在线| 国产激情久久老熟女| 成人影院久久| 国产亚洲最大av| 久久ye,这里只有精品| 最近中文字幕高清免费大全6| 久久韩国三级中文字幕| 成年人午夜在线观看视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲男人天堂网一区| 色94色欧美一区二区| 国产探花极品一区二区| 尾随美女入室| 丝袜喷水一区| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲三区欧美一区| 欧美成人午夜精品| 9191精品国产免费久久| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 久久久久精品性色| 日日撸夜夜添| 日韩精品有码人妻一区| av片东京热男人的天堂| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产97色在线日韩免费| 男女高潮啪啪啪动态图| 亚洲精品乱久久久久久| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲第一av免费看| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产野战对白在线观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 久久亚洲国产成人精品v| 少妇被粗大的猛进出69影院| 看免费成人av毛片| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 51午夜福利影视在线观看| 女人久久www免费人成看片| kizo精华| 欧美黑人精品巨大| 无遮挡黄片免费观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 99久久99久久久精品蜜桃| 精品一区在线观看国产| 久久热在线av| 国产片内射在线| 日韩成人av中文字幕在线观看| 美女国产高潮福利片在线看| 美女午夜性视频免费| 99精国产麻豆久久婷婷| 桃花免费在线播放| 丁香六月欧美| 十八禁高潮呻吟视频| 99国产精品免费福利视频| 亚洲精品自拍成人| 日韩av免费高清视频| 精品久久久精品久久久| 国产午夜精品一二区理论片| 久久免费观看电影| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 夫妻性生交免费视频一级片| 只有这里有精品99| 99久久99久久久精品蜜桃| 欧美日韩亚洲高清精品| 成人午夜精彩视频在线观看| 一区二区三区精品91| 制服诱惑二区| 日韩伦理黄色片| 欧美另类一区| 久久久精品94久久精品| 激情五月婷婷亚洲| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产片内射在线| 一区二区三区四区激情视频| 水蜜桃什么品种好| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲熟女毛片儿| 久久久久久人人人人人| 久久久久久免费高清国产稀缺| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久久国产欧美日韩av| 97在线人人人人妻| 成人午夜精彩视频在线观看| 蜜桃在线观看..| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲成人av在线免费| 这个男人来自地球电影免费观看 | 搡老乐熟女国产| 色播在线永久视频| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产亚洲一区二区精品| 丝袜脚勾引网站| 午夜福利视频在线观看免费| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产xxxxx性猛交| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 久久狼人影院| 国产不卡av网站在线观看| av有码第一页| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲视频免费观看视频| 午夜福利乱码中文字幕| 看十八女毛片水多多多| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 在线看a的网站| 亚洲精品视频女| 叶爱在线成人免费视频播放| 看十八女毛片水多多多| 99精国产麻豆久久婷婷| 这个男人来自地球电影免费观看 | 男人爽女人下面视频在线观看| 热re99久久国产66热| 国产精品一区二区精品视频观看| 欧美精品高潮呻吟av久久| 久久狼人影院| 国产在线视频一区二区| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 蜜桃国产av成人99| 国产精品久久久久久精品古装| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 成年动漫av网址| 人妻一区二区av| 国产伦人伦偷精品视频| 观看av在线不卡| 午夜激情久久久久久久| 在线精品无人区一区二区三| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲精品国产一区二区精华液| 搡老乐熟女国产| av电影中文网址| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 九色亚洲精品在线播放| 午夜精品国产一区二区电影| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久国产精品大桥未久av| 久久性视频一级片| 69精品国产乱码久久久| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| av天堂久久9| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 搡老乐熟女国产| 欧美人与性动交α欧美软件| 天堂俺去俺来也www色官网| 韩国av在线不卡| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产一区有黄有色的免费视频| 久久狼人影院| 国产欧美亚洲国产| 五月开心婷婷网| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 只有这里有精品99| 七月丁香在线播放| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 在线观看免费高清a一片| 女性被躁到高潮视频| 日韩欧美精品免费久久| 热re99久久国产66热| 丰满少妇做爰视频| 老司机影院成人| 天堂俺去俺来也www色官网| 精品视频人人做人人爽| 久久久久久久久久久免费av| 精品少妇黑人巨大在线播放| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲人成网站在线观看播放| 欧美激情高清一区二区三区 | 人人妻人人澡人人看| av一本久久久久| 中文字幕高清在线视频| 高清欧美精品videossex| 热re99久久精品国产66热6| 国产在线一区二区三区精| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲视频免费观看视频| 人体艺术视频欧美日本| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲精品国产色婷婷电影| netflix在线观看网站| 黄片播放在线免费| 99久久99久久久精品蜜桃| 久久人人爽人人片av| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 黄片小视频在线播放| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产熟女欧美一区二区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 高清av免费在线| 最近中文字幕高清免费大全6| 午夜日韩欧美国产| 99久国产av精品国产电影| 三上悠亚av全集在线观看| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 国产精品一国产av| 日本wwww免费看| 丁香六月欧美| 啦啦啦啦在线视频资源| 欧美在线黄色| 九草在线视频观看| 电影成人av| 最新在线观看一区二区三区 | 日韩欧美精品免费久久| 亚洲欧美激情在线| 秋霞伦理黄片| 欧美最新免费一区二区三区| 成人手机av| 中文字幕人妻熟女乱码| 又大又黄又爽视频免费| 国产亚洲最大av| av不卡在线播放| 中文字幕制服av| 少妇被粗大的猛进出69影院| 波野结衣二区三区在线| 91成人精品电影| 亚洲国产精品国产精品| 十八禁网站网址无遮挡| 成人亚洲欧美一区二区av| av片东京热男人的天堂| 色综合欧美亚洲国产小说| 97人妻天天添夜夜摸| 9191精品国产免费久久| 国产老妇伦熟女老妇高清| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 日日爽夜夜爽网站| 五月天丁香电影| 久久久久国产精品人妻一区二区| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产免费福利视频在线观看| 久久性视频一级片| 亚洲国产精品一区三区| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 黄频高清免费视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产精品一区二区在线不卡| 欧美久久黑人一区二区| 免费不卡黄色视频| 久久韩国三级中文字幕| 男女边吃奶边做爰视频| 国产精品一国产av| 尾随美女入室| 久久久亚洲精品成人影院| 岛国毛片在线播放| 国产有黄有色有爽视频| 街头女战士在线观看网站| 少妇人妻 视频| 99热网站在线观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产亚洲av高清不卡| 精品福利永久在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 欧美日韩成人在线一区二区| 91aial.com中文字幕在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 久久久亚洲精品成人影院| 国产av一区二区精品久久| 国产毛片在线视频| 午夜免费男女啪啪视频观看| 午夜免费观看性视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 街头女战士在线观看网站| 久久久久精品国产欧美久久久 | 欧美激情极品国产一区二区三区| 一级片免费观看大全| 一级毛片 在线播放| 丝袜美足系列| 高清欧美精品videossex| 18禁观看日本| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲综合精品二区| 国产黄色视频一区二区在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 视频在线观看一区二区三区| 午夜久久久在线观看| 久久久久精品人妻al黑| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产精品人妻久久久影院| av在线播放精品| 国产亚洲av高清不卡| 乱人伦中国视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 各种免费的搞黄视频| 国产精品久久久久久精品电影小说| 波多野结衣av一区二区av| 宅男免费午夜| 亚洲av中文av极速乱| 狂野欧美激情性xxxx| 9191精品国产免费久久| 欧美成人精品欧美一级黄| 日韩欧美一区视频在线观看| 午夜福利免费观看在线| 中国三级夫妇交换| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 下体分泌物呈黄色| 国产一区有黄有色的免费视频| 1024视频免费在线观看| 中文字幕最新亚洲高清| 曰老女人黄片| av在线app专区| 国产xxxxx性猛交| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 97在线人人人人妻| 国产爽快片一区二区三区| 黄片小视频在线播放| 亚洲精品视频女| 国产成人av激情在线播放| 97人妻天天添夜夜摸| 91成人精品电影| 熟女av电影| 最新的欧美精品一区二区| 色吧在线观看| xxxhd国产人妻xxx| 在线免费观看不下载黄p国产| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 男女边摸边吃奶| 高清av免费在线| 99久久综合免费| 亚洲av综合色区一区| 久久av网站| 九草在线视频观看| 中文字幕人妻熟女乱码| av国产精品久久久久影院| 成年av动漫网址| 欧美激情极品国产一区二区三区| 婷婷色麻豆天堂久久| 曰老女人黄片| 两个人免费观看高清视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 天美传媒精品一区二区| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲成色77777| 日韩av免费高清视频| 在线 av 中文字幕| 久久久欧美国产精品| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产成人av激情在线播放| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 97人妻天天添夜夜摸| 欧美av亚洲av综合av国产av | 一个人免费看片子| 大话2 男鬼变身卡| av在线app专区| 少妇精品久久久久久久| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产黄频视频在线观看| 国产激情久久老熟女| 又黄又粗又硬又大视频| 男人舔女人的私密视频| 五月开心婷婷网| 精品国产乱码久久久久久小说| 777米奇影视久久| 人妻人人澡人人爽人人| 老司机靠b影院| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲免费av在线视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 一个人免费看片子| 国产男女超爽视频在线观看| 精品一区二区免费观看| av国产精品久久久久影院| 一区二区三区乱码不卡18| 一级黄片播放器| 精品亚洲成国产av| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲成人手机| 丝袜喷水一区| 国产精品一区二区在线观看99| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 啦啦啦 在线观看视频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 美女主播在线视频| 欧美中文综合在线视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 在线免费观看不下载黄p国产| 免费在线观看完整版高清| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 一区二区三区四区激情视频| 国产野战对白在线观看| 亚洲精品视频女| 91精品国产国语对白视频| 秋霞伦理黄片| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 美国免费a级毛片| 18禁国产床啪视频网站| 国产黄频视频在线观看| 高清不卡的av网站| 亚洲成人一二三区av| 五月开心婷婷网| 性少妇av在线| 亚洲精品日本国产第一区| 国产淫语在线视频| 精品免费久久久久久久清纯 | 久久精品久久久久久久性| 人妻一区二区av| 各种免费的搞黄视频| 国产乱来视频区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 国产精品一区二区精品视频观看| 青春草视频在线免费观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 日本91视频免费播放| 国产伦人伦偷精品视频| 美女主播在线视频| 亚洲国产精品成人久久小说| kizo精华| 免费观看a级毛片全部| 91精品伊人久久大香线蕉| 18禁观看日本| 亚洲人成77777在线视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 亚洲成人手机| 少妇精品久久久久久久| 欧美人与善性xxx| av免费观看日本| 电影成人av| 高清av免费在线| 国产日韩欧美视频二区| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲熟女精品中文字幕| 午夜91福利影院| 嫩草影视91久久| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产精品二区激情视频| 高清av免费在线| 丝瓜视频免费看黄片| 制服诱惑二区| 老司机在亚洲福利影院| 国产av精品麻豆| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 久久狼人影院| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 久久久久视频综合| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲国产精品成人久久小说| 欧美激情高清一区二区三区 | 18禁国产床啪视频网站| 亚洲综合色网址| 美女中出高潮动态图| 大码成人一级视频| 丝袜在线中文字幕| 五月开心婷婷网| 久久久久视频综合| 久久久久网色| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产精品偷伦视频观看了| 午夜日韩欧美国产| avwww免费| 午夜老司机福利片| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 久久久久久人妻| 免费看不卡的av| 欧美日韩成人在线一区二区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 妹子高潮喷水视频| 亚洲成人av在线免费| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产成人免费观看mmmm| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲精品一二三| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 亚洲精品中文字幕在线视频| 一级,二级,三级黄色视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| h视频一区二区三区| 亚洲人成77777在线视频| 久久久久精品国产欧美久久久 | 亚洲国产日韩一区二区| 精品酒店卫生间| 国产激情久久老熟女| 国产野战对白在线观看| 久久久久久久久久久久大奶| 热re99久久国产66热| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 久久热在线av| 亚洲国产看品久久| 91国产中文字幕| 久久久久国产精品人妻一区二区| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 搡老岳熟女国产| 日韩av不卡免费在线播放| 免费观看性生交大片5| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产av码专区亚洲av| 天堂8中文在线网| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 好男人视频免费观看在线| 国产免费福利视频在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 成年动漫av网址| 免费不卡黄色视频| 黄色 视频免费看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 老司机亚洲免费影院| 欧美xxⅹ黑人| 天美传媒精品一区二区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 亚洲自偷自拍图片 自拍| 日韩一区二区视频免费看| 免费不卡黄色视频| 男人舔女人的私密视频| 亚洲av中文av极速乱| 午夜福利视频精品| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| av网站在线播放免费| 悠悠久久av| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 日韩欧美精品免费久久| 国产一区二区激情短视频 | 国产成人欧美在线观看 | 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产精品一区二区在线观看99| 久久ye,这里只有精品| 亚洲第一av免费看| 国产一区二区三区av在线| 亚洲三区欧美一区| 性高湖久久久久久久久免费观看| 久久久久人妻精品一区果冻| 免费黄网站久久成人精品| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 国产片内射在线| 在线观看免费视频网站a站|