2種食用菌NADPH氧化酶A蛋白結(jié)構(gòu)分析*

李銀鳳，劉曉柱

（貴州理工學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550003）

活性氧（reactive oxygen species，ROS） 主要包括超氧陰離子（O2-）、過(guò)氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH）以及單線(xiàn)態(tài)氧（1O2）等，其化學(xué)性質(zhì)比氧更為活潑[1-3]。幾乎所有物種暴露在含氧環(huán)境下，均能產(chǎn)生ROS[4-5]。ROS在細(xì)胞中發(fā)揮著雙重作用：一方面，過(guò)量的ROS，會(huì)造成DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)體等細(xì)胞組分的損傷，影響細(xì)胞正常生命活動(dòng)的進(jìn)行；另一方面，適量的ROS在細(xì)胞受到生物脅迫或者非生物脅迫時(shí)，可發(fā)揮信號(hào)分子和防御調(diào)節(jié)作用[6-8]。真核細(xì)胞的ROS來(lái)源包括細(xì)胞線(xiàn)粒體、NADPH氧化酶、多種酶系以及非酶系統(tǒng)等[9-11]。

NADPH氧化酶是一個(gè)多亞基構(gòu)成的蛋白復(fù)合物，可催化胞外O2生成超氧陰離子，并以此為基礎(chǔ)產(chǎn)生ROS[12]。在真菌界已發(fā)現(xiàn)NoxA、NoxB、NoxC 3個(gè)NADPH氧化酶亞家族[13]。NoxA為NADPH氧化酶亞家族一員，受到研究者的廣泛關(guān)注。NoxA與NoxB具有相同的保守結(jié)構(gòu)域，但其N(xiāo)端的結(jié)構(gòu)終端短于NoxB。研究發(fā)現(xiàn)，NoxA產(chǎn)生的ROS在真菌發(fā)育的信號(hào)通路中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，干擾NoxA的表達(dá)，使ROS的合成受阻，影響真菌子實(shí)體的分化以及生長(zhǎng)發(fā)育[14-16]。

食用菌不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，且味道鮮美，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)，已成為餐桌上一道常見(jiàn)的佳肴。分析食用菌NoxA蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可為研究NADPH氧化酶在食用菌發(fā)育信號(hào)通路中的作用提供理論依據(jù)，也為其母種的培養(yǎng)提供理論指導(dǎo)。通過(guò)從GenBank中下載平菇 （Pleurotus ostreatus） NoxA（PoNoxA）和雙色蠟?zāi)ⅲ↙accaria bicolor）NoxA（LbNoxA）蛋白序列，利用生物信息學(xué)方法比較了2種食用菌間NoxA蛋白的結(jié)構(gòu)特征，以期為食用菌的分子遺傳育種提供理論參考。

1 試驗(yàn)方法

1.1 NoxA蛋白序列分析

檢索NCBI網(wǎng)站GenBank中食用菌NoxA序列，并下載平菇NoxA基因（JN638888.1） 編碼區(qū)mRNA序列和蛋白質(zhì)序列（AEP43807.1），雙色蠟?zāi)oxA基因核苷酸序列（XM_001873736.1） 和蛋白質(zhì)序列（XP_001873771.1）。采用DNAMAN、Clustal W進(jìn)行NoxA蛋白序列的多重線(xiàn)性比對(duì)。

1.2 NoxA蛋白理化性質(zhì)分析

采用ProtParam tool在線(xiàn)工具（http://www.expasy.org/tools/protparam.html）、序列處理在線(xiàn)工具包（http://www.bio-soft.net/sms/index.html）分析NoxA蛋白分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成，分子式、半衰期、不穩(wěn)定系數(shù)等；ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）在線(xiàn)分析NoxA蛋白親疏水性質(zhì)；SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線(xiàn)分析NoxA的信號(hào)肽切割位點(diǎn)。

1.3 NoxA蛋白結(jié)構(gòu)特征分析

采用TMHMM Server v.2.0 World Wide Web Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析NoxA跨膜結(jié)構(gòu)域；采用SMART（http://smart.emblheidelberg.de/）、DSC Secondary Structure Prediction Method（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_dsc.html）、WISS-MODEL Repository （https://swissmodel.expasy.org/repository）、NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）等在線(xiàn)工具分析NoxA蛋白結(jié)構(gòu)特征。

1.4 NoxA基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

NCBI網(wǎng)站GenBank中下載相關(guān)物種NoxA基因序列，通過(guò)Clustal W和MEAG X軟件構(gòu)建NoxA系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 NoxA蛋白序列特征

平菇（PoNoxA）、雙色蠟?zāi)ⅲ↙bNoxA） 的NoxA蛋白序列比較結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，二者氨基酸序列比對(duì)一致性較高，達(dá)80%。PoNoxA氨基酸個(gè)數(shù)為560個(gè)，LbNoxA氨基酸個(gè)數(shù)為551個(gè)。PoNoxA在第327位～第341位較LbNoxA多15個(gè)氨基酸； LbNoxA在第430位～第437位較PoNoxA多7個(gè)氨基酸。PoNoxA與LbNoxA具有2個(gè)相同的FAD結(jié)合模體（FAD binding motif）、4個(gè)NADPH結(jié)合模體（NADPH binding motif）以及4個(gè)亞鐵紅素結(jié)合位點(diǎn)（heme binding） 中的保守組氨酸殘基。二者NoxA氨基酸組成分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 NoxA氨基酸組成分析結(jié)果Tab.1 Analysis of amino acid composition of NoxA

由表1可知，進(jìn)一步序列分析，PoNoxA堿性氨基酸（K、R） 為58個(gè)，酸性氨基酸 （D、E） 45個(gè)，疏水氨基酸（A、I、L、F、W、V） 220個(gè)，極性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y） 132個(gè)，脂肪族氨基酸（I、L、V） 112個(gè)，芳香族氨基酸（F、W、Y） 86個(gè)；LbNoxA堿性氨基酸（K、R） 56個(gè)，酸性氨基酸（D、E） 43個(gè)，疏水氨基酸（A、I、L、F、W、V） 222個(gè)，極性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y） 128個(gè)，脂肪族氨基酸（I、L、V） 120個(gè)，芳香族氨基酸（F、W、Y） 79個(gè)。2種食用菌NoxA氨基酸的組成（各種氨基酸的種類(lèi)與個(gè)數(shù)）較為相似。

2.2 NoxA蛋白理化性質(zhì)

ExPASy分析蛋白分子量與等電點(diǎn)結(jié)果表明，PoNoxA分子式為 C2955H4422N780O777S23，理論分子量為64.04 kDa，理論等電點(diǎn)為9.30，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中半衰期為30 h，脂肪系數(shù)為80.14，不穩(wěn)定系數(shù)為34.43，為穩(wěn)定蛋白；LbNoxA分子式為C2908H4394N770O761S20，理論分子量為63.00 kDa，理論等電點(diǎn)為9.39，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中半衰期為30 h，脂肪系數(shù)為87.66，不穩(wěn)定系數(shù)為37.06，為穩(wěn)定蛋白。2種NoxA蛋白分子量、等電點(diǎn)、脂肪系數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)等均較接近。蛋白親疏水特性分析結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，PoNoxA蛋白最大親水位點(diǎn)為第154位，氨基酸為異亮氨酸（I），分值為3.133；最小疏水位點(diǎn)均為第342位，氨基酸為賴(lài)氨酸（K），分值為-2.389，親水性的總平均值（grand average of hydropathicity，GRAVY） 為-0.060。LbNoxA蛋白最大親水位點(diǎn)為第153位，氨基酸為異亮氨酸（I），分值為3.178；最小疏水位點(diǎn)均為第392位，氨基酸為酪氨酸（Y），分值為-2.289，GRAVY為0.004。因此，2種NoxA蛋白最大親水位點(diǎn)較為相似，但最小親水位點(diǎn)不同。

另外，蛋白信號(hào)肽切割位點(diǎn)分析結(jié)果表明，在2種NoxA蛋白中均未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽切割位點(diǎn)存在。

2.3 NoxA蛋白結(jié)構(gòu)特征

SMART分析了NoxA蛋白結(jié)構(gòu)特征，預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。蛋白特征位點(diǎn)分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 NoxA蛋白特征位點(diǎn)分析結(jié)果Tab.2 Analysis of NoxA structure characteristics

由圖3、表2可知，在PoNoxA蛋白N端存在5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，2個(gè)低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)；而LbNoxA蛋白N端存在6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，中間區(qū)域存在1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，未預(yù)測(cè)到低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)存在。因此，2種食用菌NoxA蛋白N端存在5個(gè)保守的跨膜結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)，且存在位置基本一致，僅相差1個(gè)位點(diǎn)。

采用TMHMM在線(xiàn)工具進(jìn)一步分析NoxA跨膜結(jié)構(gòu)特征，NoxA蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)見(jiàn)圖4。

由圖4可知，TMHMM預(yù)測(cè)的結(jié)果與SMART預(yù)測(cè)的結(jié)果較為一致。PoNoxA蛋白N端存在5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，LbNoxA蛋白N端存在6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，中間區(qū)域存在1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)。

蛋白的結(jié)構(gòu)匹配其功能，因此在線(xiàn)分析了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征，NoxA蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果及分析見(jiàn)圖5。

由圖5二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)顯示，2種食用菌NoxA蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中均包含了無(wú)規(guī)則卷曲（random coil）、α–螺旋（alpha helix） 和鏈延伸 （extended strand）3種結(jié)構(gòu)，其分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 NoxA蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Tab.3 Analysis of NoxA secondary structures

如表3所示，在PoNoxA蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中，無(wú)規(guī)則卷曲數(shù)量最多，為311個(gè)；同樣，LbNoxA中無(wú)規(guī)則卷曲數(shù)目也最多，為326個(gè)，比PoNoxA多15個(gè)，盡管LbNoxA總的氨基酸數(shù)比PoNoxA氨基酸數(shù)少9個(gè)，但LbNoxA中無(wú)規(guī)則卷曲比例比PoNoxA高3.63%，LbNoxA所包含的阿爾法螺旋和鏈延伸2種結(jié)構(gòu)比PoNoxA低3.63%。

swiss model在線(xiàn)系統(tǒng)預(yù)測(cè)了NoxA蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)特征見(jiàn)圖6。

如圖6所示，2種食用菌NoxA蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)中同樣都包含無(wú)規(guī)則卷曲、α–螺旋和鏈延伸結(jié)構(gòu)，與其二級(jí)結(jié)構(gòu)較為一致。2種食用菌NoxA蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)整體特征較為一致。

蛋白質(zhì)的磷酸化修飾對(duì)蛋白質(zhì)的功能，特別是在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的功能發(fā)揮中起著至關(guān)重要的作用。因此對(duì)2種食用菌NoxA蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行了分析，分析結(jié)果見(jiàn)表4、圖7。

表4 NoxA蛋白磷酸化位點(diǎn)分析Tab.4 Analysis of NoxA phosphorylation sites

由圖7、表4可知，2種NoxA蛋白質(zhì)中均存在著大量的磷酸化位點(diǎn)，包括絲氨酸（serine）位點(diǎn)、蘇氨酸（threonine） 位點(diǎn)以及酪氨酸（tyrosine） 位點(diǎn)，具有潛在的磷酸激酶特性。但2種NoxA蛋白質(zhì)中絲氨酸、蘇氨酸以及酪氨酸修飾位點(diǎn)個(gè)數(shù)不同，存在位置也有差異。PoNoxA中絲氨酸、蘇氨酸以及酪氨酸修飾位點(diǎn)個(gè)數(shù)均高于LbNoxA中相應(yīng)的磷酸化修飾位點(diǎn)。

2.4 NoxA系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用MEAG X軟件構(gòu)建了2種食用菌NoxA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖8。

由圖8可知，PoNoxA與LbNoxA基因親緣關(guān)系最近，位于同一分支；PoNoxA和LbNoxA基因與灰葡萄孢霉（Botryotinia fuckeliana） 的NoxA基因親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

3 討論

在動(dòng)物、植物、部分真菌等由多細(xì)胞構(gòu)成的物種中，NoxA是細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，同時(shí)還可催化產(chǎn)生ROS；ROS作為一種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，具有調(diào)節(jié)多種生命活動(dòng)的功能[17]。因此，分析食用菌NoxA蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可為研究NADPH氧化酶在食用菌發(fā)育信號(hào)通路中的作用提供理論依據(jù)。通過(guò)GenBank搜索得到平菇和雙色蠟?zāi)?種食用菌NoxA的基因與蛋白序列，并采用生物信息學(xué)方法分析了其N(xiāo)oxA蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種食用菌在一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及三級(jí)結(jié)構(gòu)上較為一致，但也存在一些差別，如一級(jí)結(jié)構(gòu)中氨基酸的個(gè)數(shù)和比例均有所差異，二級(jí)結(jié)構(gòu)中雖然都存在無(wú)規(guī)則卷曲、阿爾法螺旋、鏈折疊結(jié)構(gòu)，但所占比例各不同。此外，2種食用菌NoxA的蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)等方面也存在差異。因此，推測(cè)2種NoxA蛋白功能較為類(lèi)似，但不完全相同。

此外，分析NoxA蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可進(jìn)一步操縱其表達(dá)，為食用菌母種的培養(yǎng)提供理論指導(dǎo)。已有研究表明，調(diào)節(jié)真菌NoxA基因的表達(dá)，會(huì)影響ROS的合成，同時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞生命活動(dòng)受到影響。如Lara-Ortíz等[18]通過(guò)沉默構(gòu)巢曲霉 （Aspergillus nidulans）NoxA基因，發(fā)現(xiàn)構(gòu)巢曲霉不能有效形成閉囊殼，但其菌絲體的生長(zhǎng)和無(wú)性生殖未受影響；突變柄孢殼委陵菜（Podospora anserina） NoxA基因，則導(dǎo)致其產(chǎn)囊體轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒熳幽覛みM(jìn)程受阻，與野生型菌株相比，ROS產(chǎn)生量明顯降低[19]。通過(guò)分析2種食用菌NoxA蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可進(jìn)一步通過(guò)基因工程的方法，應(yīng)用于平菇與雙色蠟?zāi)⒌挠N中。