固相萃取-UPLC-MSMS法測(cè)定水產(chǎn)品中15種磺胺類藥物殘留

彭蕓

摘 要：建立了一種Captiva EMR-Lipid固相萃取柱凈化，用UPLC-MS/MS法測(cè)定中15種磺胺類藥殘留的方法。該方法的前處理僅需進(jìn)行甲酸乙腈溶液提取，離心，上清液直接通過固相萃取柱凈化，濃縮，外標(biāo)法測(cè)定。結(jié)果表明：該方法在10.0～100.0 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r均大于0.99，檢出限為0.25 μg·kg-1，定量限為0.5 μg·kg-1;加標(biāo)回收率范圍在62.3%～93.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.1%～7.8%。實(shí)驗(yàn)證明，該方法前處理較國(guó)標(biāo)方法簡(jiǎn)單、快捷，可為水產(chǎn)品中磺胺類藥物殘留的快速檢測(cè)提供方法依據(jù)。

關(guān)鍵詞：磺胺類藥物;固相萃取;水產(chǎn)品

Abstract：Using UPLC-MS/MS method to determine 15 kinds of sulfonamide residues in the method， a Captiva EMR-Lipid solid phase extraction column was established. The pretreatment of this method only needs to extract formic acid acetonitrile solution， centrifuge， and the supernatant is directly purified by solid phase extraction column， concentrated， and determined by external standard method. The results show that the linear relationship is good in the range of 10.0～100.0 ng·mL-1，

r is greater than 0.99， the detection limit is 0.25 μg·kg-1， the limit of quantification is 0.5 μg·kg-1; the recovery rate of standard addition ranges 62.3%～93.4%， and the relative standard deviation is 1.1%～7.8%. Experiments have proved that this method is simpler and faster than the national standard method， and can provide a method basis for the rapid detection of sulfa drug residues in aquatic products.

Key words：Sulfa drugs; Solid phase extraction; Aquatic products

中圖分類號(hào)：TS254.7

磺胺類藥物（Sulfonamides）是含有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類人工合成的廣譜抗菌藥物，該類藥物種類繁多，應(yīng)用廣泛[1]?；前奉愃幬锬芤种拼蠖鄶?shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌，性質(zhì)穩(wěn)定且成本低。隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，為降低水產(chǎn)品的發(fā)病率，提高水產(chǎn)品的質(zhì)量方面有較明顯的效果，但磺胺類藥物在動(dòng)物體內(nèi)代謝時(shí)間較長(zhǎng)，易造成蓄積和殘留，食用含有磺胺類藥物的禽畜產(chǎn)品會(huì)對(duì)人體造成潛在的危害，有潛在的致癌性[2-4]。

目前，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中檢測(cè)磺胺類藥物的方法主要包括高效液相色譜法、氣相色譜法、高效毛細(xì)管電泳法、酶聯(lián)免疫分析法、生物傳感器免疫分析法、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜質(zhì)譜法、超臨界流體色譜法和微生物法等[5]。其中，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、重現(xiàn)性好等優(yōu)勢(shì)。

水產(chǎn)品中還有大量蛋白質(zhì)、磷脂、脂溶性色素等化合物，易造成基質(zhì)效應(yīng)，影響分離效果，因此需對(duì)提取樣品進(jìn)行純化，減少樣品干擾。由于國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)磺胺類藥物的前處理方法步驟繁瑣，小柱在使用之前要活化、平衡，需要一定時(shí)間，浪費(fèi)溶劑，不利于快速批量檢測(cè)。本次實(shí)驗(yàn)采用Captiva EMR-Lipid固相萃取柱凈化，改進(jìn)了前處理方法，優(yōu)化了儀器檢測(cè)條件，該方法操作簡(jiǎn)便，其基質(zhì)干擾小、分析速度快，能有效地提高檢測(cè)時(shí)間，且節(jié)省試劑消耗，可以作為快速篩查方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Waters Xevo TQ-S Micro三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（配有Acquity UPLC 超高效液相色譜儀及電噴霧離子源），美國(guó)Waters公司生產(chǎn);SIGMA高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)SIGMA公司生產(chǎn);Milli Q超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司生產(chǎn);IKA刀式研磨儀、IKA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、渦旋振蕩器，均為美國(guó)IKA公司生產(chǎn);Captiva EMR-Lipid固相萃取柱，美國(guó)Agilent公司生產(chǎn)。

1.2 材料與試劑

15種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品：甲氧芐啶（Trimethoprim）、

磺胺吡啶（Sulfapyridine）、磺胺噻唑（Sulfathiazole）、磺胺甲嘧啶（Sulfamerazine）、磺胺?唑（Sulfamoxole）、磺胺二甲嘧啶（Sulfadimidine）、磺胺甲氧嗪（Sulfamethoxypyridazine）、磺胺甲二唑（Sulfamethizole）、磺胺對(duì)甲氧嘧啶（Sulfamethoxydiazine）、磺胺間甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine）、磺胺多辛（Sulfadoxine）、磺胺甲?唑（Sulfamethoxazole）、磺胺異?唑（Sulfafurazole）、磺胺苯酰（Sulfabenzamide）、磺胺地索辛（Sulfadimethoxine），純度≥98%，A ChemTek Inc。甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨，均為色譜純，默克公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取15種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇稀釋，最后用相應(yīng)的空白樣品基質(zhì)提取液制備混合標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為10.0、20.0、40.0、60.0 ng·mL-1和

100.0 ng·mL-1。

1.3.2 樣品前處理

魚肉組織先經(jīng)研磨儀絞碎并使之均勻化，稱取

5 g試樣于50 mL塑料離心管中，加入2 mL水、2%甲酸乙腈4 mL，樣液渦旋混勻后，9 000 r·min-1離心10 min，收集提取液，再加入5%甲酸乙腈4 mL，同上渦旋離心，合并兩次提取液，取上清液3 mL直接通過不經(jīng)活化的Captiva EMR-Lipid固相萃取柱，再用2 mL乙腈洗滌柱子，收集全部流出液，在40 ℃條件下旋蒸或者氮?dú)獯抵两?，?0%甲醇水溶液復(fù)溶殘?jiān)⒍ㄈ葜? mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3.3 儀器條件

色譜條件。色譜柱為Waters Acquity BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）;柱溫30 ℃;流速0.25 mL·min-1;進(jìn)樣量2μL;流動(dòng)相：A相為甲醇，B相為0.1%甲酸水溶液;梯度洗脫程序：0～1.00 min，10%A;1.01～3.00 min，10%～40%A;3.01～8.00 min，40%A;8.01～11.00 min，10%A。質(zhì)譜條件。離子化模式：電噴霧離子源ESI，正離子模式;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）檢測(cè)模式;毛細(xì)管電壓1.0 kV;脫溶劑氣溫度400 ℃;脫溶劑氣流量800 L·min-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

磺胺類藥物（SAs）屬于兩性物質(zhì)，易溶于乙腈、甲醇等有機(jī)溶劑，本實(shí)驗(yàn)分別比較了0.1%甲酸溶液-乙腈、0.1%甲酸（含5 mmo·L-1乙酸銨溶液）-乙腈、0.1% 甲酸溶液-甲醇、0.1%甲酸（含5 mmol·L-1乙酸銨溶液）-甲醇流動(dòng)相體系梯度洗脫對(duì)15種磺胺類藥物響應(yīng)值和分離度的影響，結(jié)果顯示，使用0.1%甲酸溶液-甲醇梯度洗脫，使各組分獲得較好的分離效果，響應(yīng)值最強(qiáng)且峰型較好。15種磺胺類藥物在此條件下的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)圖如圖1所示。

2.2 質(zhì)譜條件的確定

將濃度為300 ng·mL-1的15種磺胺類藥物以流動(dòng)注射的方式，在正離子模式下對(duì)質(zhì)譜參數(shù)毛細(xì)管電壓、錐孔電壓以及碰撞能量等進(jìn)行調(diào)諧優(yōu)化。15種磺胺類藥物多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化結(jié)果見表1。

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

由于磺胺類藥物很難溶于水，更易溶解于極性有機(jī)溶劑中，本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈和甲醇的提取效果。相比甲醇而言，乙腈沉淀蛋白的效果較強(qiáng)，選擇了乙腈作為提取溶劑，同時(shí)整個(gè)藥物處理中具有一定的弱堿性，需要借助酸性乙腈作為樣品處理溶劑，用甲酸乙腈作為提取試劑得到的色譜峰雜峰少，本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了不同濃度的甲酸乙腈，單純用2%甲酸乙腈或5%甲酸乙腈的提取效果欠佳，回收率在40%～50%。結(jié)果顯示，綜合2%甲酸乙腈和5%甲酸乙腈提取效果更佳，回收率也相對(duì)提高。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 方法的線性范圍及檢出限

本實(shí)驗(yàn)采用空白基質(zhì)加標(biāo)制備混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的方式，稱取5份5 g的陰性樣品，按上述前處理方法提取得到空白基質(zhì)液，分別配制成濃度為10、20、40、60 ng·mL-1和100 ng·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以待測(cè)物的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)制，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明，15種磺胺類藥物在10～100 μg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均在0.99以上，見表2。以3倍信噪比（S/N>3）計(jì)算檢出限為0.25 μg·kg-1，以10倍信噪比（S/N>10）計(jì)算定量限為0.5 μg·kg-1。

2.4.2 回收率和精密度

本實(shí)驗(yàn)采用以未檢出待測(cè)組分的樣品做添加回收實(shí)驗(yàn)，來驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，在魚肉空白樣品中分別添加不同量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（添加水平分別為8、10、16 μg·kg-1），每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行樣，按上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定各種磺胺類藥物的平均回收率在62.3%～93.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.1%～7.8%，滿足GB/T 27417-2017《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》的要求。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

3 結(jié)論

本文采用甲酸乙腈提取，CaptivaEMR-Lipid固相萃取柱凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了水產(chǎn)品中15種磺胺類藥物殘留的檢測(cè)方法。結(jié)果表明，該前處理方法快速方便，凈化步驟使得基質(zhì)干擾小，本方法線性、回收率、精密度均滿足檢測(cè)要求，可用于水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)時(shí)大批量樣品中磺胺藥物的快速篩查。

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