利用二乙基亞硝胺聯(lián)合處理N-亞硝基嗎啉和2/3肝部分切除方法改良的大鼠中晚期肝癌模型

張梅,洪澤宣,鄒昕羽,王劍,王自力,李曉清,金美蘭?

(1.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,重慶 400715;2.重慶市中醫(yī)院腫瘤科,重慶 400021)

肝細(xì)胞癌(肝癌,HCC)是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。根據(jù)2018年統(tǒng)計(jì)報(bào)道,肝癌的發(fā)病率為4.7%,而死亡率為8.25%,我國(guó)在亞洲地區(qū)肝癌的發(fā)病率高達(dá)46.7%[1-2],然而人類日常生活中接觸的致癌劑中有60%會(huì)導(dǎo)致肝癌,且發(fā)現(xiàn)時(shí)60%以上的病例已進(jìn)入中晚期。盡管在早期診斷和治療肝癌方面已有一些進(jìn)展,但是肝癌的死亡率還是居高不下,而且死亡原因大部分都是由于晚期肝癌的轉(zhuǎn)移[2-3]。因此,研究開(kāi)發(fā)預(yù)防及治療中晚期肝癌的有效方法迫在眉睫。然而研究抗癌藥物的篩選及抗癌機(jī)制的研究離不開(kāi)有效的動(dòng)物模型。

建立與人類肝癌發(fā)病機(jī)制相似,并接近臨床的動(dòng)物模型,不但對(duì)肝癌的發(fā)病機(jī)制的研究有重要意義,而且有利于抗癌藥物的開(kāi)發(fā)研究。大鼠肝癌模型一般有誘導(dǎo)型、移植型和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物腫瘤模型三種,其中誘導(dǎo)型肝癌模型在誘發(fā)原因、發(fā)展過(guò)程以及轉(zhuǎn)移途徑最接近臨床[4-5]。2004年,Hiroko等[6]利用100 mg/kg二乙基亞硝胺(DEN)和40、80 ppmN-亞硝基嗎啉(NMOR)聯(lián)合誘導(dǎo)的方法在F344大鼠建立了肺轉(zhuǎn)移的HCC動(dòng)物模型,但是該方法有周期較長(zhǎng)且死亡率較高的缺點(diǎn)。另外,2007年,Hokaiwado等[7]使用100 mg/kg DEN和40 ppm NMOR聯(lián)合誘導(dǎo)的方法在Tg SD大鼠建立了中晚期肝癌,但是該方法使用了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物造模成本較高,且造模時(shí)間也長(zhǎng),不適用于一般科研。目前國(guó)際上已有以多階段致癌假設(shè)為基礎(chǔ)的二乙基亞硝胺(DEN)聯(lián)合肝部分切除(partial hepatectomy,PH)法,可以在短時(shí)間內(nèi)建立早期肝癌模型。另外,利用大鼠建立肝癌模型,雖然不允許像小鼠模型那樣進(jìn)行基因操作[8],但是在大鼠中比在小鼠中更容易執(zhí)行諸科手術(shù)等特定治療。適用于通過(guò)超聲對(duì)HCC的發(fā)展進(jìn)行無(wú)創(chuàng)監(jiān)測(cè)。此外,HCC大鼠模型與人類HCC的組織病理學(xué)進(jìn)展高度相似,對(duì)于鑒定有效的抗癌治療具有重要價(jià)值[9]。因此為了開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)周期較短、死亡率低、造模成本低、且適用于肝癌研究的動(dòng)物模型,在現(xiàn)有造模方法的基礎(chǔ)上結(jié)合DEN+PH法進(jìn)行了優(yōu)化和改進(jìn),探索了建立可轉(zhuǎn)移的中晚期肝癌模型的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡的SPF級(jí)SD雄性大鼠61只,購(gòu)自重慶市中藥研究所【SCXK(渝)2018-0003】,體重(100±20)g。所有大鼠飼養(yǎng)于空調(diào)動(dòng)物房【SYXK(渝)2017-0019】,晝夜明暗交替時(shí)間為12 h/12 h,溫度22～26°C,相對(duì)濕度40%～70%,每籠飼養(yǎng)2～3只。所有操作符合西南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)(IACUC-20170206-03)的要求,所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則進(jìn)行。

1.1.2 主要試劑與儀器

二乙基亞硝胺(N-nitrosodiethylamine,DEN)和N-亞硝基嗎啉(N-nitroso-morpholine,NMOR)均購(gòu)置于上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司。伊紅、蘇木素、甲醛等均購(gòu)置于成都市科龍化工試劑廠。切片機(jī)(Leica RM2235,德國(guó))、展片機(jī)(Leica HI1210,德國(guó))、烘片機(jī)(Leica HI1220,德國(guó))、光學(xué)顯微鏡(Olympus BX53,日本)、組織包埋機(jī)(浙江科迪KDBMIII,中國(guó))。

1.2 方法

61只SPF級(jí)SD大鼠,經(jīng)1周適應(yīng)性喂養(yǎng)后隨機(jī)分為三組:第1組,16只;第2組,30只;第3組,15只。實(shí)驗(yàn)第1天所有動(dòng)物均腹腔注射200 mg/kg的DEN,同時(shí)第1組動(dòng)物自由飲用含40 ppm NNOR染毒水共20周,第15周隨機(jī)解剖5只SD大鼠,第20周結(jié)束后解剖剩余的動(dòng)物。在第2組,DEN處理后動(dòng)物自由飲用含80 ppm NMOR的染毒水1周之后停藥1周,再給含40 ppm NMOR的染毒水兩周,第5周開(kāi)始恢復(fù)80 ppm的NMOR染毒水,直到第10周,從第11周開(kāi)始停止給藥直到17周結(jié)束。在第10周隨機(jī)解剖3只大鼠,第17周結(jié)束時(shí)解剖了剩余的動(dòng)物。在第3組,DEN處理后動(dòng)物每天灌胃給藥0.8 mg/kg NMOR共17周,從第18周開(kāi)始停止給藥直到24周結(jié)束。為了增強(qiáng)細(xì)胞增殖活性在第2周結(jié)束時(shí)給第1組和第3組動(dòng)物實(shí)施了2/3肝部分切除術(shù)(見(jiàn)圖1)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察記錄了動(dòng)物的臨床狀態(tài)、體重、攝水量。解剖時(shí),動(dòng)物使用2.5%的異氟烷深度吸入麻醉后腹主動(dòng)脈放血處死,采取肝和肺稱重,同時(shí)采取其余臟器拍照記錄眼觀變化后置于10%中性福爾馬林溶液固定,并進(jìn)行H&E染色和病理組織學(xué)檢查。

圖1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Figure 1 Experimental design

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。對(duì)眼觀變化和病理組織學(xué)檢查結(jié)果使用費(fèi)舍爾精確檢驗(yàn)(fisher exact test)比較組間差異,并以?P<0.05表示差異具有顯著性,??P<0.01為差異極具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 臨床狀態(tài)、體重及臟器重量

從第6周開(kāi)始各組動(dòng)物均開(kāi)始出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象,第2組、第3組動(dòng)物脫毛較嚴(yán)重。第3組動(dòng)物解剖時(shí)相對(duì)肝重量比第1、2組略增加(見(jiàn)表1)。

2.2 生存率

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,第1、3組因手術(shù)處理分別死亡1、3只動(dòng)物,第3組1只動(dòng)物因?qū)嶒?yàn)操作不當(dāng)死亡。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間第1組未出現(xiàn)藥物引起的動(dòng)物死亡,生存率為100%;第2組因藥物的急性毒性從第3周到第8周陸續(xù)出現(xiàn)7只動(dòng)物死亡,死亡動(dòng)物解剖可見(jiàn)大量腹水,第9周生存率77%直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束為止;第3組除上述原因死亡1只動(dòng)物外,從給藥結(jié)束到第20周生存率為100%,之后21周到24周的生存率依次為91%、73%、64%、55%(見(jiàn)圖2),且后期動(dòng)物死亡的原因均是肝癌的形成。

表1 最終體重和肝重量Table 1 Body and liver weights

圖2 生存率曲線Figure 2 Survival curves

2.3 眼觀變化

解剖過(guò)程中可見(jiàn)動(dòng)物肝肥大、增生性結(jié)節(jié)、質(zhì)地硬化、表面凹凸不平,出血點(diǎn)或出血斑;肺有出血點(diǎn)或出血斑,結(jié)節(jié);脾肥大等病變(見(jiàn)表2)。

在第1組,第15周各臟器均無(wú)明顯的病理變化(圖3A、3B),第20周肝腫大,表面凹凸不平,個(gè)別動(dòng)物肺表面有輕微的點(diǎn)狀出血(圖3C、3D),兩只動(dòng)物出現(xiàn)脾腫大。在第2組,第10和17周均可見(jiàn),肝表面凹凸不平,有出血斑和大小不等的白色結(jié)節(jié)(圖3E、3G),且白色結(jié)節(jié)的發(fā)病率達(dá)到60%與第1組相比有顯著差異(P<0.05)。少數(shù)肺表面可見(jiàn)輕微點(diǎn)狀出血(圖3F、3H),1只動(dòng)物可見(jiàn)脾腫大。在第3組,實(shí)驗(yàn)期間死亡或解剖的動(dòng)物均可見(jiàn)肝表面凹凸不平、質(zhì)地硬,有出血斑和直徑約2～3 cm不等的灰白色結(jié)節(jié),結(jié)節(jié)的發(fā)病率達(dá)到100%與第一組相比有極顯著差異(P<0.01)。肺表面可見(jiàn)出血斑(圖3I、3J)發(fā)病率為83%與第1組和第2組相比均有極顯著差異(P<0.01),兩只動(dòng)物可見(jiàn)脾腫大。

2.4 病理組織學(xué)檢查

在第1組,第15周和20周解剖動(dòng)物的肝均出現(xiàn)肝細(xì)胞空泡變性、纖維結(jié)締組織增生,而20周時(shí)這些變化更明顯,形成假小葉,并且出現(xiàn)變異細(xì)胞灶發(fā)病率為90%(圖4A),僅1只動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)肝癌發(fā)病率為10%(表3)。肺組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯病理變化(圖4D)。在第2組,第10周和17周解剖的動(dòng)物的肝分別可見(jiàn)67%和65%的變異細(xì)胞灶,另外17周動(dòng)物腺瘤的發(fā)病率為25%(圖4B)。第10周解剖時(shí)有1只動(dòng)物形成肝癌,第17周解剖時(shí)有兩只動(dòng)物形成肝癌,除前期因急性毒性而死亡的動(dòng)物外,發(fā)生率分別為33%和10%(表3)。肺出現(xiàn)少量出血,但未見(jiàn)轉(zhuǎn)移灶(圖4E)。在第3組,第24周時(shí)肝可見(jiàn)變異細(xì)胞灶,腺瘤以及細(xì)胞和結(jié)構(gòu)異型性強(qiáng),有大量的核分裂像的肝癌(圖4C)等不同階段的腫瘤性病變,腫瘤發(fā)生率為100%,肝癌發(fā)病率為91%與第1組和第2組相比有極顯著差異(P<0.01)(表3)。肺組織還可見(jiàn)肝癌的轉(zhuǎn)移灶,轉(zhuǎn)移率為55%(表3),與第1組和第2組相比有顯著或極顯著差異(P<0.05或P<0.01)。此外,肺還可見(jiàn)出血、間質(zhì)性肺炎和肺腺瘤。

表2 眼觀變化Table 2 Macroscopic observations

圖3 眼觀變化圖片Note.A,B,The liver and lung in the Group 1 showed no obvious change at 15 weeks.C,D,White nodules and Surface roughness in the liver and petechial in the lungs observed in the Group 1 at 20 weeks.E,G,The liver in the Group 2 was rough and hard at 10 and 17 weeks.In addition,there are petechia and white nodules.F,H,The lungs in the Group 2 observed slight peterchia at 10 and 17 weeks.I,J,The liver in the Group 3 was rough at 24 weeks.In addition,there were petechia and gray nodules.In addition,there was observed ecchymosis in the lung.Figure 3 Macroscopic observation photograph

表3 肝和肺的病理組織學(xué)檢查Table 3 Histopathological findings in the liver and lung tissue

3 討論

之前,Hiroko等[6]、Hokaiwado等[7]利用遺傳毒性致癌物DEN和NMOR制造過(guò)中晚期肝癌模型,但是這些方法有實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng),死亡率高,成本高等的缺點(diǎn),不適合用于一般研究。DEN是一種N-亞硝基類化合物,是遺傳毒性致癌物,因誘癌效果穩(wěn)定,周期相對(duì)較短常使用于誘導(dǎo)肝癌[10-11]。NMOR是IARC公布的2B類致癌藥物,在煙熏制食品中存在較多,會(huì)引起動(dòng)物器官和組織腫瘤[12-13]。DEN誘導(dǎo)肝癌模型與人類肝癌的發(fā)病經(jīng)過(guò)比較相近,呈現(xiàn)階段性進(jìn)展、分期明顯,但是其肝外轉(zhuǎn)移率很低,因此常與遺傳毒性或非遺傳毒性致癌物聯(lián)合使用,誘導(dǎo)形成高轉(zhuǎn)移性肝癌模型[14-15]。PH法是Ito等[16-18]開(kāi)發(fā)的增強(qiáng)細(xì)胞增殖活性,加快制造肝癌時(shí)間的一種方法。因此,為了建立接近臨床,符合一般研究需求的中晚期肝腫瘤模型,聯(lián)合應(yīng)用兩階段致癌方法及肝部分切除術(shù)法,在現(xiàn)有的建模方案的基礎(chǔ)上提出了三種不同的修改方案。方案一:增加DEN的給藥劑量,再加入肝部分切除術(shù)從而加快造模時(shí)間的方法。方案二:增加DEN的給藥劑量的同時(shí)使用兩種不同劑量NMOR的聯(lián)合給藥方式。方案三:增加DEN給藥劑量的同時(shí)改變NMOR的給藥方式,并再加入肝部分切除術(shù)的方法。

圖4 代表性肝腫瘤性病變的病理組織學(xué)圖片Note.A/a,An altered cell foci of the liver in the Group 1 with vacuolation(10×/40×).B/b,An adenoma of the liver in the Group 2(10×/40×).C/c,A carcinoma of the liver in the Group 3(10×/40×).D,The lung of animals in the Group 1 showed no obvious change(10×).E,The lung of animals in the Group 2 showed pulmonary hemorrhage(10×).F/d,The lung tissues of animals in the Group 3 showed metastasis foci of hepatocarcinoma(10×/40×).Figure 4 Microphotographs of representative liver tumors

結(jié)果表明,方案一:200 mg/kg的DEN聯(lián)合40 ppm的NMOR在20周內(nèi)可以建立有變異細(xì)胞灶的早期肝癌模型,但不能建立有腺瘤或癌的中晚期肝癌模型,其存活率為100%。方案二:200 mg/kg DEN聯(lián)合40、80 ppm的NMOR間斷性飲水給藥10周飼養(yǎng)17周的方法,可建立35%的動(dòng)物形成腺瘤和癌的中晚期肝癌模型,但是給藥前期會(huì)出現(xiàn)大量的急性毒性引起動(dòng)物的死亡。方案三:200 mg/kg DEN聯(lián)合0.8 mg/kg NMOR連續(xù)灌胃給藥17周飼養(yǎng)24周,并加入肝部分切除術(shù)的方法,可以建立肝腺瘤及癌發(fā)病率為100%,最終生存率55%,并且肺轉(zhuǎn)移率55%的中晚期肝癌。由此可見(jiàn),方案三不僅在肝癌發(fā)病率及肺轉(zhuǎn)移率上顯著高于前兩種方案,而且到給藥結(jié)束為止有穩(wěn)定的生存率,適合利用與建立中晚期肝腫瘤模型。方案一:雖然生存率高,但是致癌率低,大部分的病變是早期肝癌的變異細(xì)胞灶,適用于初探藥物對(duì)肝腫瘤形成初級(jí)階段的作用效果及預(yù)防效果的研究。方案二:癌發(fā)病率較低,沒(méi)有肺轉(zhuǎn)移,且前期可出現(xiàn)急性毒性死亡動(dòng)物造模方法不穩(wěn)定,因此不適合應(yīng)用于中晚期肝癌模型建立。另外,方案三與Hiroko等[6]利用100 mg/kg DEN和80 ppm NMOR聯(lián)合給藥24周的方法在F344大鼠上建立的生存率57%,致癌率100%,轉(zhuǎn)移率55%的建模方法相比,雖然生存率略低,但是給藥周期為17周較短,且給藥期間除了人為的原因以外沒(méi)有出現(xiàn)死亡動(dòng)物,因腫瘤引起的死亡均在20周后,20周為止的生存率為100%。這些結(jié)果說(shuō)明給藥結(jié)束時(shí)大鼠肝中已形成后期可轉(zhuǎn)移的腺瘤及癌,該方法不僅顯著縮短了給藥周期,而且顯著提高了生存率。與Hokaiwado等[7]的利用轉(zhuǎn)基因大鼠,實(shí)驗(yàn)周期為28周的肝癌發(fā)病率100%,轉(zhuǎn)移率60%的方法相比,雖然肝癌發(fā)病率和轉(zhuǎn)移率略低,但是本建模方法使用非轉(zhuǎn)基因大鼠可大大降低造模成本,且實(shí)驗(yàn)周期較短。由此可見(jiàn),方案三不僅實(shí)驗(yàn)周期短,致癌率及轉(zhuǎn)移率高,建模成本低適合應(yīng)用于一般的科學(xué)研究。

總之,本實(shí)驗(yàn)使用兩階段致癌方法及肝部分切除術(shù)法對(duì)現(xiàn)有的造模方法進(jìn)行了改良,探索了建模時(shí)間較短,發(fā)病率和生存率高,穩(wěn)定性強(qiáng)的中晚期肝腫瘤模型方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,200 mg/kg DEN聯(lián)合0.8 mg/kg NMOR連續(xù)灌胃給藥17周,并加入PH的方法,能在20周內(nèi)建立肝腺瘤及癌發(fā)病率100%,生存率100%,后期還可出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的中晚期肝腫瘤模型。該方法不僅造模時(shí)間短,造模效果較穩(wěn)定,且造模成本低,為肝癌防治及機(jī)理研究提供理想的模型。