小鼠經(jīng)骨髓注射肺轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)模型的建立

焦肖寧,侯怡飛,朱楊壯壯,蘇琳,張飛,陳曉,朱詩(shī)國(guó),韋璐瑤王萬(wàn)濤,王杰,朱嫻丹,鄒純樸?,胥孜杭?

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,上海 201203;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院,上海 200092;3.上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實(shí)驗(yàn)中心,上海201203)

惡性腫瘤是對(duì)人類健康最具威脅性的疾病之一,全球最新癌癥報(bào)告顯示:2018年全球惡性腫瘤新發(fā)病例約1810萬(wàn)例,死亡約960萬(wàn)例。其中乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤,這與國(guó)家癌癥中心最新出爐的癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)相一致[1-2]。惡性腫瘤轉(zhuǎn)移是造成乳腺癌等惡性腫瘤患者死亡的主要原因,盡管手術(shù)治療在一定程度上可以延長(zhǎng)患者生存期,但術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)往往會(huì)加快疾病進(jìn)程[3]。在眾多器官中,肺是血液循環(huán)的關(guān)鍵,其具有豐富的血管,因此肺常常是腫瘤轉(zhuǎn)移的靶器官[4]。目前針對(duì)腫瘤肺轉(zhuǎn)移的有效治療仍以化療為主,但化療的副作用降低了患者的生存質(zhì)量。因而,建立理想的肺轉(zhuǎn)移模型是研究惡性腫瘤肺轉(zhuǎn)移機(jī)制的關(guān)鍵之一。

乳墊注射、皮下注射和尾靜脈注射等是常見(jiàn)的動(dòng)物肺轉(zhuǎn)移模型構(gòu)建方法,其中尾靜脈注射具有實(shí)驗(yàn)周期短和轉(zhuǎn)移效率高的特點(diǎn),因而是建立惡性腫瘤肺轉(zhuǎn)移最常用的模型[5]。有學(xué)者提出在骨髓微環(huán)境中,腫瘤細(xì)胞可以加快毛細(xì)血管的增加和原發(fā)腫瘤的增長(zhǎng),其衍生的相關(guān)免疫細(xì)胞如髓源抑制細(xì)胞等可以促進(jìn)腫瘤向遠(yuǎn)端器官的轉(zhuǎn)移[6]。骨髓注射法是將腫瘤細(xì)胞注射到骨髓腔的一種模型建立方法,其還原了腫瘤轉(zhuǎn)移的多個(gè)步驟,如原發(fā)腫瘤形成、毛細(xì)血管的新生、腫瘤細(xì)胞入侵、血流播散和黏附生長(zhǎng)等[7-8],更為接近人類腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程。目前構(gòu)建術(shù)后復(fù)發(fā)的小鼠模型,多使用皮下注射法和乳墊注射法[9-10]。盡管有相關(guān)研究表明骨髓注射法具有高轉(zhuǎn)移效率和較高臨床價(jià)值,但國(guó)內(nèi)外研究尚少,其使用頻率仍較低[11]。故本研究通過(guò)比較多種肺轉(zhuǎn)移模型建立,以此為腫瘤轉(zhuǎn)移和治療提供新的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株乳腺癌4T1細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù),細(xì)胞編號(hào)SCSP-5056,穩(wěn)定傳至4～5代。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5～6周齡65只SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠,體重18～20 g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司上海分公司【SCXK(滬)2017-0011】,飼養(yǎng)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司上海分公司【SYXK(滬)2017-0014】。動(dòng)物飼養(yǎng)在SPF級(jí)屏障環(huán)境內(nèi),屏障內(nèi)溫度為20～26℃,相對(duì)濕度為50%～70%,12 h晝夜交替。動(dòng)物飼養(yǎng)期間,給予齒類動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼料,自由飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)開(kāi)展已獲上海中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)的同意,倫理編號(hào)為PZSHUTCM191129002。

1.1.3 試劑

DMEM培養(yǎng)基,10%胎牛血清,青霉素-鏈霉素,含0.25%EDTA的胰蛋白酶(Thermo Fisher Scientific公司,批號(hào)分別為11995065,10091148,15140122,25200072);Luciferase底物(德國(guó)Perkin Elmer公司,K9929PE);4%多聚甲醛(上海翊圣生物科技有限公司,批號(hào)36314ES76);羅紅霉素(廣東恒健制藥有限公司,批號(hào)80214-83-1)。

1.1.4 儀器

Leica DMi1型顯微鏡(德國(guó)Leica公司),Lumina XR型Caliper精諾真生物發(fā)光/熒光活體分子成像系統(tǒng)(IVIS Lumina XR Imaging System,德國(guó)PerkinElmer公司),JY2002型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)Luciferase熒光素酶4T1細(xì)胞構(gòu)建

細(xì)胞構(gòu)建所用慢病毒為GM-2439LV18-CMVluc-PGK-Puro,慢病毒滴度為1E8 TU/mL,該病毒購(gòu)自吉滿生物科技(上海)有限公司,根據(jù)制造商說(shuō)明進(jìn)行操作。使用10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)4T1細(xì)胞,病毒感染前將細(xì)胞接種于35 mm培養(yǎng)皿中,當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)開(kāi)始進(jìn)行感染,感染48 h后加入10μg/mL的嘌呤霉素進(jìn)行抗性克隆篩選,挑選表達(dá)Luciferase陽(yáng)性細(xì)胞,然后用10μg/mL的嘌呤霉素進(jìn)行維持。

1.2.2 乳墊注射轉(zhuǎn)移模型的建立

將4T1細(xì)胞培養(yǎng)于含有1%青霉素-鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,置于5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,用含0.25%EDTA的胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞5 min,使用PBS重懸后并計(jì)數(shù),調(diào)整至每只小鼠注射濃度為5×105/100μL。將細(xì)胞懸液吸入預(yù)冷的1 mL注射器。將小鼠麻醉,切開(kāi)右側(cè)胸壁1 cm,暴露第4對(duì)乳墊后緩慢向內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞懸液[12]。

1.2.3 皮下注射轉(zhuǎn)移模型的建立

細(xì)胞培養(yǎng)、計(jì)數(shù)、濃度同上所述,小鼠麻醉后俯臥位,定位背側(cè)肩胛骨,將腫瘤細(xì)胞懸液緩慢注射入小鼠背側(cè)肩胛骨間[13]。

1.2.4 骨髓注射肺轉(zhuǎn)移模型的建立

細(xì)胞培養(yǎng)、計(jì)數(shù)同上,4T1細(xì)胞濃度為每只小鼠注射5×105/50μL、3×105/50μL、1×105/50μL。小鼠麻醉后仰臥位暴露脛骨結(jié)節(jié),定位小鼠脛骨結(jié)節(jié),用胰島素注射器穿刺進(jìn)入骨髓腔內(nèi),抽吸出少量髓液以降低骨髓腔壓力,用胰島素注射器緩慢注入細(xì)胞懸液,緩慢出針以防懸液溢出。用干棉球擦去脛骨外的腫瘤細(xì)胞以避免出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果[14]。

1.2.5 尾靜脈注射轉(zhuǎn)移模型的建立

細(xì)胞培養(yǎng)、計(jì)數(shù)同上所述,調(diào)整4T1細(xì)胞濃度為每只小鼠5×105/100μL。小鼠麻醉后,定位尾端靜脈,將腫瘤細(xì)胞懸液通過(guò)尾靜脈直接注射到小鼠體內(nèi)[15]。

1.2.6 術(shù)后復(fù)發(fā)模型的建立

細(xì)胞培養(yǎng)、計(jì)數(shù)同上所述,調(diào)整4T1-luc細(xì)胞濃度為每只小鼠1×105/50μL。小鼠麻醉后,暴露股動(dòng)脈,并對(duì)其進(jìn)行結(jié)扎。使用手術(shù)剪刀在膝關(guān)節(jié)上方進(jìn)行截肢,隨后使用無(wú)菌可吸收縫合線逐層縫合,并在手術(shù)處涂抹羅紅霉素軟膏[11]。

1.2.7 模型小鼠分組與手術(shù)

造模后將所有小鼠根據(jù)造模方法分為4組,分別為乳墊注射組(mammary fat pad,mfp)、皮下注射組(subcutaneous,sc)、尾靜脈注射組(intravenous,iv)和骨髓注射組(intraosseous,io)。骨髓注射組小鼠隨機(jī)均分為4小組,3個(gè)小組分別在造模后第3、7、10天進(jìn)行手術(shù)截肢,切除原發(fā)病灶。1個(gè)小組不進(jìn)行手術(shù)即假手術(shù),保留原發(fā)病灶。

1.2.8 活體成像監(jiān)測(cè)小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移

經(jīng)骨髓注射模型小鼠造模后第7天采用小動(dòng)物活體成像儀進(jìn)行活體成像,以觀測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移,每周1次,共4次。向小鼠腹腔注射Luciferase底物,濃度為15 g/L,劑量為每只150μL,注射底物5 min后予以異氟烷吸入麻醉,放入成像機(jī)箱以觀察小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移。造模第28天,小鼠腹腔注射底物5 min后給予小鼠安樂(lè)死,取出肺,立即放入成像機(jī)箱以觀察肺部轉(zhuǎn)移情況。

1.2.9 病理切片染色

骨髓注射轉(zhuǎn)移模型建立后第28天,給予小鼠安樂(lè)死,取小鼠原發(fā)腫瘤和肺部組織用多聚甲醛固定液固定進(jìn)行HE染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有統(tǒng)計(jì)均在Graphpad Prism 5.0中完成,所有數(shù)據(jù)均使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨髓注射法成功建立肺轉(zhuǎn)移模型

小鼠經(jīng)骨髓注射4T1細(xì)胞(圖1A),小鼠在接種后第5天出現(xiàn)原發(fā)腫瘤,可以觀察到小鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡、毛發(fā)黯淡和體溫偏低等腫瘤惡病質(zhì)表現(xiàn)。造模第28天給予小鼠安樂(lè)死,取小鼠原發(fā)腫瘤和肺部組織拍照觀察發(fā)現(xiàn)小鼠脛骨相應(yīng)位置和肺部均有明顯白色結(jié)節(jié),且質(zhì)地堅(jiān)硬(圖1B、1C)。剝離小鼠原發(fā)腫瘤,取出肺,HE染色后,鏡下觀察可見(jiàn)原發(fā)灶和肺部有毛線團(tuán)樣致密的腫瘤組織病灶,如圖箭頭所指(圖1D、1E)。以上結(jié)果從解剖學(xué)和組織學(xué)角度均證實(shí)肉眼所見(jiàn)的小鼠肺部結(jié)節(jié)正是肺部轉(zhuǎn)移腫瘤,表明經(jīng)骨髓注射成功構(gòu)建肺轉(zhuǎn)移模型。

2.2 骨髓注射法與其他腫瘤接種方法相比,對(duì)原發(fā)腫瘤沒(méi)有影響,但生存期顯著縮短

由于尾靜脈注射不存在原發(fā)病灶,因而使用乳墊注射法(mfp)、皮下注射法(sc)、骨髓注射法(io)向小鼠體內(nèi)注射5×105個(gè)4T1細(xì)胞構(gòu)建肺轉(zhuǎn)移模型。造模第28天給予小鼠安樂(lè)死,剝離小鼠原發(fā)腫瘤,以觀察腫瘤大小(圖2A)。結(jié)果顯示,骨髓注射法與其他注射法相比,對(duì)原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)沒(méi)有影響(圖2B)。但io模型組的小鼠在接種相同細(xì)胞數(shù)量的情況下,生存期更短(n=5,圖2C)(P<0.05);除此之外,io組小鼠較其他模型組小鼠較早出現(xiàn)精神萎靡和體溫偏低等腫瘤惡病質(zhì)表現(xiàn),且較其他模型組小鼠癥狀更為嚴(yán)重。提示可能是骨髓注射法對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移產(chǎn)生了促進(jìn)作用,加重了模型小鼠惡病質(zhì)表現(xiàn),縮短了模型小鼠的生存期。

圖1 小鼠經(jīng)骨髓注射肺轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建Figure 1 Construction of lung metastasis model of mice injected with bone marrow

2.3 骨髓注射法相較于其他接種方式肺轉(zhuǎn)移效率最高

分別使用乳墊注射(mfp)、皮下注射(sc)、尾靜脈注射(iv)和骨髓注射(io)向小鼠體內(nèi)注射5×105個(gè)4T1細(xì)胞以構(gòu)建小鼠肺轉(zhuǎn)移模型,并于腫瘤細(xì)胞接種后的第28天,給予4個(gè)模型組小鼠安樂(lè)死處理,分別取其肺部組織拍照觀察(圖3A),并統(tǒng)計(jì)小鼠肺部腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量。結(jié)果顯示,與mfp組、sc組和iv組相比,io組肺部腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量最多(n=6,圖3B)。以上結(jié)果說(shuō)明骨髓注射法相較于其他模型組肺轉(zhuǎn)移效率最高。

2.4 骨髓注射法僅需1×105個(gè)細(xì)胞數(shù)量即可在第12天發(fā)生肺轉(zhuǎn)移

使用骨髓注射法向小鼠體內(nèi)注射5×105、3×105和1×105個(gè)4T1細(xì)胞,并于腫瘤細(xì)胞接種后第28天,給與小鼠安樂(lè)死處理,分別取其肺部組織進(jìn)行HE染色。在注射1×105個(gè)細(xì)胞數(shù)量的情況下,經(jīng)骨髓注射的模型小鼠同樣發(fā)生肺轉(zhuǎn)移,且在第12天小鼠肺部即出現(xiàn)少量散在的轉(zhuǎn)移腫瘤。而乳墊注射和皮下注射的模型小鼠,使用3×105和1×105細(xì)胞數(shù)量時(shí),直至第28天都未出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。尾靜脈注射的模型小鼠,使用1×105細(xì)胞數(shù)量時(shí),直至第20天,肺部才出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。以上結(jié)果說(shuō)明經(jīng)骨髓注射的荷瘤小鼠發(fā)生肺轉(zhuǎn)移所需的細(xì)胞數(shù)量最少,且發(fā)生肺轉(zhuǎn)移時(shí)間最早。(圖4)

圖2 不同注射方法對(duì)原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)和小鼠生存期的影響Note.Compared with io group,?P<0.05.Figure 2 Effects of different injection methods on primary tumor growth and mouse survival

圖3 不同注射方法的肺部轉(zhuǎn)移情況Note.Compared with mfp group,?P<0.05,???P<0.001.Compared with sc group,▲P<0.05,▲▲▲P<0.001.Compared with iv group,#P<0.05Figure 3 Lung metastasis by different injection methods

圖4 經(jīng)骨髓注射不同細(xì)胞數(shù)量肺部轉(zhuǎn)移情況Figure 4 Lung metastasis after injection of different cell numbers through bone marrow

2.5 使用骨髓注射法成功建立術(shù)后復(fù)發(fā)模型

經(jīng)骨髓接種1×105個(gè)4T1-luc細(xì)胞,將小鼠隨機(jī)分為假截肢組、第3天截肢組、第7天截肢組和第10天截肢組。造模后第7天使用活體成像技術(shù)監(jiān)測(cè)小鼠轉(zhuǎn)移性腫瘤的發(fā)展,每周1次,共4次(圖5A)。結(jié)果顯示,第3天截肢組在原發(fā)腫瘤切除后,原發(fā)灶和肺部均沒(méi)有熒光信號(hào);假截肢組和第7天截肢組在造模后第21天肺部均出現(xiàn)熒光信號(hào),原發(fā)灶未出現(xiàn)熒光信號(hào);第10天截肢組在造模后第14天原發(fā)灶和肺部均有熒光信號(hào)(圖5B);在第18天,第10天截肢組小鼠出現(xiàn)死亡。假截肢組和第7天截肢組模型小鼠,造模后第28天給予安樂(lè)死,取出肺進(jìn)行成像。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,兩組肺部均有熒光信號(hào),證實(shí)小鼠發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移(圖5C)。以上結(jié)果說(shuō)明切除模型小鼠原發(fā)腫瘤仍會(huì)出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā),經(jīng)骨髓注射術(shù)后復(fù)發(fā)模型構(gòu)建成功。

3 討論

圖5 切除原發(fā)腫瘤后轉(zhuǎn)移性腫瘤的發(fā)展Figure 5 Development of metastatic tumors after primary lesion resection

建立理想的轉(zhuǎn)移模型是研究惡性腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制和藥物篩選的基礎(chǔ),目前常用的動(dòng)物模型包括乳墊注射、皮下注射、尾靜脈注射等,乳墊注射法和皮下注射法實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng),腫瘤轉(zhuǎn)移速率慢,模型小鼠通常因原發(fā)腫瘤負(fù)荷過(guò)大而出現(xiàn)死亡,因而研究者對(duì)高轉(zhuǎn)移效率和較短實(shí)驗(yàn)周期的要求使得尾靜脈注射在眾多轉(zhuǎn)移模型中脫穎而出。但有學(xué)者提出,尾靜脈注射誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移性腫瘤的發(fā)生與臨床中腫瘤患者體內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移不盡相同。腫瘤的轉(zhuǎn)移包括定植、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、沉默、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移等多步驟,而尾靜脈注射使大量腫瘤細(xì)胞直接釋放在血液中,缺少了原發(fā)腫瘤的定植、腫瘤細(xì)胞入侵血管和毛細(xì)血管新生等多個(gè)步驟,而骨髓注射法恰好彌補(bǔ)了尾靜脈注射法所缺失的步驟[7]。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建骨髓注射法肺轉(zhuǎn)移模型對(duì)小鼠傷害小,通過(guò)對(duì)原發(fā)腫瘤和胸腔觀察及HE染色證明骨髓注射法肺轉(zhuǎn)移模型構(gòu)建成功。

模型實(shí)驗(yàn)周期和肺轉(zhuǎn)移效率是評(píng)價(jià)小鼠轉(zhuǎn)移模型的重要指標(biāo)。在細(xì)胞數(shù)量相同的情況下,經(jīng)骨髓注射的荷瘤小鼠的原發(fā)腫瘤較其他注射法相比沒(méi)有顯著變化,但其生存期短,其轉(zhuǎn)移效率顯著高于其他模型組;同時(shí)與其他模型組相比,骨髓注射法發(fā)生肺轉(zhuǎn)移所需的細(xì)胞數(shù)量最少,同時(shí)發(fā)生肺轉(zhuǎn)移時(shí)間最早。局部手術(shù)治療是惡性腫瘤患者常用的治療手段,但腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是特定惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率的主要原因[16]。經(jīng)骨髓注射的荷瘤小鼠,在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行原發(fā)腫瘤切除,以此來(lái)模擬臨床腫瘤患者局部手術(shù)治療。第3天截肢組的小鼠未出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,這表明較早截肢的小鼠,腫瘤細(xì)胞沒(méi)有定植,無(wú)法形成原發(fā)病灶,即沒(méi)有種子,就沒(méi)有辦法形成循環(huán)腫瘤細(xì)胞,進(jìn)而無(wú)法形成轉(zhuǎn)移灶,說(shuō)明腫瘤轉(zhuǎn)移時(shí)依賴原發(fā)病灶。第7天和第10天截肢組小鼠均出現(xiàn)了腫瘤轉(zhuǎn)移,這表明隨著時(shí)間推移,當(dāng)腫瘤細(xì)胞定植、原發(fā)病灶增大時(shí),“種子”已經(jīng)形成并且開(kāi)始播散,變成循環(huán)腫瘤細(xì)胞,此時(shí)即使將原發(fā)病灶切除,但轉(zhuǎn)移灶依舊可以出現(xiàn),這也就解釋為什么在臨床上即使手術(shù)切除原發(fā)病灶后,轉(zhuǎn)移灶仍然可以出現(xiàn),并且也是為什么臨床上要提倡腫瘤早發(fā)現(xiàn)早診斷早治療的目的。

乳腺癌是臨床中常見(jiàn)會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移的癌癥,因而在模型中選用了4T1乳腺癌細(xì)胞株。肝癌和結(jié)腸癌在癌癥患者體內(nèi)同樣也易發(fā)生轉(zhuǎn)移,課題組在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了經(jīng)骨髓注射的Hep1-6肝癌細(xì)胞株和CT26結(jié)腸癌細(xì)胞株同樣會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移,說(shuō)明此模型是廣譜的建立肺轉(zhuǎn)移模型的工具,而不是只對(duì)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型敏感。除此之外,本文很好的解釋了“種子與土壤”理論在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的重要作用。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)與傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的不斷結(jié)合,人們對(duì)于腫瘤的態(tài)度由“趕盡殺絕”逐漸轉(zhuǎn)向“帶瘤生存”,如何才能“帶瘤生存”[17-18]?中醫(yī)藥則在其發(fā)揮了重要作用,中醫(yī)藥通過(guò)重塑腫瘤微環(huán)境,使腫瘤生長(zhǎng)的“土壤”不再適宜其生長(zhǎng)與發(fā)展,從而減少腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[19-20]。同時(shí)中醫(yī)藥治療亦具有抑制“種子”活性的功能[21]。因此中醫(yī)藥可以很好的利用該模型進(jìn)行探索性研究,亦對(duì)中醫(yī)藥抗腫瘤發(fā)展具有重大意義。