QF-PCR技術(shù)聯(lián)合染色體核型分析在羊水產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

易翠興，李東至，袁思敏，李發(fā)濤，李偉，廖燦

廣州市婦女兒童醫(yī)療中心產(chǎn)前診斷中心，廣東 廣州 510623

人類最常見的染色體異常是非整倍體異常，占所有懷孕孕婦的5%，其也是導(dǎo)致流產(chǎn)的主要原因。染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)性異常占新生兒的1/200，是導(dǎo)致發(fā)育障礙和先天性疾病的常見原因[1-3]。在大多數(shù)國家，細(xì)胞遺傳學(xué)分析已成為產(chǎn)前診斷的重要組成部分。自細(xì)胞遺傳學(xué)研究開始發(fā)展，傳統(tǒng)的染色體核型分析已被作為產(chǎn)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[4]，其準(zhǔn)確性約為99%，但這種技術(shù)費力且培養(yǎng)時間較長，導(dǎo)致報告時間較長。對于大多數(shù)細(xì)胞遺傳學(xué)實驗室而言，結(jié)果可能需要15～20 d，這對于焦慮的父母來說是一個漫長的等待。

熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(fluorescence quantitative polymerase chain reaction，QF-PCR) 技術(shù)是采用多重PCR 擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳分離技術(shù)，通過定性、定量分析短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR) 遺傳標(biāo)記的多態(tài)性，診斷常見染色體非整倍體[5-8]。本研究應(yīng)用QF-PCR 技術(shù)聯(lián)合傳統(tǒng)染色體核型分析技術(shù)對產(chǎn)前診斷羊水標(biāo)本進(jìn)行詳細(xì)檢測，探討兩種技術(shù)聯(lián)合分析在檢測染色體異常中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年1月至2018年12月在廣州市婦女兒童醫(yī)療中心產(chǎn)前診斷中心進(jìn)行羊水產(chǎn)前診斷的16 314 例孕婦病例資料，孕婦孕周14～35周，平均(19.2±2.5)周；孕婦16～51 歲，平均(32.3±5.7)歲。其中2011—2014 年孕婦平均年齡(31.4±5.7)歲，平均孕周(19.2±3.3)周；2015—2018 年孕婦平均年齡(33.4±5.6)歲，平均孕周(18.6±2.9)周。進(jìn)行羊水穿刺的孕婦均無手術(shù)所列的相關(guān)禁忌證，而且每例患者均在充分的溝通及風(fēng)險告知后，簽署相關(guān)的知情同意書和在本院建立產(chǎn)前診斷病歷并簽字確認(rèn)。

1.2 染色體核型分析 在B 超監(jiān)護(hù)下按照產(chǎn)前診斷手術(shù)規(guī)范嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作，經(jīng)腹壁行羊膜腔穿刺術(shù)，用注射器抽取羊水18～20 mL 分別置于2 支15 mL 無菌離心管中并立即送檢。1 600 r/min 離心10 min，在超凈工作臺內(nèi)棄上清液并各留取2 mL 沉淀，分別接種于兩個盛有5 mL 羊水培養(yǎng)基的25 cm2Nunc培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶分別置入兩個37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，6～8 d后在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶中羊水細(xì)胞生長情況，如果發(fā)現(xiàn)其中有8～10個較密集的克隆貼壁生長后即可換液，換液后繼續(xù)放入二氧化碳培養(yǎng)箱中，1～2 d后觀察直到發(fā)現(xiàn)細(xì)胞島上有較多圓形或雙圓形透亮細(xì)胞覆蓋，加濃度20 μg/mL的秋水仙素后作用2 h 后即可收獲細(xì)胞。經(jīng)過低滲、預(yù)固定、固定、制片、80℃烤片2 h、G 顯帶和全自動核型掃描系統(tǒng)掃片等多個環(huán)節(jié)，每個病例核型計數(shù)≥20個，分析≥5個核型，異常核型加大計數(shù)和分析，核型描述按《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN 2016)》命名。

1.3 QF-PCR檢測

1.3.1 QF-PCR 檢測位點 應(yīng)用QF-PCR 方法檢測21、18、13 及性染色體上的STR 共24 個位點，其中21號染色體7個STR位點，18號染色體5個STR位點，13號染色體5個STR位點，性染色體7個STR位點。

1.3.2 QF-PCR 檢 測 步 驟 (1) DNA 提 取：DNA 提取按照QIAGEN 公司試劑盒說明步驟進(jìn)行。(2)PCR 擴(kuò)增：擴(kuò)增體系分為三組，PCR擴(kuò)增體積25 μL，1 X buffer，2 mmol/L MgCl2，引物10～40 pmol，Taq DNA聚合酶0.6 U，95℃5 min；隨后變性95℃30 s，退火60℃40 s，延伸72℃50 s，共26個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。(3)毛細(xì)管電泳：取1 μL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物與10 μL 上樣液(包括9.5 μL 甲酰胺及0.5 μL 分子內(nèi)標(biāo))混合，95℃變性2 min，用ABI3100 遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳。(4)結(jié)果分析及判斷：用Gene Mapper 3.7 軟件進(jìn)行結(jié)果分析。雙峰面積比率0.8～1.4 為正常二倍體；當(dāng)雙峰面積比率＜0.65或>1.8時，提示三體。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料比較采用R×C χ2檢驗，配對χ2檢驗，Kappa一致性檢驗，kappa值分為五組表示不同級別的一致性：0.0～0.20 極低的一致性、0.21～0.40 一般的一致性、0.41～0.60 中等的一致性、0.61～0.80 高度的一致性和0.81～1 幾乎完全一致，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同年度各年齡組孕婦羊水產(chǎn)前診斷核型結(jié)果比較 2011—2014 年35 歲以上孕婦進(jìn)行羊水產(chǎn)前診斷異常率為5.41%，2015—2018年35歲以上孕婦進(jìn)行羊水產(chǎn)前診斷異常率11.89%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=74.688，P=0.001)。2011—2014 年不同年齡組孕婦羊水染色體核型異常率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.396，P=0.355)；2015—2018 年不同年齡組孕婦間羊水染色體核型異常率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=33.492，P=0.001)。各個年齡組在兩個年度間的異常率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 不同年度各年齡組孕婦羊水產(chǎn)前診斷核型結(jié)果比較

2.2 不同年度不同孕周孕婦羊水產(chǎn)前診斷核型結(jié)果比較 羊水產(chǎn)前診斷主要集中在孕16～23 周，其中2011—2014 年產(chǎn)前診斷8 225 例，異常412 例，異常率為5.01%；2015—2018年產(chǎn)前診斷6 732例，異常681例，異常率為10.12%，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=142.529，P=0.001)。2011—2014年不同孕周孕婦之間羊水染色體核型異常率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.562，P=0.967)；2015—2018 年不同孕周孕婦之間羊水染色體核型異常率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=18.432，P=0.001)。除孕周≥28 周組以外，其余各組在兩個年度間的異常率比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 不同年度不同孕周孕婦羊水產(chǎn)前診斷核型結(jié)果比較

2.3 兩種方法篩查13、18、21、性染色體異常比較 2011—2014 年QF-PCR 篩查出21 三體133 例，18三體40例，13三體4例，性染色體異常28例，而核型結(jié)果在21、18、13的診斷與之完全吻合，且性染色體異常多發(fā)現(xiàn)1 例嵌合體，符合率為99.91%；2015—2018 年篩查出21 三體374 例，18 三體92 例，13 三體19 例，性染色體異常99 例，而核型結(jié)果在21、18、13 的診斷與之完全吻合，且性染色體異常多發(fā)現(xiàn)4例嵌合體，符合率為99.32%。

2.4 QF-PCR與核型結(jié)果一致性分析 2011—2014年核型結(jié)果判斷異常456例，QF-PCR檢測篩查陽性205例；2015—2018年核型結(jié)果判斷異常752 例，QF-PCR檢測篩查陽性584 例。經(jīng)配對χ2檢驗，2011—2014 年兩種方法比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3 972.869，P=0.000)，Kappa 一致性檢驗(Kappa=0.608，P=0.000)，一致性中等；2015—2018年兩種方法比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=546 5.071，P＜0.05)，Kappa 一致性檢驗(Kappa=0.862，P=0.000)，一致性好。

3 討論

染色體異常引起的遺傳性疾病會導(dǎo)致超過50%的自然流產(chǎn)、死產(chǎn)和過早死亡。染色體異常包括數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常，其中染色體非整倍性異常被證明是人類最常見的染色體畸變之一，嚴(yán)重威脅著人類健康。最常見的染色體數(shù)目異常包括唐氏綜合征(21三體)、愛德華氏綜合征(18三體)、Patau綜合征(13三體)、特納綜合征(45，X)、克氏綜合征(47，XXY)和三倍體等，它們占染色體異常的80%以上[9-11]。染色體異常引起的遺傳病給社會和家庭造成沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，目前尚無法有效治愈，唯一可行的方法是通過產(chǎn)前篩查或產(chǎn)前診斷來減少和避免此類患兒的出生。因此，對染色體疾病進(jìn)行產(chǎn)前診斷及其診斷方法尤為重要。

本研究顯示，羊水產(chǎn)前診斷主要集中在16～23 孕周，這與羊水取材的最佳時間相吻合，其中2011—2014年產(chǎn)前診斷8 225 例，異常數(shù)412 例，2015—2018 年產(chǎn)前診斷6 732 例，異常數(shù)681 例，異常率由原來的5.01%上升為10.12%，35 歲以上進(jìn)行羊水產(chǎn)前診斷核型異常率2011—2014年為5.41%，而2015—2018年增長為11.89%，同時各年齡組不同年度間異常率比較2015—2018 年顯著高于2011—2014 年。出現(xiàn)以上檢出差異說明隨著產(chǎn)前診斷技術(shù)管理規(guī)范越來越細(xì)化，產(chǎn)前診斷質(zhì)量控制要求越來越高，醫(yī)生對產(chǎn)前診斷指征把握地越來越準(zhǔn)確，以及近年來無創(chuàng)產(chǎn)前篩查技術(shù)的應(yīng)用，雖然產(chǎn)前診斷的孕婦人數(shù)在減少，但陽性檢出率提高了，致使異常率增加，故2015—2018 年異常率顯著高于2011—2014 年，因此，隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，染色體異常檢出率提高，有效的防止了出生缺陷的發(fā)生。

染色體核型分析技術(shù)作為產(chǎn)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，能夠檢出23對染色體數(shù)目異常和主要結(jié)構(gòu)異常，但因其檢測時間長，一般報告周期為21 d 左右，且存在細(xì)胞培養(yǎng)失敗的風(fēng)險，亟需新的技術(shù)能夠彌補(bǔ)其不足。近年來，QF-PCR 用于檢測常見染色體非整倍體異常已被眾多產(chǎn)前診斷中心廣泛應(yīng)用。本研究基于羊水樣本QF-PCR 技術(shù)快速分析檢測13、18、21，X 和Y 五條染色體的數(shù)目異常，結(jié)果顯示QF-PCR 和傳統(tǒng)核型對比，兩個時間段對于常見的五條染色體非整倍體異常的符合率均在99%以上。QF-PCR與傳統(tǒng)G 顯帶核型分析相比更高效，其操作簡便，不需要細(xì)胞培養(yǎng)，一般報告周期為2～3 d，快的可以達(dá)到24 h 左右出結(jié)果，可以極大地縮短常見染色體非整倍體報告所需要的時間，可緩解孕婦及家屬的焦慮情緒。而傳統(tǒng)的核型分析技術(shù)發(fā)報告時間在15～21 d，且存在細(xì)胞培養(yǎng)失敗的風(fēng)險。

本研究同時發(fā)現(xiàn)，2011—2014年核型結(jié)果判斷異常456 例，QF-PCR 檢測判斷陽性結(jié)果205 例；2015—2018 年核型結(jié)果判斷異常752 例，QF-PCR 檢測判斷陽性結(jié)果584例。兩種方法采用kappa一致性分析，結(jié)果顯示它們之間具有較高一致性。但同時也說明QF-PCR技術(shù)也有一定的局限性，它無法檢測出結(jié)構(gòu)異常和其他染色體非整倍體異常，正好傳統(tǒng)的核型分析能夠彌補(bǔ)其不足，從而保證產(chǎn)前診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。

總之，每種方法單一應(yīng)用均存在各自的不足，所以目前QF-PCR 技術(shù)聯(lián)合傳統(tǒng)染色體核型分析進(jìn)行羊水產(chǎn)前診斷，不僅可以為孕婦提供快速準(zhǔn)確的常見的五條染色體非整倍體檢測結(jié)果，減輕孕婦在等待核型確診結(jié)果時漫長的焦慮和緊張，同時傳統(tǒng)染色體核型分析技術(shù)作為細(xì)胞遺傳學(xué)的金標(biāo)準(zhǔn)，仍然發(fā)揮著它的巨大作用，為臨床提供結(jié)構(gòu)異常和其他非整倍體異常的檢測結(jié)果，而且該技術(shù)可以診斷低比例嵌合體。兩種方法的聯(lián)合應(yīng)用實現(xiàn)了優(yōu)勢互補(bǔ)，有效的避免了出生缺陷的發(fā)生，在產(chǎn)前診斷的診治方面發(fā)揮著重要的價值。