大皰性類天皰瘡患者皮損和血清中MMP-2的表達(dá)

張海祥，秦蘭英，石曉旭，趙子申，葉文靜，劉婕，李丙南，曹娜，張群

（滄州市人民醫(yī)院，河北滄州061000）

目前據(jù)國(guó)外研究表明基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMP）在許多大皰類皮膚病的皮損中均有陽性表達(dá)或發(fā)揮著重要作用。如：在家族性良性慢性天皰瘡中角質(zhì)形成或分離細(xì)胞周圍的細(xì)胞中MMP-9被陽性染色；MMP-12在尋常型天皰瘡皮損和大皰性類天皰瘡皮損中均檢測(cè)到；MMP-9可能參與尋常型天皰瘡的棘層松解[1-4]。大皰性類天皰瘡（Bullous pemphigoid，BP）是一種獲得性自身免疫性大皰類皮膚病[5]。目前認(rèn)為抗BP180的抗體是主要的致病抗體，抗BP180抗體通過補(bǔ)體激活、中性粒細(xì)胞募集和蛋白酶的釋放，破壞半橋粒和細(xì)胞外基質(zhì)成分，在基底層的透明板內(nèi)發(fā)生真表皮的分離，引起表皮下水皰。MMP-2又稱白明膠酶A，能降解明膠和Ⅳ型膠原纖維，二者是基底膜的主要組成成份[6-7]；也能降解其他基質(zhì)蛋白：Ⅴ、Ⅶ和Ⅹ型膠原、核心蛋白聚糖、彈力蛋白和纖維連接蛋白等[5，8-10]。真皮和表皮的分離必然伴隨著細(xì)胞基質(zhì)的降解，提示MMP-2可能在BP的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。因此，筆者檢測(cè)了MMP-2在BP皮損和血清中的表達(dá)，從而進(jìn)一步探討MMP-2在BP發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例與標(biāo)本 24例BP患者的皮損和血清，女 10例，男14例。年齡 44～87歲，平均（67.4±15.0）歲；均來自滄州市人民醫(yī)院皮膚科，經(jīng)臨床、組織病理、直接免疫熒光、間接免疫熒光確診為BP，且均未接受過治療。正常對(duì)照組15例，女7例，男8例，年齡28～81歲，平均（59.9±13.6）歲，均為滄州市人民醫(yī)院整形外科非免疫皮膚病患者，均為健康志愿者。

1.1.2 試劑 鼠抗人MMP-2單克隆抗體（美國(guó)R&D）；山羊抗鼠IgG的SP試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；人MMP-2酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法試劑盒（R&D）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化學(xué)染色 所有皮膚標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛常規(guī)固定、石蠟包埋，制成4 μm厚連續(xù)切片；將切片置于60℃烤箱烘烤；脫蠟水化；磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，0.1%的檸檬酸鈉溶液中高壓熱修復(fù)；PBS沖洗，滴加3%的過氧化氫去離子水；PBS沖洗，滴加一抗（鼠抗人MMP-2單克隆抗體）過夜；PBS浸洗，滴加生物素標(biāo)記的IgG工作液；PBS浸洗，滴加辣根過氧化酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液；PBS浸洗，滴加DAB辣根過氧化物酶顯色試劑顯色，復(fù)染；封片后鏡下觀察并掃描，圖像分析，拍照。嚴(yán)格按Sp試劑盒操作說明操作。真表皮交界處細(xì)胞被染成棕黃色為陽性，正常皮膚無著色或著色不明顯。染色結(jié)果分析：高倍鏡（40×10）下用網(wǎng)形目鏡測(cè)微尺單盲法計(jì)數(shù)5個(gè)視野的陽性細(xì)胞的均數(shù)。所有操作均有同1名實(shí)驗(yàn)者判斷。

1.2.2 ELISA 加100 μL試驗(yàn)稀釋劑 RD1-34到每個(gè)孔里；向各孔加100 μL標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照或樣本，放在搖板上孵育2 h；沖洗4次，向各孔加200 μL二抗，放在搖板上孵育1 h；沖洗4次，向各孔加200 μL 染色液，放置 30 min，避光；向各孔加 50 μL終止液；450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，取得MMP-2的血清濃度。嚴(yán)格按ELISA試劑盒操作說明操作。通過酶標(biāo)儀讀取結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。先行方差齊性檢驗(yàn)，然后正常組和對(duì)照組之間應(yīng)用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩變量之間的相互關(guān)系用Pearson相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色 MMP-2在BP患者皮損中主要表達(dá)于皮膚的表皮層，真皮層的炎性細(xì)胞也有少量表達(dá)，在皰液中也有明顯表達(dá)，呈棕黃色顆粒狀；在對(duì)照組的皮膚組織中MMP-2也有較弱表達(dá)，見圖1。在高倍鏡（40×10）的視野內(nèi)，BP患者皮損中MMP-2的表達(dá)較對(duì)照組顯著增加，BP皮損與正常人皮膚MMP-2的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.95，P＜0.01），見表 1。

表1 MMP-2在BP患者皮損與正常對(duì)照組皮膚中的表達(dá)[每高倍鏡（40×10）視野的陽性細(xì)胞數(shù)]

2.2 ELISA 24例BP患者血清和24例對(duì)照組血清經(jīng)ELISA實(shí)驗(yàn)，通過酶標(biāo)儀讀取結(jié)果，結(jié)果顯示血清MMP-2的平均水平在BP患者組為（38.54±23.00）ng/mL，在正常對(duì)照組為（17.51±5.45）ng/mL。BP組顯著高于正常對(duì)照組，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.36，P＜0.01），見表 2。

表2 MMP-2在BP患者組與正常對(duì)照組血清中的分泌水平 （ng/mL，±s）

表2 MMP-2在BP患者組與正常對(duì)照組血清中的分泌水平 （ng/mL，±s）

組別 n images/BZ_8_459_1343_481_1387.png±s P BP 組 24 38.54±23.00 0.05對(duì)照組 15 17.51±5.45

2.3 比較同1例BP患者皮損中表達(dá)MMP-2的細(xì)胞數(shù)目和血清中MMP-2的分泌水平，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為Pearson相關(guān)，結(jié)果顯示二者之間無明顯的相關(guān)性（γ=0.005，P=0.982）。

圖1 免疫組化染色結(jié)果：MMP-2的表達(dá)情況（DAB 染色×400）

3 討論

目前據(jù)國(guó)外研究表明BP的發(fā)病機(jī)制與基底膜組份的破壞有關(guān)。自身抗體結(jié)合表皮基底膜的抗原，激活補(bǔ)體和水解酶等，導(dǎo)致水皰的形成。一些研究已經(jīng)表明MMP參與了BP的皮損的發(fā)生，然而在具體過程中的作用尚不清楚[5]。MMP-2和MMP-9被檢測(cè)到在表皮、基底層角質(zhì)形成細(xì)胞和水皰部位均有表達(dá)[11]。有報(bào)道表明表皮與真皮分離發(fā)生在基底層，伴隨著大量的炎性滲出物和半橋粒及細(xì)胞外基質(zhì)成分的降解，炎性細(xì)胞的蛋白水解酶參與了BP水皰的形成，較高水平的蛋白水解酶，包括MMP-2、MMP-9等已經(jīng)被檢測(cè)到在BP的皰液中和皮損中表達(dá)[12]。

MMP是一族鋅依賴性內(nèi)肽酶，可降解細(xì)胞外基質(zhì)中各種蛋白成分，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）能特異性抑制其活性。二者是細(xì)胞外基質(zhì)合成及代謝平衡中2個(gè)重要的酶系，參與多種與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白水解重塑有關(guān)的生理過程，如組織發(fā)生、組織修復(fù)、血管形成等。多種細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)成分、致癌物、原癌基因產(chǎn)物如表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、腫瘤壞死因子（TNF）-α、血小板衍生生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素（IL）-1、c-fos和c-jun的表達(dá)產(chǎn)物能促進(jìn)多種MMP mRNA的轉(zhuǎn)錄[13]。

MMP-2是MMPs家族中的重要成員，也是發(fā)現(xiàn)較早的因子，又稱明膠酶或Ⅳ型膠原酶，是臨床最重要的明膠酶之一。MMP-2基因位于人類染色體6q21，由13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子組成，其結(jié)構(gòu)基因總長(zhǎng)度為27 KB，相對(duì)分子質(zhì)量為72 kD。MMP-2可由體內(nèi)多種細(xì)胞合成和分泌，包括成角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞及軟骨細(xì)胞等。但MMP-2無活性，以ProMMP-2的形式分泌，經(jīng)過水解后才被激活。MMP-14與TIMP-2協(xié)同作用催化MMP-2成為活性形式[14]。

本研究結(jié)果顯示BP患者皮損和血清中MMP-2的表達(dá)均明顯增加，提示MMP-2可能在BP的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。但MMP-2的變化是否有診斷和治療上的指導(dǎo)意義暫時(shí)還不確定。BP患者皮損和血清中MMP-2高表達(dá)的機(jī)制可能與BP180在基底膜帶介導(dǎo)抗原抗體反應(yīng)有關(guān)。在補(bǔ)體和炎性反應(yīng)的刺激下，導(dǎo)致MMP mRNA的轉(zhuǎn)錄增加，進(jìn)一步促進(jìn)ProMMP-2合成，合成增多的ProMMP-2繼而被水解激活，導(dǎo)致MMP-2的高表達(dá)，而高表達(dá)的MMP-2可以降解明膠和Ⅳ型膠原纖維等基質(zhì)蛋白，從而可能使表皮和真皮在基底帶發(fā)生分離，導(dǎo)致表皮下水皰的形成。此外根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在同1例患者的血清和皮損中MMP-2的表達(dá)無明顯的相關(guān)性，考慮可能與疾病的發(fā)展階段，病情的輕重及皮損取材部位有一定關(guān)系。