基于PI3KAkt-Bcl-2通路探討TSG-6對(duì)人瘢痕疙瘩凋亡機(jī)制的影響

胡銀娥 ，代淑芳，魏沙沙 ，許丹丹 ，郭麗麗

（1.河南大學(xué)淮河醫(yī)院，河南開(kāi)封 475000；2.鄭州大學(xué)，河南鄭州450001）

近年來(lái)，關(guān)于瘢痕疙瘩形成機(jī)制的研究不斷深 入，大量臨床研究認(rèn)為基因、細(xì)胞信號(hào)通路在瘢痕疙瘩形成中發(fā)揮著重要作用，腫瘤壞死因子-α刺激基因-6（TSG-6）是腫瘤壞死因子基因的一種，有透明質(zhì)酸結(jié)合的鏈域a，在正常皮膚成纖維細(xì)胞中不表達(dá)，但受到炎性反應(yīng)刺激時(shí)，會(huì)大量表達(dá)于成纖維細(xì)胞中[1-2]。PI3K/Akt是細(xì)胞凋亡的主要通路，可通過(guò)多方面機(jī)制對(duì)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑制作用，并可對(duì)Bcl-2蛋白家族產(chǎn)生調(diào)控作用，進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡[3]。此次研究以本院2017年8月—2018年8月行手術(shù)治療的56例瘢痕疙瘩患者手術(shù)標(biāo)本為材料，基于PI3KAkt-Bcl-2通路，探討TSG-6對(duì)人瘢痕疙瘩凋亡機(jī)制中TSG-6的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究材料 此次材料來(lái)源于2017年8月—2018年8月在本院接受手術(shù)治療的56例瘢痕疙瘩患者手術(shù)切除標(biāo)本，患者男27例（48.21%），女29例（51.79%）；年齡 23～57 歲，平均（39.52±4.53）歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①通過(guò)手術(shù)對(duì)瘢痕疙瘩進(jìn)行切除，且保留手術(shù)標(biāo)準(zhǔn)者；②術(shù)前未接受其他藥物、方法治療者；③患者本人已知曉研究，并配合對(duì)知情同意書進(jìn)行簽署。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他嚴(yán)重免疫、血液系統(tǒng)等疾病者；②合并炎性反應(yīng)疾病者；③手術(shù)標(biāo)本未保留、不愿意參與研究者。

1.1.2 試劑與儀器 高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)自HyClone，Ⅳ型膠原酶購(gòu)自Sigma，無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自QINGEN，CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒，兔抗人PI3K、Akt、P53、Bcl-2 抗體均購(gòu)自 Abcam，顯影液、定影液購(gòu)自天津市漢中攝影材料廠。流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter，H.H.S恒溫水浴箱購(gòu)自上海醫(yī)療器械廠，微量移液器購(gòu)自德國(guó) Eppendorf，TGL3021HR高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)購(gòu)自安徽嘉文儀器裝備有限公司，Elx800型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek公司，EPS300電泳儀、VE-180電泳槽、VE-186轉(zhuǎn)膜儀均購(gòu)自上海Tanon公司，Alliance Mini 4M凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自英國(guó)UVI-tec公司。

1.2 方法

1.2.1 瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 以手術(shù)刀、小組織剪刀將標(biāo)本上多余皮膚、脂肪組織、內(nèi)在血管等去除，隨后切成1 mm3的小塊，置入已經(jīng)加入了標(biāo)本5倍體積的高糖DMEM溶劑、1 mg/mLⅣ型膠原酶溶液的離心管，恒溫震蕩，參數(shù)為37℃、170轉(zhuǎn)/min、10 h，去除未被溶解的組織標(biāo)本。將上述離心管置入離心機(jī)，行5 min 1 200轉(zhuǎn)/min離心處理，棄上清，漂洗。加入含有20%胎牛血清5 mL的高糖DMEM培養(yǎng)基，接種至細(xì)胞培養(yǎng)皿，置入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，次日對(duì)對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行更換，去除細(xì)胞培養(yǎng)皿中的小塊組織。以后每日對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察，依據(jù)需要換液，一般7 d后可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)良好。此時(shí)以胰酶消化法展開(kāi)傳代處理，第2天對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行更換，3～4 d以細(xì)胞生長(zhǎng)情況為依據(jù)，傳代，本實(shí)驗(yàn)取第3～4代細(xì)胞。

1.2.2 pLVX-pour-TSG-6載體構(gòu)建 以Trizol試劑快速提取法對(duì)細(xì)胞總RNA進(jìn)行提取，獲得的總RNA展開(kāi)逆轉(zhuǎn)錄處理，獲得總cDNA，以聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法實(shí)施擴(kuò)增處理，通過(guò)凝膠回收試劑盒說(shuō)明書對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行回收，孵育后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，獲得表達(dá)載體pLVX-pour-TSG-6。常規(guī)構(gòu)建siRNA1序列，獲取雙鏈DNA片段，以慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLVX-shRNA1實(shí)施雙酶切，回收純化酶切后的質(zhì)粒，孵育后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，獲得干擾載體pLVX-pour-TSG-6。

1.2.3 瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞篩選 常溫放置胰酶0.5 h后，對(duì)瘢痕疙瘩成纖維進(jìn)行收集，計(jì)數(shù)細(xì)胞，6孔、2×104/mL于37℃環(huán)境中進(jìn)行24 h培養(yǎng)。隨后于各孔中將病毒液、8 g/L凝聚胺選擇基加入，再展開(kāi)5 d培養(yǎng)，感染處理細(xì)胞。①待用細(xì)胞行2 d培養(yǎng)，以最終濃度為2.5 ng/mL的凝聚胺選擇培養(yǎng)基展開(kāi)7 d培養(yǎng)，并繼續(xù)通過(guò)含有過(guò)TSG-6度表達(dá)血清的DMEM培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)，獲取過(guò)度表達(dá)組細(xì)胞。②待用細(xì)胞行2 d培養(yǎng)，以最終濃度為2.5 ng/mL的凝聚胺選擇培養(yǎng)基展開(kāi)7 d培養(yǎng)，并繼續(xù)通過(guò)含有TSG-6過(guò)度表達(dá)對(duì)照血清的DMEM培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)，獲取過(guò)度表達(dá)對(duì)照組細(xì)胞。③待用細(xì)胞行2 d培養(yǎng)，以最終濃度為2.5 ng/mL的凝聚胺選擇培養(yǎng)基展開(kāi)7 d培養(yǎng)，并繼續(xù)通過(guò)含有TSG-6干擾表達(dá)血清的DMEM培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)，獲取干擾組細(xì)胞。④待用細(xì)胞行2 d培養(yǎng)，以最終濃度為2.5 ng/mL的凝聚胺選擇培養(yǎng)基展開(kāi)7 d培養(yǎng)，并繼續(xù)通過(guò)含有TSG-6干擾對(duì)照表達(dá)血清的DMEM培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)，獲取干擾對(duì)照組細(xì)胞。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)定 ①流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)4組細(xì)胞凋亡情況。檢測(cè)操作完全依照儀器、試劑說(shuō)明書進(jìn)行，15～30 min完成檢測(cè)。②CC-K法測(cè)定4組細(xì)胞增殖能力。③反轉(zhuǎn)錄·聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)4組細(xì)胞PI3K、Akt、Bcl-2基因mRNA表達(dá)情況，對(duì)基因引物序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，按檢測(cè)儀器、設(shè)計(jì)說(shuō)明書展開(kāi)檢測(cè)，獲取cycle threshold（CT）值，以GraphPad Prism軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。④Western Blot檢測(cè)PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表達(dá)情況。常規(guī)展開(kāi)蛋白定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、顯影等處理，操作完全按照試劑與儀器說(shuō)明書進(jìn)行，通過(guò)Alliance mini 4M凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察。

1.3 觀察指標(biāo) ①4組細(xì)胞及瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡情況。完成檢測(cè)后，計(jì)算4組細(xì)胞凋亡率：細(xì)胞凋亡率=（凋亡細(xì)胞數(shù)量÷正常細(xì)胞數(shù)據(jù)）×100。②細(xì)胞增殖情況。分別對(duì)各組細(xì)胞 0、24、48、72、96 h時(shí)的增殖情況進(jìn)行觀察。③4組PI3K、Akt、Bcl-2基因mRNA表達(dá)情況。④4組PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究數(shù)據(jù)處理軟件為SPSS20.0，（±s）表示計(jì)量資料，t檢驗(yàn)，例（%）表示計(jì)數(shù)資料，χ2檢驗(yàn)，多個(gè)水平因素則予以F檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞凋亡情況 過(guò)度表達(dá)組細(xì)胞凋亡率顯著較干擾組、過(guò)度表達(dá)對(duì)照組、干擾對(duì)照組及瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），過(guò)度表達(dá)對(duì)照組、干擾對(duì)照組、瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡對(duì)比則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞凋亡情況對(duì)比 例（%）

2.2 細(xì)胞增殖情況 過(guò)度表達(dá)組細(xì)胞增殖速度較瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞慢，干擾組細(xì)胞增殖效應(yīng)顯著較其余組別高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），過(guò)度表達(dá)對(duì)照組、干擾對(duì)照組、瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖對(duì)比則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖1。

2.3 PI3K、Akt、Bcl-2基因mRNA表達(dá)情況 過(guò)度表達(dá)組PI3K、Akt、Bcl-2基因mRNA表達(dá)顯著較干擾組、過(guò)度表達(dá)對(duì)照組、干擾對(duì)照組、瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞低，干擾組較過(guò)度表達(dá)組、過(guò)度表達(dá)對(duì)照組、干擾對(duì)照組、瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），過(guò)度表達(dá)對(duì)照組、干擾對(duì)照組、瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞對(duì)比則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表 2。

圖1 各組細(xì)胞增殖情況比較

表2 4組 PI3K、Akt、Bcl-2基因mRNA表達(dá)情況 （CT 值，±s）

表2 4組 PI3K、Akt、Bcl-2基因mRNA表達(dá)情況 （CT 值，±s）

注：與過(guò)度表達(dá)對(duì)照組比較①P＜0.05，與干擾組比較②P＜0.05，與干擾對(duì)照組比較③P＜0.05，與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞比較④P＜0.05；與過(guò)度表達(dá)組比較aP＜0.05，與過(guò)度表達(dá)對(duì)照組比較bP＜0.05，與干擾對(duì)照組比較cP＜0.05，與比較瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞dP＜0.05。

組別過(guò)度表達(dá)組過(guò)度表達(dá)對(duì)照組干擾組干擾對(duì)照組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞n 30 30 30 30 30 F P PI3K Akt Bcl-2 0.56±0.12①②③④ 0.57±0.11①②③④ 0.46±0.11①②③④0.89±0.14 1.12±0.13 1.23±0.65 2.32±0.76abcd 2.92±0.23abcd 2.97±0.23abcd 1.10±0.35 1.08±0.15 1.32±0.21 0.91±0.12 1.22±0.11 1.25±0.57 17.862 21.0281 25.621 0.000 0.000 0.000

2.4 PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表達(dá)情況 過(guò)度表達(dá)組PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著較干擾組、過(guò)度表達(dá)對(duì)照組、干擾對(duì)照組低、瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，干擾組較過(guò)度表達(dá)組、過(guò)度表達(dá)對(duì)照組、干擾對(duì)照組高、瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），過(guò)度表達(dá)對(duì)照組、干擾對(duì)照組、瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞對(duì)比則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 4組PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表達(dá)情況

3 討論

瘢痕疙瘩即結(jié)締增生組織癥，屬于一種膠原異常沉積導(dǎo)致的纖維增生性疾病，是創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中過(guò)度生長(zhǎng)的一種瘢痕組織，有一定種族差異性、遺傳特性[4]。瘢痕疙瘩出現(xiàn)后，患者皮膚外觀美觀度下降，甚至?xí)霈F(xiàn)功能障礙，會(huì)對(duì)患者身心健康與生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。一般而言，創(chuàng)面愈合后4～8周，可見(jiàn)瘢痕疙瘩，3～6個(gè)月，瘢痕穩(wěn)定，7個(gè)月內(nèi)，瘢痕可變軟，顏色與周圍膚色接近，并逐漸消退。但瘢痕疙瘩屬于病理性瘢痕的一種，一般不會(huì)自主消退，需予以治療?，F(xiàn)階段，臨床上多通過(guò)手術(shù)、激素注射等方式對(duì)瘢痕疙瘩進(jìn)行治療，但難以獲得確切療效。關(guān)于瘢痕疙瘩的病理學(xué)研究表明，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖加快后，會(huì)進(jìn)入到非正常的凋亡途徑中[5]?；诖?，對(duì)瘢痕疙瘩進(jìn)行治療的關(guān)鍵為減緩瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。另外，大量臨床研究表明，所有哺乳動(dòng)物中都有PI3K/Akt細(xì)胞信號(hào)通路存在，此通路可對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖產(chǎn)生促進(jìn)作用[6-7]。不僅如此，PI3K/Akt細(xì)胞信號(hào)通路可經(jīng)細(xì)胞核層面對(duì)蛋白P53蛋白量表達(dá)進(jìn)行下調(diào)，并對(duì)Bcl-2蛋白家族產(chǎn)生調(diào)控作用，進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡[8]。從細(xì)胞學(xué)方面而言，瘢痕疙瘩的形成機(jī)制主要為纖維細(xì)胞過(guò)度增殖，TSG-6是一種由30 kDa分泌的蛋白，屬于透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白家族的一員，正常細(xì)胞、皮膚組織中無(wú)表達(dá)，受炎性反應(yīng)物質(zhì)刺激后，可大量表達(dá)于成纖維細(xì)胞中，表明在瘢痕疙瘩凋亡機(jī)制中，PI3K/Akt細(xì)胞信號(hào)通路、TSG-6均有一定作用[9-10]。

近年來(lái)，關(guān)于基因的臨床研究不斷深入，瘢痕疙瘩發(fā)生機(jī)制中基因的作用逐漸被臨床上重視，從基因方面來(lái)說(shuō)，瘢痕疙瘩的病理學(xué)基礎(chǔ)主要為瘢痕疙瘩呈纖維細(xì)胞增生，大量細(xì)胞外基質(zhì)沉積。臨床研究表明，瘢痕疙瘩的形成與細(xì)胞信號(hào)通路有關(guān)，而細(xì)胞細(xì)胞通路與細(xì)胞周期直接關(guān)聯(lián)[11]。細(xì)胞周期指的是母細(xì)胞分裂形成子代細(xì)胞開(kāi)始至下一次細(xì)胞再次分裂為子代細(xì)胞的過(guò)程，在瘢痕疙瘩凋亡機(jī)制的研究中，通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期展開(kāi)分析，可了解非細(xì)胞增殖狀態(tài)與細(xì)胞周期之間的關(guān)聯(lián)性。本次研究以瘢痕疙瘩患者手術(shù)標(biāo)本為材料，對(duì)TSG-6過(guò)度表達(dá)細(xì)胞株（過(guò)度表達(dá)組）、TSG-6干擾細(xì)胞株（干擾組）、TSG-6過(guò)度表達(dá)對(duì)照細(xì)胞株（過(guò)度表達(dá)對(duì)照組）、TSG-6干擾對(duì)照細(xì)胞株（干擾對(duì)照組）進(jìn)行構(gòu)建，測(cè)定4組細(xì)胞與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡情況。此研究結(jié)果表明，基于生物學(xué)特性，被激活或高度表達(dá)的TSG-6基因可對(duì)瘢痕疙瘩的形成產(chǎn)生抑制作用，創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中，若TSG-6表達(dá)量降低，則會(huì)對(duì)瘢痕疙瘩的形成與發(fā)展產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。文科等[12]的研究對(duì)兔耳創(chuàng)面模型進(jìn)行構(gòu)建后注射TSG-6、0.9%氯化鈉溶液，檢測(cè)瘢痕指數(shù)，可見(jiàn)注射TSG-6組瘢痕指數(shù)顯著較低，得出的結(jié)論為TSG-6可對(duì)瘢痕增生進(jìn)行抑制，相似于本文的研究。

在細(xì)胞正常生理功能的維持與細(xì)胞凋亡中，PI3K/Akt-Bcl-2通路發(fā)揮著重要作用[13-14]。Bcl-2屬于內(nèi)膜蛋白的一種，廣泛表達(dá)于人體組織細(xì)胞中，多項(xiàng)研究表明其在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，提示此基因在抑制凋亡方面有一定作用[15-16]。而PI3K/Akt信號(hào)通路可對(duì)Bcl-2活性產(chǎn)生調(diào)控作用，Akt被激活后，可通過(guò)線粒體對(duì)Bcl-2產(chǎn)生作用，使其被激活，Bcl-2又可促進(jìn)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡[17-18]。本次研究分別對(duì)TSG-6過(guò)度表達(dá)細(xì)胞株、TSG-6干擾細(xì)胞株、TSG-6過(guò)度表達(dá)對(duì)照細(xì)胞株、TSG-6干擾對(duì)照細(xì)胞株的PI3K、Akt、Bcl-2基因mRNA與蛋白表達(dá)情況進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，過(guò)度表達(dá)組PI3K、Akt、Bcl-2基因mRNA與蛋白表達(dá)均顯著較干擾組、過(guò)度表達(dá)對(duì)照組、干擾對(duì)照組、瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞低，干擾組PI3K、Akt、Bcl-2基因mRNA與蛋白表達(dá)均較過(guò)度表達(dá)組、過(guò)度表達(dá)對(duì)照組、干擾對(duì)照組、瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），過(guò)度表達(dá)對(duì)照組、干擾對(duì)照組、瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞對(duì)比則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?？梢?jiàn)，TSG-6過(guò)度表達(dá)，細(xì)胞增殖速度變緩，細(xì)胞凋亡增多，而TSG-6干擾后，細(xì)胞增殖加快，凋亡隨之減少，表明TSG-6過(guò)度表達(dá)可對(duì)PI3K、Akt、Bcl-2產(chǎn)生抑制作用，而TSG-6干擾后可對(duì)PI3K、Akt、Bcl-2表達(dá)產(chǎn)生促進(jìn)作用。此結(jié)果相似于Bao等[19]的研究，進(jìn)一步表明TSG-6對(duì)人瘢痕疙瘩產(chǎn)生影響與PI3K/Akt-Bcl-2通路相關(guān)，此途徑可對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，使其增殖率下降。另有研究表明，PIK3被激活后，可通過(guò)第二信使對(duì)Akt產(chǎn)生激活作用，使下游分子中Blc-2表達(dá)量上升，對(duì)細(xì)胞抗凋亡程序進(jìn)行啟動(dòng)，促使細(xì)胞異常增殖、組織量異常增加[20-21]。基于此，對(duì)瘢痕疙瘩進(jìn)行治療時(shí)，可通過(guò)TSG-6對(duì)PI3K/Akt-Bcl-2信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，促進(jìn)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖，以達(dá)到對(duì)瘢痕疙瘩增生進(jìn)行抑制的效果。

綜上所述，TSG-6過(guò)度表達(dá)可抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中PI3K、Akt、Bcl-2表達(dá)，表明TSG-6可通過(guò)對(duì)PI3KAkt-Bcl-2信號(hào)通路進(jìn)行負(fù)向調(diào)控，達(dá)到抑制瘢痕疙瘩的效果。但此次研究尚有不足，如未展開(kāi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、未納入其他細(xì)胞凋亡途徑等，需展開(kāi)進(jìn)一步研究，以探討TSG-6對(duì)人瘢痕疙瘩凋亡機(jī)制的影響。