中國人群血型ABO 亞型的分子基礎(chǔ)研究

雷 航 ，范亮峰，蔡曉紅，王鈺箐，劉 曦，金 沙，沈 偉，陸 瓊，向 東，王學(xué)鋒，鄒 緯

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院輸血科，上海 200025；2.上海市血液中心血型參比室，上海 200051）

ABO 血型系統(tǒng)是輸血和器官移植血型鑒定中最重要的血型系統(tǒng)，由血型之父Karl Landsteiner 于1900 年發(fā)現(xiàn)[1]。ABO 血型不相容的輸血會導(dǎo)致患者發(fā)生嚴(yán)重的急性溶血性輸血反應(yīng)，從而導(dǎo)致急性腎功能衰竭，甚至死亡[2]。A、B、AB 和O 型4 種血型在全球范圍內(nèi)的分布頻率有很大差異，我國人群的B等位基因頻率從南向北逐漸增高，而O 等位基因頻率則從南向北逐漸降低，A 等位基因分布頻率差異趨勢不明顯[3]。在我國人群中，A 等位基因主要為A1.02，B 等位基因主要為B.01，O 等位基因則有O.01.01 和O.01.02 這2 種常見的基因型[4]。ABO亞型是一種遺傳性ABO 弱表現(xiàn)型，為紅細(xì)胞上H抗原表達(dá)正常但A 抗原和B 抗原的數(shù)量減少或質(zhì)量發(fā)生改變，血漿中可伴有不規(guī)則的抗A 或者抗B抗體。ABO 亞型是導(dǎo)致ABO 血型鑒定困難、甚至誤判的重要原因，而ABO 亞型的漏檢或誤判可導(dǎo)致急性溶血反應(yīng)[5-6]。ABO 亞型分子檢測方法，可提高血型變異型鑒定的準(zhǔn)確率，目前已被廣泛用于解決疑難ABO 血型鑒定，尤其是針對擬輸血的患者，具有重要的臨床應(yīng)用價值。

本研究對1 545 505 名獻(xiàn)血者和116 209 例受血者中檢出的ABO 亞型進(jìn)行表型與基因型關(guān)聯(lián)性研究，探討中國人群ABO 亞型的分布特點(diǎn)及背景。

資料與方法

一、資料

收集2014 年7 月至2019 年6 月間在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院（以下簡稱瑞金醫(yī)院）門急診進(jìn)行血型鑒定的患者116 209 例及在上海市血液中心及各郊縣獻(xiàn)血的不重復(fù)獻(xiàn)血者1 545 505 名。另選擇120 名正常ABO 血型的隨機(jī)獻(xiàn)血者作為對照。本研究納入的樣本來源均不包括新生兒、血液系統(tǒng)疾病患者或近1 個月內(nèi)有ABO 不同型輸血史的患者。標(biāo)本類型均為乙二胺四乙酸二鉀抗凝的外周全血。

二、方法

1.血清學(xué)檢測： 所有血標(biāo)本均先經(jīng)Galileo 全自動血型分析儀（Immucor 公司，美國）、Autovue 全自動血型儀（強(qiáng)生公司，美國）和IH-1000 全自動血型儀（Bio-Rad 公司，美國）進(jìn)行ABO 和Rh 血型鑒定。對ABO 正反不符的血標(biāo)本采用試管法進(jìn)行ABO 亞型鑒定[7]，使用的試劑包括抗A 和抗B 血型定型試劑（單克隆抗體）、抗A 和抗B 單克隆抗體、抗H 單克隆抗體、抗A1 凝集素、A2 細(xì)胞、抗體篩選紅細(xì)胞試劑盒和人ABO 血型反定型用紅細(xì)胞試劑盒（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司）。臍血O 細(xì)胞、人源多克隆抗A、人源多克隆抗B 試劑為實(shí)驗(yàn)室自制試劑（效價1∶128）。ABO 亞型均以血清學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類[1-3,8]。

2.基因組DNA 抽提與PCR 擴(kuò)增：采用血液基因組DNA 抽提試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]抽提外周血標(biāo)本中的基因組DNA。對544 例ABO 亞型的ABO 基因啟動子、增強(qiáng)子、7 個外顯子及其側(cè)翼序列和內(nèi)含子6 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。所用相關(guān)PCR 引物序列參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行設(shè)計(jì)。

3.PCR 產(chǎn)物純化、測序及克?。翰捎肈NA 瓊脂糖凝膠純化試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]純化并回收PCR 產(chǎn)物，用末端標(biāo)記雙脫氧法對ABO 基因的啟動子、增強(qiáng)子、7 個外顯子以及其側(cè)翼序列和內(nèi)含子6 PCR 產(chǎn)物純化后進(jìn)行測序。將PCR 產(chǎn)物克隆到pMD18-T 載體進(jìn)行單倍型鑒定。

4.ABO 等位基因的命名方式

核苷酸和氨基酸采用國際輸血協(xié)會的基因突變和等位基因術(shù)語進(jìn)行命名。ABO 基因序列比對分析的參考序列為ABO*A1.01 和ABO*B.01 等位基因序列。若還未被國際輸血協(xié)會命名，則按文獻(xiàn)首次報道中的命名顯示。

結(jié) 果

一、ABO 亞型的表型鑒定

經(jīng)對上海市血液中心的獻(xiàn)血者及瑞金醫(yī)院門急診患者進(jìn)行ABO 亞型初篩和確認(rèn)檢測，確定的亞型表型和例數(shù)分布情況見表1。本研究在1 661 714 份血型鑒定標(biāo)本中共檢出617 例ABO亞型，其中1 545 505 份來自獻(xiàn)血者，檢出ABO 亞型590 例，檢出率為3.82/萬；116 209 份來自門急診患者，檢出ABO 亞型27 例，檢出率為2.32/萬?？傮w調(diào)查人群的ABO 亞型檢出率為3.71/萬，檢出率最高的表型為B(A)（0.066‰），其次是B3（0.045‰）和Bx（0.039‰）。在檢出的所有ABO 亞型中，B(A)表型是檢出構(gòu)成比（17.83%）最高的亞型，其次則是B3（12.16%）和Bx（10.53%）表型（見圖1A）。

表1 不同來源的ABO 亞型表型檢出數(shù)及檢出率

二、ABO 亞型的基因檢測

本研究對544 例ABO 亞型樣本進(jìn)行基因檢測和分析，在381 例無血緣關(guān)系的個體中共檢出42 種ABO 亞型等位基因（見表2）。在42 種檢出的ABO亞型等位基因中，ABO*BA.04 是檢出構(gòu)成比最高的亞型等位基因，其檢出構(gòu)成比為25.20%，隨后為ABO*BA.02（11.55%）和ABO*cis-AB.01（9.71%）（見圖1B）。

表2 本研究中檢出的42 種ABO 亞型等位基因

圖1 總調(diào)查人群中ABO 亞型的各表型和基因型的檢出構(gòu)成比

另163 例ABO 亞型在目前測序區(qū)域里未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)，占基因檢測總數(shù)的30.0%。在這些個體中，有16 例在ABO 基因5′UTR 增強(qiáng)子測序時檢測到3 種等位基因，證實(shí)存在嵌合現(xiàn)象；雖然由于常見A、B、O 等位基因間存在較多相同的多態(tài)性位點(diǎn)，導(dǎo)致在這16 例樣本的單個外顯子測序中無法直接判斷是否同時存在A、B、O 3 種等位基因。根據(jù)血清學(xué)檢測結(jié)果，這些嵌合體個體的紅細(xì)胞與抗A 或抗B 試劑反應(yīng)時，表現(xiàn)出不同程度的混合視野凝集，出現(xiàn)類似于以下亞型的雙群紅細(xì)胞特征如AendB、A3B、A3B3、Bend、ABend、B3、AB3。另外3 例表型特征符合Ael和ABel，但檢測到的基因型分別為O/O 和A/O 型，推測也可能為微嵌合體。其余的血清學(xué)分類如下，65 例為“3”型，34 例為“x”型，19 例為“el”型，18 例為“m”型，8 例為“end”型。

討 論

一、ABO 亞型表型檢出率的分析

近年來，ABO 亞型的檢出率從最早的1.5/萬[10]到近期的2.8/萬[11]，略有增長的趨勢，這可能與血型檢測相關(guān)技術(shù)的改進(jìn)有關(guān)。另外，由于有些A2亞型個體在血清學(xué)鑒定時不會出現(xiàn)正反定型不符的情況，因此這些A2亞型個體會被漏檢，故本研究得出的檢出率可以看作是表型頻率的下限值。本研究在約166 萬例外周全血樣本中共檢出ABO 亞型617 例，檢出率為3.71/萬。檢出的617 例ABO 亞型共包含28 種ABO 亞型表型，其中B(A)表型的頻率最高，其檢出構(gòu)成比為17.83%，其次為4 種與B3和Bx相關(guān)的亞型，提示這幾種亞型在我國人群中較為常見。

二、ABO 亞型等位基因檢出率的分析

目前已報道的ABO 亞型等位基因約有300 余種[12-13]，本研究對381 例ABO 亞型樣本進(jìn)行基因檢測，共檢出42 種已知ABO 亞型等位基因，包括啟動子區(qū)域突變1 種；可導(dǎo)致氨基酸序列改變的ABO亞型等位基因37 種；可導(dǎo)致外顯子跳躍的剪切位點(diǎn)突變等位基因1 種，以及可導(dǎo)致截短蛋白的移碼突變等位基因3 種。在已檢出的42 種ABO 亞型等位基因中，ABO*BA.04 是檢出構(gòu)成比最高的亞型等位基因，其檢出構(gòu)成比為25.20%，其次為ABO*BA.02 （11.55%）和ABO*cis-AB.01（9.71%）（見圖1B）。

三、ABO 亞型表型與基因型關(guān)聯(lián)性的分析

對本研究中檢出的等位基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，ABO 亞型等位基因所對應(yīng)的表型可與首次檢測報道時的表型不一致，即一種基因型可對應(yīng)多種表型，其原因可能是一種亞型等位基因會受其共表達(dá)的A 或B 基因的競爭或協(xié)同作用影響，或使用的抗血清試劑存在差異所致。如最常見的BA 等位基因，當(dāng)其與A 基因共表達(dá)時，個體可表現(xiàn)為ABx表型；而當(dāng)其與B 基因共表達(dá)時，個體則表現(xiàn)為AxB表型。故BA 等位基因?qū)е碌腁xB 或者ABx的表型，與單純的A（或B）亞型和正常B（或A）基因共表達(dá)時的表型在血清學(xué)上很難區(qū)分。根據(jù)本研究數(shù)據(jù)，BA 等位基因頻率明顯高于A 亞型和B 亞型等位基因，因此當(dāng)出現(xiàn)AxB 或ABx表型時，應(yīng)首先考慮B(A)亞型的可能性。本研究中所檢測到的42 個亞型等位基因中，與“x”表型相關(guān)的有29 個（其中17 種A 亞型中有9 種，18 種B 亞型中有14 種，以及全部6 種AB 雜交等位基因），提示“x”表型是我國人群中基因異質(zhì)性最強(qiáng)的表型；而B(A)和cisAB亞型作為基因型種類較為集中且明確的亞型表型[11]，僅檢出9 種相關(guān)基因型。此外，本研究還檢出6 種A3或B3亞型相關(guān)等位基因，從目前已報道的引起“3”型的突變類型可以發(fā)現(xiàn)，其突變類型有引起催化區(qū)氨基酸置換的錯義突變，以及引起穿膜區(qū)和莖狀區(qū)部分丟失的剪接突變[14-15]，但“3”型所具有的獨(dú)特混合視野表型的形成機(jī)制目前尚未完全闡明。

四、ABO 亞型形成機(jī)制的分析

目前對于ABO 亞型形成的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，與ABO 亞型有關(guān)的ABO 基因突變類型有點(diǎn)突變、缺失、插入和基因重組等多種[11]，如A1.02 等位基因是由于A 等位基因在156 位發(fā)生亮氨酸取代脯氨酸突變形成，生成的糖基轉(zhuǎn)移酶并不影響酶活性[16]。許多亞型等位基因是由2 個ABO 等位基因的部分序列發(fā)生雜交而形成[17]，而這些雜交等位基因的重組多發(fā)生于內(nèi)含子6 中[18]。雜交基因的產(chǎn)物有無活性與雜交基因6 號外顯子的來源有關(guān)，若來源于O1 或O1v，則基因產(chǎn)物無活性；若來源于A 或B 等位基因，則基因產(chǎn)物具有酶活性，其特異性由外顯子7 決定。其他導(dǎo)致ABO 亞型的分子機(jī)制還有導(dǎo)致翻譯提前終止的無義突變[3]；導(dǎo)致無法形成正常功能酶的剪接位點(diǎn)異常[19]；導(dǎo)致酶發(fā)生特異性改變[20]或催化活性減弱[21]的特定位點(diǎn)氨基酸置換；導(dǎo)致ABO 基因轉(zhuǎn)錄水平下降的啟動子區(qū)域內(nèi)缺失突變或單點(diǎn)突變[22-23]；導(dǎo)致ABO 基因表達(dá)發(fā)生改變的1 號內(nèi)含子調(diào)控元件突變[24-26]。

本研究在163 例ABO 亞型樣本中未檢測到突變，除外19 例可能為嵌合體后，剩余最常見的類型為“3”型，其次為“x”型，這可能與這2 種表型在我國人群中的比例較高、發(fā)生機(jī)制復(fù)雜及多樣化有關(guān)。目前已發(fā)現(xiàn)的“3”型表型相關(guān)的基因突變多與基因調(diào)控或剪接位點(diǎn)突變有關(guān)。由于某些內(nèi)含子深部突變也可能導(dǎo)致剪接異常[27-28]，因此對這些編碼區(qū)及其側(cè)翼序列、已知調(diào)控區(qū)域未發(fā)現(xiàn)突變的個體，需要進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后和翻譯后水平的研究，以進(jìn)一步探明ABO 抗原表達(dá)異常的分子機(jī)制。

總之，本研究在中國人群中進(jìn)行了大規(guī)模ABO亞型表型與基因型關(guān)聯(lián)性研究，從分子水平對381 例ABO 亞型標(biāo)本涉及到的42 種ABO 亞型等位基因進(jìn)行了系統(tǒng)分析。結(jié)果顯示，B(A)表型是我國人群中最常見的ABO 亞型，B3和Bx相關(guān)的亞型次之；最常檢出的亞型等位基因則是ABO*BA.04、ABO*BA.02 和ABO*cis-AB.01。針對ABO 亞型等位基因，需要進(jìn)一步行基因突變與蛋白表達(dá)、結(jié)構(gòu)與功能間關(guān)系的研究，以闡明突變導(dǎo)致ABO 抗原表達(dá)減弱的分子機(jī)制，為將來ABO 亞型的分子診斷提供可靠的檢測靶點(diǎn)。