IC-IPAD同時測定運動飲料中20種氨基酸和6種糖

陳貫昊

（平頂山工業(yè)職業(yè)技術學院，河南 平頂山 467001）

氨基酸和糖是運動飲料中兩類重要的營養(yǎng)成分[1]，氨基酸是構成人體蛋白質最基本的物質，糖類是能量的直接供給物質，這兩種物質都具有多種生理功能[2-4]，是人體內(nèi)不可缺少的成分。飲用含有豐富氨基酸和糖類物質的運動飲料后能夠起到保持和提高運動能力、加速運動后疲勞消除的作用。然而并不是所有人群都適應各種氨基酸以及對飲料中糖分的需求，因此有必要建立一種快速檢測飲品中多種氨基酸和糖類的方法，以保障人們科學、合理地攝入此類營養(yǎng)物質。

目前氨基酸和糖的分析方法有毛細管電泳法、氣相色譜法、高效液相色譜法、離子色譜法等[5-13]。毛細管電泳法、氣相色譜法、高效液相色譜法等由于方法的局限性，樣品均需要衍生，操作步驟復雜且穩(wěn)定性差[14-15]；離子色譜法檢測不需衍生，具有靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點[16-17]。本實驗利用離子色譜-積分脈沖安培檢測法（ion chromatographyintegrated pulse amperometric detection，IC-IPAD）在特定電極上、特定電壓下發(fā)生氧化反應的分析物具有專一性，其他化合物不能被檢測到的原理[18]，同時測定運動飲料中20種氨基酸和6種糖，極大地提高了檢測效率，能夠滿足我國市場上對此類檢測的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

20種氨基酸標準品（精氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丙氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸、絲氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸，純度均＞98%）：中國計量科學研究院；海藻糖、葡萄糖、蔗糖、D-乳糖、麥芽糖、三氯蔗糖標準品（純度均＞99.0%）：上海安譜科學儀器有限公司。乙酸鈉（純度＞99.9%），氫氧化鈉溶液（質量分數(shù)50%）：Thermo Scientific 公司；超純水：由Milli-Q Advantage制得；運動飲料（5種）：市售。

1.2 儀器與設備

ICS5000型離子色譜儀（配AS-AP安培檢測器）：美國賽默飛公司；Milli-Q純水儀：美國Millipore公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 離子色譜條件

色譜柱：AminoPac PA10（250 mm×2.0 mm，3 μm）；保護柱：AminoPac PA10（50 mm×2.0 mm）；檢測模式：積分脈沖安培檢測；工作電極：金電極；參比電極：pH電極；電位波形：Glod，pH-Ag-AgCl RE，AAA；流動相：A為NaOH溶液（225 mmol/L），B為去離子水，C為醋酸鈉溶液（1.00 mol/L）；流速：0.30 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：25 μL。梯度淋洗條件見表1。

表1 離子色譜梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of ion chromatography

1.3.2 色譜柱溫度的選擇

色譜柱溫度是影響離子交換速率和分離選擇性的重要因素[19-21]，但是關于色譜柱溫度對離子色譜分離氨基酸和糖的影響當前研究較少。根據(jù)待測氨基酸和糖的物化性質和分離特性，本實驗選取了26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、35 ℃、38 ℃等6個溫度進行比較分析。

1.3.3 pH值的選擇

受自身分子結構、等電點、極性和解離常數(shù)等因素影響，氨基酸和糖含量一般會隨pH值的變化而變化[22-23]，所以需要對此因素進行研究。分別移取相同體積的10份標準儲備液，調節(jié)為不同pH值，定容至相同體積，此時每份溶液中26種組分的理論濃度相同，pH值在2.0～13.0之間，依次上機測定。

1.3.4 標準曲線的繪制

分別準確稱取0.050 0 g的20種氨基酸和6種糖分標準品，用超純水溶解并定容于50 mL的容量瓶中，制得標準儲備溶液。再用超純水配制質量濃度為0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L、50.0 mg/L系列標準溶液，經(jīng)儀器進行分析，繪制標準曲線。

1.3.5 樣品前處理的優(yōu)化

稱取10.00 g樣品加入50 mL離心管中，加入1 mol/L HCl溶液調節(jié)pH至1.7±0.1，再用1 mol/L NaOH溶液調節(jié)樣品溶液pH至4.5±0.1，定容至刻度。IC-RP10小柱凈化條件：依次用10 mL甲醇和10 mL水活化凈化柱，然后上樣并棄去前3 mL，收集流出液并通過0.22 μm水相濾膜，待上機檢測。

2 結果與分析

2.1 梯度淋洗條件的選擇

為提高對目標物的檢測靈敏度和分離度，實驗采用多級梯度淋洗模式對26種組分進行洗脫。經(jīng)過反復實驗和對比，淋洗步驟被分為5段：0～12.0 min、12.0～17.0 min、17.0～24.0 min、24.0～40.0 min、40.1～50.0 min。以45 mmol/L氫氧化鈉溶液作為初始淋洗液濃度，在0～12.0 min區(qū)間可以實現(xiàn)前13種弱保留組分的有效分離。在12.0～17.0 min區(qū)間范圍內(nèi)，氫氧化鈉濃度逐步增至90 mmol/L，此時可實現(xiàn)組分14～17的有效分離；在17.0～24.0 min區(qū)間范圍內(nèi)，逐步加入強極性淋洗液醋酸鈉溶液，為中強保留組分的快速洗脫做準備。在24.0～40.0 min區(qū)間范圍內(nèi)，選用氫氧化鈉溶液∶去離子水∶醋酸鈉溶液=24∶36∶40（V/V）進行洗脫，可使組分18～25完全分離。在40.1～50.0 min區(qū)間范圍內(nèi)，為加快洗脫強保留組分色氨酸，同時確保其靈敏度，選擇氫氧化鈉∶醋酸鈉=50∶50（V/V）為洗脫液。

2.2 色譜柱溫度的選擇

26種組分混合標準溶液的離子色譜圖見圖1（35 ℃）。由圖1可知，在不同的色譜溫度下分離，精氨酸（組分1）、海藻糖（組分2）、賴氨酸（組分3）、谷氨酰胺（組分4）、天冬酰胺（組分5）和麥芽糖（組分18）、組氨酸（組分19）、苯丙氨酸（組分20）、谷氨酸（組分21）、天冬氨酸（組分22）、半胱氨酸（組分23）、三氯蔗糖（組分24）、酪氨酸（組分25）的保留時間和靈敏度沒有明顯變化，因為這些物質是極性帶電或含有極性較強側鏈基團組分，與色譜柱的作用力主要是庫侖力（電荷力）和側鏈基團作用力，受溫度影響相對較小。而從葡萄糖（組分6）至蛋氨酸（組分17），主要是非極性、極性不帶電氨基酸和糖類，受溫度影響較大。從分離度來看，在26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、35 ℃、38 ℃時，出峰組分數(shù)量分別為23、25、25、25、26、25個。從圖1中看出，26 ℃時，有3對組分出現(xiàn)共洗脫，分別是葡萄糖和丙氨酸（組分6和7）、絲氨酸和脯氨酸（組分12和13）、D-乳糖和異亮氨酸（組分14和15）；28 ℃時，葡萄糖和丙氨酸（組分6和7）共洗脫，不能滿足定性和定量分析要求；30 ℃和32 ℃時，蔗糖、絲氨酸和脯氨酸（組分11、12和13）重疊；38 ℃，纈氨酸和蔗糖（組分10和11）以及亮氨酸和蛋氨酸（組分16和17）共洗脫；而35 ℃時，26種組分有效分離，總體分離度最好。

圖1 不同色譜柱溫度下26種組分混合標準溶液測定的離子色譜圖Fig.1 Ion chromatogram of 26 components mixed standard solution at different column temperatures

2.3 pH值對目標組分的影響

本實驗選擇2.0～13.0之間不同pH值對26種組分測定的影響。由圖2可知，蘇氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸、海藻糖、蔗糖這7種組分幾乎不受pH值的影響，在酸性和堿性條件下，測定值均比較穩(wěn)定；而谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、葡萄糖、D-乳糖、麥芽糖這9種組分測定值受pH值影響較大。

圖2 不同pH值對目標組分的影響Fig.2 Effect of different pH on target components

由圖2可知，谷氨酸和絲氨酸受pH值影響較大，且受pH影響的規(guī)律一致，在強酸和強堿性條件下測定值均出現(xiàn)了大幅增大，說明在酸堿性條件下兩種組分溶液中離子含量較中性時出現(xiàn)明顯增大；苯丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸這4種組分測定值受pH值影響相對較小，當pH值＜4.0或者pH值＞10.0時，這4種組分測定值才會出現(xiàn)波動變化，主要是因為這4種組分是兩性電解質，酸性條件下，氨基（-NH2）吸收H+帶正電，堿性條件下，羧基（-COOH）失去H+帶負電，因此，在強酸和強堿溶液中氨基酸離子含量隨其電離程度大小而變化。除天冬氨酸等電點為2.77、谷氨酸3.22、賴氨酸為9.74、精氨酸為10.76外，其他16種氨基酸的等電點在5.05～7.60之間，在等電點附近溶液中氨基酸離子的含量穩(wěn)定，因此，在弱酸性條件下多數(shù)氨基酸測定值穩(wěn)定。從圖2還可以看出，葡萄糖、D-乳糖、麥芽糖在強酸性條件下，測定值稍有降低，但是在強堿性條件下，葡萄糖測定值逐步增大，而乳糖、麥芽糖測定值逐步降低，這是由于3種糖中均含有游離的醛基，是還原糖，而乳糖和麥芽糖屬于二糖，在一定條件下可發(fā)生水解等反應轉化成一定量的葡萄糖，導致葡萄糖測定值有所增大。綜合考慮，選擇pH值為5.2～6.7，即弱酸性條件下進行分析測定，這26種組分均在穩(wěn)定的pH值范圍內(nèi)。

2.4 樣品前處理的優(yōu)化

運動飲料類一般含有蛋白質、明膠和果膠等物質，不僅會對目標組分的色譜峰產(chǎn)生干擾，而且還容易對離子色譜柱及檢測器造成損壞。因此，需在樣品的前處理過程中增加除蛋白的步驟以減少干擾，保護色譜柱?？紤]到AminoPac PA10離子色譜柱對有機試劑的不耐受性以及金屬離子對其的不良影響，本實驗選擇調節(jié)pH沉淀蛋白的方式并結合凈化柱的方式對樣品進行前處理[24]。常用的離子色譜凈化柱有On Guard Na柱、On Guard A柱以及On Guard RP柱：On Guard Na柱主要用于去除樣品溶液中的金屬離子；On Guard A柱主要用于去除樣品溶液中的陰離子污染物并中和強酸；而On Guard RP柱主要用于去除樣品溶液中的疏水性物質及表面活性劑。考慮到樣品溶液中可能存在部分脂溶性物質，所以選擇On Guard RP柱以除去樣品中的脂溶性物質，避免污染色譜柱。

2.5 方法的線性范圍與靈敏度

以表1梯度洗脫的步驟，按1.3.3實驗步驟配制26種氨基酸和糖的混合標準溶液，繪制標準曲線，依據(jù)色譜峰的信噪比大于3倍確定檢出限，信噪比大于10倍確定定量限。26種種組分的保留時間、線性回歸方程、相關系數(shù)、檢出限與定量限見表2。由表2可知，26種目標物組分在0.5～50 mg/L質量濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關系，相關系數(shù)（R2）均＞0.99，檢出限為0.01～0.03mg/L，定量限為0.003～0.200mg/L。

表2 26種組分的保留時間、線性回歸方程、相關系數(shù)、檢出限與定量限Table 2 Retention time,linear regression equation,correlation coefficient,detection limit and quantitative limit of 26 components

2.6 方法的精密度、重復性與回收率

在加標回收實驗中，根據(jù)目標物的定量限，分別添加3個低、中、高三個水平（1 mg/L、10 mg/L、50 mg/L）混合標準溶液，每個結果測定5次，來驗證測定運動飲料基質（樣品選擇為表4中的樣品1）時方法的回收率和精密度，根據(jù)基質濃度、添加濃度和測定濃度計算回收率，3個濃度水平的平均回收率和相對標準偏差（rlative sandard deviation，RSD），結果見表3。

表3 方法的回收率實驗結果Table 3 Results of recovery rate tests of the method

續(xù)表

由表3可知，26種組分在3種濃度的添加水平下回收率在86.2%～105.0%之間，測定數(shù)據(jù)的RSD在1.9%～5.3%范圍內(nèi)，說明本實驗的測定方法準確性高、精密度好。

2.7 樣品的測定

本實驗還對市場上購買的5種常見運動飲料中的20種氨基酸和6種糖含量進行測定，每個結果平均測定5次，具體結果見表4。

表4 樣品中20種氨基酸和6種糖的測定結果（n=5）Table 4 Determination results of 20 amino acids and six sugars in samples (n=5)

續(xù)表

由表4可知，從市場上隨機抽取的樣品中氨基酸和糖的種類及含量差異較大。5款飲品中都含有谷氨酸，而精氨酸、賴氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、絲氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、色氨酸這14種氨基酸只有個別樣品中有，而谷氨酰胺、天冬酰胺、甘氨酸、半胱氨酸、酪氨酸在這5種樣品中沒有添加，整體氨基酸檢測到的種類與產(chǎn)品外包裝標簽中標出的一致；而5款飲品中都含有葡萄糖，而蔗糖、D-乳糖、三氯蔗糖只有個別樣品中有，海藻糖、麥芽糖沒有檢出。針對分析測定的結果，可以根據(jù)自身的需要，選用不同類型的功能性飲料，來補充全面的或者單一的氨基酸和糖，這樣會達到更有效的補充目的。

3 結論

本實驗通過對梯度淋洗條件、色譜柱溫度、溶液pH值以及前處理條件等多種影響因素進行研究，建立了一種梯度淋洗-離子色譜-積分脈沖安培檢測法同時測定運動飲料中26種組分含量的方法。26種目標物組分在0.5～50 mg/L質量濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關系，檢出限為0.001～0.060 mg/L，定量限為0.003～0.200 mg/L，加標回收率達到86.2%～105.0%，RSD為1.9%～5.3%，可用于運動飲料中氨基酸和糖的同時檢測，這為運動飲料樣品中多組分的同時測定提供了一種高效、便捷、準確的技術手段。