發(fā)酵小麥胚芽產2,6-二甲氧基對苯醌菌種篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

侯宇豪，常 霞，謝秋濤，袁洪燕，劉思含，宋 瑩，李高陽

（1.湖南大學 研究生院隆平分院，湖南 長沙 410125；2.湖南省農業(yè)科學院 農產品加工研究所，湖南 長沙 410125）

小麥胚芽是小麥制粉過程中的主要副產物，營養(yǎng)價值豐富，其中高含量的蛋白質以及不飽和脂肪酸讓小麥胚芽可作為蛋白補充劑與糧油制品的理想原料[1-4]。但由于小麥胚芽中存在高活性的內源脂肪氧化酶、高含量的抗營養(yǎng)因子以及高水分活度[5-6]，使得小麥胚芽難以直接作為食品加工原料得到有效利用，往往被作為飼料或廢料處理[7-8]。發(fā)酵作為改良食品理化及加工特性的有效方法，在小麥胚芽上也得到了成功應用。發(fā)酵后的小麥胚芽中的植酸等抗營養(yǎng)因子的含量大大減少，脂肪酶和脂肪氧化酶的活性也得到顯著抑制[9]。研究還發(fā)現(xiàn)，小麥胚芽中的活性肽、多酚等功能活性物質的含量也在發(fā)酵后顯著增加，具有降血脂、抗氧化、抗腫瘤等生理功能[10-12]。其中2,6-二甲氧基對苯醌（2,6-dimethoxy-ρ-benzoquinone，2,6-DMBQ）作為發(fā)酵小麥胚芽中主要的抗腫瘤活性成分而受到廣泛關注。

2,6-DMBQ來源于小麥胚芽細胞內的水溶性氫醌糖苷。在發(fā)酵過程中，氫醌糖苷的糖苷鍵受微生物分泌的β-葡萄糖苷酶的作用斷裂，并在過氧化氫酶的作用下生成2,6-DMBQ[13]。HIDVéGI M等[14]在20世紀90年代利用面包酵母發(fā)酵小麥胚芽，對發(fā)酵產物加工后得到發(fā)酵小麥胚芽提取物并命名為Avemar。在后續(xù)的研究中，Avemar的抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力的功效得到廣泛證實[15-16]，但對于Avemar具體的發(fā)酵工藝與發(fā)酵菌種卻鮮有報道。國內學者經秀等[17]和國外學者RIZZELLO C G等[18]分別以酵母菌和乳酸菌為受試菌種進行產2,6-DMBQ菌種的篩選，最終得出高溫釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）為最適發(fā)酵菌種，但是后續(xù)并沒有對兩種菌種產2,6-DMBQ的能力進行進一步比較。

本研究以小麥胚芽為原料，2,6-DMBQ產量為評價指標，從3株菌株中篩選最優(yōu)發(fā)酵菌種，并考察3種原料前處理方式對2,6-DMBQ產量的影響。在此基礎上，探究菌種添加量、料液比、發(fā)酵溫度以及發(fā)酵時間4個發(fā)酵工藝因素對2,6-DMBQ產量的影響，并通過單因素試驗及正交試驗確定最適合發(fā)酵工藝組合，旨在為發(fā)酵小麥胚芽資源進一步開發(fā)利用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

小麥胚芽：市售。

1.1.2 菌種

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）：實驗室分離保存；高溫釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、低糖面包酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.1.3 試劑

甲醇、氯化鈉（均為分析純）：國藥集團上海試劑有限公司；2,6-二甲氧基對苯醌標準品（純度＞97%）：梯希愛上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extractpeptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

RS-FS1401型多功能粉碎機：合肥榮事達小家電有限公司；LHS-250HC-11型恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；BSA 124S型精密分析天平：廣州市授科儀器科技有限公司；Avanti J-26xp型高速離心機：美國Beckman公司；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；LDZM-80L-III型滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；LGJ-25G冷凍干燥機：北京四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展有限公司；M3-L233B微波爐：廣東美的微波爐制造有限公司；Waters ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色譜系統(tǒng)：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 小麥胚芽發(fā)酵工藝及操作要點

操作要點：

粉碎：將小麥胚芽粉碎后，過60目篩。

滅菌：將小麥胚芽粉與超純水按質量比1∶3充分混勻后在121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌15 min。

預處理：將滅完菌的小麥胚芽與超純水按照質量比1∶10再次混勻，按照后續(xù)試驗設計進行不同處理。

菌種活化、接種：將植物乳桿菌接入MRS肉湯，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，取200 μL培養(yǎng)液接入MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化培養(yǎng)2代后，按后續(xù)試驗設計進行接種。高溫釀酒酵母和低糖面包酵母在37 ℃溫水中活化10 min后取200 μL接入YEPD培養(yǎng)基，28 ℃條件下培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化培養(yǎng)2代后，按后續(xù)試驗設計進行接種。

發(fā)酵：按照后續(xù)試驗設計分別在不同條件下進行發(fā)酵。

1.3.2 發(fā)酵菌種的篩選

植物乳桿菌：用無菌生理鹽水將活化后的植物乳桿菌菌體濃度調節(jié)至1×104CFU/mL，按菌種添加量1∶6（菌液與麥胚質量比，g∶g）添加到料液比為1∶15（麥胚與水質量比，g∶g）的小麥胚芽發(fā)酵基液中，37 ℃條件下發(fā)酵24 h[19]。

酵母：用無菌生理鹽水將活化后的高溫釀酒酵母、低糖面包酵母的菌體濃度調節(jié)至1×104CFU/mL，按菌種添加量1∶6分別添加到料液比為1∶15的小麥胚芽發(fā)酵基液中，28 ℃條件下發(fā)酵24 h[17]。

取發(fā)酵液測定2,6-DMBQ產量，比較3株菌產2,6-DMBQ的能力，確定最適發(fā)酵菌種。

1.3.3 不同預處理方式對2,6-DMBQ產量的影響

在確定最適發(fā)酵菌種的基礎上，以未作處理的小麥胚芽為空白對照，根據(jù)前期預試驗結果，分別采用高溫（95 ℃，30 min）、微波（700 W，5 min）、超聲（功率100%，30 min）3種方法對小麥胚芽進行預處理[20]。用無菌生理鹽水將活化后的最適菌種的菌體濃度調節(jié)至1×104CFU/mL，按菌種添加量1∶6添加到料液比為1∶15的小麥胚芽發(fā)酵基液中，28 ℃條件下發(fā)酵24 h。測定發(fā)酵液中2,6-DMBQ產量，以探究不同的預處理條件下是否有助于2,6-DMBQ產量的增加，確定最適預處理方式。

1.3.4 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

在確定最適發(fā)酵菌種和預處理方式后進行發(fā)酵條件的研究，固定發(fā)酵條件為：菌種添加量1∶6、料液比1∶15、發(fā)酵時間24 h、發(fā)酵溫度28 ℃，在此基礎上，依次考察菌種添加量（1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）、發(fā)酵溫度（18 ℃、23 ℃、28 ℃、33 ℃、38 ℃）、發(fā)酵時間（18 h、24 h、30 h、36 h、42 h）對2,6-DMBQ產量的影響，確定各因素的最適條件以進行正交試驗。

1.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果，以2,6-DMBQ產量為評價指標，選取菌種添加量（A）、料液比（B）、發(fā)酵時間（C）、發(fā)酵溫度（D）4個因素進行4因素3水平的L9（34）正交試驗設計，以確定最佳發(fā)酵條件組合，正交試驗因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵小麥胚芽產2,6-二甲氧基對苯醌發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of 2,6-dimethoxy-ρ-benzoquinone production by fermented wheat germ

1.3.6 2,6-DMBQ產量的測定

樣品的處理：將發(fā)酵液在8000×g、4℃條件下離心15min，取上清液冷凍干燥，然后加入20 mL甲醇于凍干物料中進行浸提，超聲處理（功率100%，30 min）后，用0.22 μm濾膜過濾制得待測樣品液進行測定。

參照經秀等[17]的方法進行了改進，采用超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）法測定2,6-DMBQ產量。UPLC條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動相為甲醇∶水=20∶80（V/V），流速0.2 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量0.2 μL，檢測波長288 nm。以2,6-DMBQ的質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，繪制2,6-DMBQ標準曲線。2,6-DMBQ標準曲線的回歸方程為y=48 102x-33 772，R2=0.999 4，說明2,6-DMBQ在1～100 μg/mL質量濃度范圍內具有良好的線性關系，可用于2,6-DMBQ的定量。根據(jù)2,6-DMBQ標準品的保留時間進行定性。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用Excel 2019軟件整理數(shù)據(jù)，使用GraphPad Prism 8軟件進行繪圖與方差分析（analysis of variance，ANOVA）顯著性檢驗（P＜0.05），使用SPSS 22軟件進行正交試驗方差分析，所有試驗指標數(shù)據(jù)均以“平均值±標準偏差”形式表示。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵菌種的篩選

發(fā)酵菌種產2,6-DMBQ的能力與菌種產生的β-葡萄糖苷酶緊密相關。先前的研究表明，面包酵母[14]、釀酒酵母[21]以及植物乳桿菌[18]均可產生高活性的β-葡萄糖苷酶，并能有效轉化小麥胚芽中的氫醌糖苷生成2,6-DMBQ，但是并未有研究對這幾種類型的菌株產2,6-DMBQ的能力進行統(tǒng)一比較。因此，在前人研究的基礎上，選擇1株乳酸菌和2株酵母菌進行產2,6-DMBQ能力的比較，結果見圖1。

圖1 不同發(fā)酵菌株對2,6-二甲氧基對苯醌產量的影響Fig.1 Effect of different fermentation strains on 2,6-dimethoxy-ρbenzoquinone yield

由圖1可知，低糖面包酵母產2,6-DMBQ的能力[（100.81±8.33）μg/g]顯著高于植物乳桿菌[（62.22±7.61）μg/g]和高溫釀酒酵母[（73.95±6.61）μg/g]（P＜0.05），說明3株菌種在各自最適生長溫度下，相同菌體濃度發(fā)酵相同時間，低糖面包酵母相對于植物乳桿菌與高溫釀酒酵母具有更強的產2,6-DMBQ的能力，因此，選擇低糖面包酵母作為后續(xù)試驗的發(fā)酵菌種。

2.2 不同預處理方式對2,6-DMBQ產量的影響

2,6-DMBQ的前體物質氫醌糖苷主要存在于小麥胚芽細胞內部[22]，常溫條件下直接用水浸提的效率緩慢。因此，在發(fā)酵前需要對小麥胚芽進行預處理，破壞其細胞結構，使小麥胚芽中的氫醌糖苷盡可能被發(fā)酵菌種利用。常見的細胞破壁方法有超聲法[23]、微波法[24]、高溫法[20]等。因此，選擇上述3種預處理方法探究其對2,6-DMBQ產量的影響，結果見圖2。

圖2 不同預處理方式對2,6-二甲氧基對苯醌產量的影響Fig.2 Effect of different pretreatment methods on 2,6-dimethoxy-ρbenzoquinone yield

由圖2可知，與空白對照相比，3種預處理方式均能顯著提高2,6-DMBQ的產量（P＜0.05），且小麥胚芽在發(fā)酵前經超聲處理后，2,6-DMBQ產量[（418.77±3.38）μg/g]顯著高于微波處理[（208.78±8.01）μg/g]和高溫處理方式[（201.48±10.66）μg/g]（P＜0.05）。分析原因可能是超聲處理時產生的空穴效應可以破壞小麥胚芽的細胞壁和細胞膜，從而釋放出更多的氫醌糖苷于發(fā)酵基液中，進而增加2,6-DMBQ的產量，而高溫處理與微波處理對于小麥胚芽的細胞壁和細胞膜破壞程度相對較弱[23]。因此，選擇超聲處理作為小麥胚芽發(fā)酵前的預處理方式。

2.3 低糖面包酵母產2,6-DMBQ發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

2.3.1 菌種添加量對2,6-DMBQ產量的影響

由圖3可知，隨著菌種添加量的減少，2,6-DMBQ產量呈先增加后減少的趨勢，當菌種添加量為1∶8時，2,6-DMBQ產量最高為（447.15±12.18）μg/g，分析原因可能是菌種添加過多使得菌體之間產生了營養(yǎng)競爭，而菌種添加過少菌體無法充分利用底物進行產出。因此，確定最適菌種添加量為1∶8。

圖3 菌種添加量對2,6-二甲氧基對苯醌產量的影響Fig.3 Effect of strain addition on 2,6-dimethoxy-ρ-benzoquinone yield

2.3.2 料液比對2,6-DMBQ產量的影響

圖4 料液比對2,6-二甲氧基對苯醌產量的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on 2,6-dimethoxy-ρ-benzoquinone yield

由圖4可知，2,6-DMBQ的產量隨著料液比的減少呈先增加后減少的趨勢，當料液比為1∶10時，2,6-DMBQ產量最高為（478.71±5.41）μg/g。料液比是指小麥胚芽與水的質量比，其中水的比例越高，物料被稀釋，因此單位體積發(fā)酵液中的2,6-DMBQ產量越低，而水的比例過低則會導致小麥胚芽粉末因吸水不充分而結塊，不利于酵母利用底物。因此，確定最適料液比為1∶10。

2.3.3 發(fā)酵溫度對2,6-DMBQ產量的影響

圖5 發(fā)酵溫度對2,6-二甲氧基對苯醌產量的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on 2,6-dimethoxy-ρbenzoquinone yield

由圖5可知，2,6-DMBQ產量隨著發(fā)酵溫度的升高先增大后減少，當發(fā)酵溫度為28 ℃時，2,6-DMBQ產量最高為（470.97±8.28）μg/g。酵母菌最適生長溫度通常為28 ℃左右[25]，溫度過高或過低都不利于酵母菌的生長，因此，確定最適發(fā)酵溫度為28 ℃。

2.3.4 發(fā)酵時間對2,6-DMBQ產量的影響

圖6 發(fā)酵時間對2,6-二甲氧基對苯醌產量的影響Fig.6 Effect of fermentation time on 2,6-dimethoxy-ρ-benzoquinone yield

由圖6可知，隨著發(fā)酵時間的延長，2,6-DMBQ產量呈先增加后減少的趨勢，當發(fā)酵36 h時，2,6-DMBQ產量最高為（631.92±16.30）μg/g。分析原因可能是發(fā)酵時間過短，酵母菌無法充分利用底物，而發(fā)酵時間過長，酵母中的醌氧化還原酶會將2,6-DMBQ還原為氫醌[21]。因此，確定最適發(fā)酵時間為36 h。

2.4 低糖面包酵母產2,6-DMBQ發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以2,6-DMBQ產量為評價指標，選取菌種添加量（A）、料液比（B）、發(fā)酵時間（C）、發(fā)酵溫度（D）為考察因素進行4因素3水平的正交試驗，試驗設計及結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 低糖面包酵母產2,6-二甲氧基對苯醌發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗設計與結果Table 2 Design and results of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of low-sugar baker's yeast for 2,6-dimethoxy-ρ-benzoquinone production

續(xù)表

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，6號試驗組合（A2B3C1D2）2,6-DMBQ產量最高，為（728.21±15.74）μg/g，根據(jù)極差分析可知，影響2,6-DMBQ產量的因素主次順序為A＞D＞C＞B，即菌種添加量＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞料液比；最優(yōu)發(fā)酵工藝組合為A2B3C3D2，即菌種添加量1∶6、料液比1∶15、發(fā)酵時間42 h、發(fā)酵溫度28 ℃。由表3可知，菌種添加量對2,6-DMBQ產量的影響顯著（P＜0.05），方差分析結果與極差分析結果一致。在最優(yōu)條件下進行三次平行驗證試驗，2,6-DMBQ的平均產量為（765.23±9.11）μg/g，高于試驗組。因此，確定最優(yōu)發(fā)酵工藝組合為A2B3C3D2，即菌種添加量1∶6、料液比1∶15、發(fā)酵時間42 h、發(fā)酵溫度28 ℃。

3 結論

以2,6-DMBQ產量為評價指標，篩選出最適發(fā)酵菌株為低糖面包酵母，確定超聲處理為最佳原料前處理方式，在此基礎上通過單因素與正交試驗對低糖面包酵母發(fā)酵小麥胚芽產2,6-DMBQ的工藝條件進行優(yōu)化，得到最佳發(fā)酵條件為：菌種添加量1∶6、料液比1∶15、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時間42 h，在此優(yōu)化條件下，2,6-DMBQ平均產量為（765.23±9.11）μg/g。試驗初步探究了小麥胚芽發(fā)酵產2,6-DMBQ的原料前處理方法、發(fā)酵菌株及發(fā)酵工藝，為發(fā)酵小麥胚芽在保健食品、特醫(yī)食品等領域的應用提供了一定的參考依據(jù)。