以腌漬辣椒水作為發(fā)酵劑發(fā)酵干辣椒的微生物篩選

陳 怡，方 俊，覃業(yè)優(yōu)，蔣立文，劉 洋，李 跑，廖盧艷，王蓉蓉，周 輝

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.湖南壇壇香食品科技有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410000）

辣椒含有豐富的維生素C[1]，具有預(yù)防心血管疾病、改善消化功能、減肥和促進(jìn)血液循環(huán)等功效[2-6]。辣椒加工產(chǎn)品豐富，如辣椒醬、剁辣椒、鹽漬辣椒等[7-8]，因其獨(dú)特的發(fā)酵風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而深受人們喜愛。其中，剁辣椒是湖南的特色發(fā)酵食品，也是湘菜的主要調(diào)味品之一，將新鮮辣椒清洗后剁碎，高鹽腌制、儲(chǔ)存，需要時(shí)再經(jīng)脫鹽調(diào)味等加工處理后得到的加工產(chǎn)品即為剁辣椒[9]。剁辣椒生產(chǎn)一般是通過自然發(fā)酵制成，主要的微生物來源辣椒本身，一般發(fā)酵時(shí)間為30 d左右[10]，因此發(fā)酵較為緩慢；此外，剁辣椒加工方式以傳統(tǒng)作坊式加工為主，工器具和環(huán)境中的微生物侵入則可能導(dǎo)致質(zhì)量問題。

在自然發(fā)酵的剁辣椒中，魏斯氏菌、明串珠菌和乳桿菌是主要的細(xì)菌菌屬，其中占細(xì)菌比例最大的是乳桿菌[12]，魏斯氏菌則被認(rèn)為在發(fā)酵前期起主要作用。目前，為了適應(yīng)剁辣椒工業(yè)化轉(zhuǎn)型的需求，針對(duì)剁辣椒的微生物領(lǐng)域研究主要集中在菌種選育、純種發(fā)酵、強(qiáng)化發(fā)酵等方面，謝靚等[13]通過接種耐鹽植物乳桿菌對(duì)不同鹽漬程度發(fā)酵辣椒揮發(fā)性成分的研究發(fā)現(xiàn)，接種耐鹽植物乳桿菌后揮發(fā)物質(zhì)種類、相對(duì)含量明顯增多，有助于鹽漬辣椒香味物質(zhì)形成。李文青等[14]將腸膜明串珠菌、植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和嗜酸乳桿菌按照1∶1∶1∶1的配方強(qiáng)化發(fā)酵辣椒，最終獲得優(yōu)質(zhì)剁辣椒。獲得風(fēng)味良好的發(fā)酵辣椒則與篩選出適宜其發(fā)酵的菌株關(guān)系密切，王雪雅等[15]通過對(duì)10株乳酸菌進(jìn)行產(chǎn)酸性、抑菌性等性能的篩選，研究表明發(fā)酵乳桿菌和食果糖乳桿菌是辣椒發(fā)酵過程中綜合品質(zhì)較好的發(fā)酵優(yōu)良菌株。鄧放明等[16]研究發(fā)現(xiàn)，Lact.chili6和Lact.chili8在低鹽發(fā)酵過程中具有良好的菌群優(yōu)勢(shì)。

剁辣椒生產(chǎn)過程中存在大量的辣椒汁副產(chǎn)物，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，辣椒汁具有獨(dú)特的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[18-20]。目前，大多數(shù)企業(yè)都把鹽漬辣椒汁作為污水排放，這不僅造成大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失，還將對(duì)環(huán)境造成污染。因此，開發(fā)利用辣椒汁，提高其附加價(jià)值的同時(shí)亦能減少污染，具有良好的經(jīng)濟(jì)意義和環(huán)保價(jià)值。本試驗(yàn)選取5株菌株（凝結(jié)芽孢桿菌1.3220、植物乳桿菌1.555、植物乳桿菌1.3919、魯氏接合酵母2.1913、魯氏接合酵母2.371）為原始菌株，通過測(cè)定其產(chǎn)酸能力以及利用全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀對(duì)其在正常環(huán)境和不同鹽度環(huán)境下的生長(zhǎng)情況進(jìn)行檢測(cè)，篩選出的優(yōu)勢(shì)菌株接入鹽漬辣椒汁作為腌制劑的干辣椒進(jìn)行發(fā)酵，旨在篩選出合適的發(fā)酵菌株，設(shè)計(jì)出風(fēng)味優(yōu)良的產(chǎn)品，并為鹽漬辣椒汁的利用提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

16%鹽漬辣椒水、干辣椒：長(zhǎng)沙壇壇香調(diào)料食品有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酚酞：天津市化學(xué)試劑研究所有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。其余試劑均為分析純。

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）1.3220；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）1.555、1.3919；魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）2.1913、2.371：均來源于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 儀器與設(shè)備

CP114 電子天平：奧豪斯儀器有限公司；KQ3200E超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；FE20K pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；20133419 超純水機(jī)：貝徠美生物科技有限公司；RTS生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀：浙江BIOSAN生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株生長(zhǎng)規(guī)律的測(cè)定

表1 菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定詳情Table 1 Growth curve determination details of strains

按照表1測(cè)定條件，從各斜面挑菌接入對(duì)應(yīng)液體培養(yǎng)基進(jìn)行不同條件下的菌株活化后，再次分別接入3%菌液于對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，用RTS生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀每隔30 min測(cè)定一次。

1.3.2 試驗(yàn)菌種產(chǎn)酸性能測(cè)定

根據(jù)表1中菌株活化后，分別取3%菌液接入對(duì)應(yīng)液體培養(yǎng)基，除凝結(jié)芽孢桿菌在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)以外，植物乳桿菌和魯氏接合酵母均在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，共培養(yǎng)48 h，期間每4 h測(cè)一次酸度。酸度的檢測(cè)按照國(guó)標(biāo)GB 5009.239—2016《食品中酸度的測(cè)定》[21]。

1.3.3 試驗(yàn)菌種耐鹽性試驗(yàn)

各試驗(yàn)菌種按表1中的活化方法制作好后，分別取3%的菌液放入鹽度6%、8%、10%的培養(yǎng)基中混勻，以不加鹽作為對(duì)照（P-KB），用RTS生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定生長(zhǎng)規(guī)律和產(chǎn)酸能力。

1.3.4 辣椒發(fā)酵樣品制備工藝流程及操作要點(diǎn)

將鹽度為16%的漬辣椒水用無菌蒸餾水稀釋至鹽度為10%后，作為干辣椒發(fā)酵劑。干辣椒粉碎成為片狀后按3∶1比例將鹽漬辣椒水和干辣椒混合均勻，再按3%接種量接入單一的菌種（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌種，細(xì)胞濃度控制在108CFU/mL采用不接種進(jìn)行對(duì)照）分別裝于滅菌好的5 L容量的白色食品桶中在30 ℃條件下密封發(fā)酵一個(gè)月。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)菌種生長(zhǎng)規(guī)律測(cè)定結(jié)果

凝結(jié)芽孢桿菌1.3220、魯氏結(jié)合酵母（2.371、2.1913）和植物乳桿菌（1.555、1.3919）在相同環(huán)境下的生長(zhǎng)曲線見圖1。由圖1可知，凝結(jié)芽孢桿菌1.3220在5～10 h 期間處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期階段，OD850nm值由0.51升至1.59，在10～60 h 階段處于生長(zhǎng)穩(wěn)定期，在60 h時(shí)OD850nm值達(dá)到整個(gè)生長(zhǎng)過程的最高值2.5，之后則進(jìn)入衰亡期。

圖1 不同菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of different strains

植物乳桿菌1.3919在16～32 h期間處于穩(wěn)定生長(zhǎng)期，在32 h之后，該菌則進(jìn)入衰亡期。1.555的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期處在8～14 h，直至33 h，OD850nm值達(dá)到最高為2.8，之后則進(jìn)入衰亡期。植物乳桿菌1.555較1.3919的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期長(zhǎng)2 h，而穩(wěn)定期短2 h，菌株1.3919的最大OD850nm值要較菌株1.555高0.6，說明植物乳桿菌1.3919在生長(zhǎng)速率和后期發(fā)酵強(qiáng)度上要更優(yōu)于1.555。

魯氏接合酵母菌2.1913的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期是5～26 h，在35 h時(shí)最終達(dá)到最大OD850nm值為2.8，發(fā)酵40 h后，進(jìn)入衰亡期。而2.371的OD850nm值在5～26 h上升速度較快，OD850nm值在50 h時(shí)達(dá)到最大為3.4，60 h后處于衰亡期?？芍獌芍牯斒辖雍辖湍妇?，2.371的OD850nm值比2.1913高0.8，且衰亡時(shí)間比2.1913要晚20 h出現(xiàn)，說明2.371較2.1913可能更適于發(fā)酵。

2.2 試驗(yàn)菌種產(chǎn)酸性能測(cè)定結(jié)果

5株菌生長(zhǎng)期間產(chǎn)酸能力的對(duì)比結(jié)果見圖2。由圖2可知，同類型的菌株產(chǎn)酸能力相似，且植物乳桿菌的產(chǎn)酸能力明顯高于魯氏接合酵母，而凝結(jié)芽孢桿菌1.3220則幾乎不產(chǎn)酸。菌株1.3919在16～24 h的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，隨后上升酸度緩慢并在28 h時(shí)達(dá)到最高值1.98%，其次為菌株1.555在16～32 h期間酸度上升較快，且在32 h時(shí)酸度達(dá)到最大值1.8%。菌株2.1913與2.371的酸度變化趨勢(shì)相似，均在28 h時(shí)達(dá)到最大酸度值，分別為0.76%、0.65%，且明顯弱于植物乳桿菌。而所有菌中產(chǎn)酸能力最弱的則是凝結(jié)芽孢桿菌1.3220，在生長(zhǎng)期間幾乎沒有酸度的變化。同時(shí)，鹽漬辣椒汁的鹽度一般在16%～17%，而最后產(chǎn)品脫鹽后廢棄的辣椒汁鹽度在8%～10%左右，為了進(jìn)一步研究菌株投入發(fā)酵的實(shí)用性，對(duì)所有菌株的耐鹽性進(jìn)行了研究。

圖2 不同菌株生長(zhǎng)期間的酸度變化Fig.2 Changes in acidity during growth of different strains

2.3 試驗(yàn)菌種不同鹽度下生長(zhǎng)情況差異性比較

分別將不同菌株放置于調(diào)配成6%、8%、10%的鹽度的對(duì)應(yīng)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過RTS生長(zhǎng)曲線測(cè)試儀測(cè)試菌株的生長(zhǎng)曲線，以了解其耐鹽能力。

2.3.1 凝結(jié)芽孢桿菌1.3220在不同食鹽濃度中生長(zhǎng)情況比較

菌株1.3220在3種不同鹽度的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線的對(duì)比情況見圖3。由圖3可知，菌株1.3220在不同鹽度的環(huán)境下的生長(zhǎng)趨勢(shì)較為相似，適應(yīng)期均為0～8 h，且對(duì)數(shù)期均從8 h開始。隨著鹽度的增高，對(duì)數(shù)期結(jié)束時(shí)間隨之延長(zhǎng)，6%、8%、10%鹽度下對(duì)數(shù)期時(shí)長(zhǎng)分別為12 h、13 h、14 h。3種鹽度下菌株1.3220的穩(wěn)定期生長(zhǎng)曲線呈相對(duì)平行的狀態(tài)，穩(wěn)定期時(shí)長(zhǎng)分別為31 h、32 h、34 h，此外此菌在10%的鹽度條件下，在22 h時(shí)達(dá)到最大OD850nm值（2.53）。綜上可得，菌株1.3220在3種不同鹽度下的生長(zhǎng)曲線較為相似，各最大OD850nm值差距較小，任何鹽度環(huán)境條件下的生長(zhǎng)較正常情況下均更好，說明其菌密度情況相近，也表明此菌耐鹽能力較強(qiáng)，且生長(zhǎng)較穩(wěn)定。

圖3 凝結(jié)芽孢桿菌1.3220在不同鹽度中生長(zhǎng)曲線變化Fig.3 Growth curve change of Bacillus coagulans 1.3220 in different salinities

2.3.2 植物乳桿菌在不同食鹽濃度中生長(zhǎng)情況比較

圖4 菌株1.3919（a）和1.555（b）在不同鹽度中的生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curves in different salinities of strain 1.3919 (a) and 1.555 (b)

由圖4（a）可知，1.3919隨著生長(zhǎng)環(huán)境的鹽度增加，適應(yīng)期有所延長(zhǎng)，6%鹽度條件下適應(yīng)期為8 h，而10%鹽度條件下則延長(zhǎng)至12 h。6%、8%、10%鹽度環(huán)境下此菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期分別為8～22 h、12～32 h、12～90 h，其中6%、8%鹽度條件下菌的生長(zhǎng)曲線上升速率較快，而鹽度為10%時(shí)則較緩。隨著鹽度的升高，可達(dá)到的OD850nm值也越大，分別為3.85（6%）、5.18（8%）、5.41（10%），均高于圖2（a）中最高OD850nm值（3.4）。由圖4（b）可知，隨著環(huán)境鹽度的增加，植物乳桿菌1.555與1.3919的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期與最大OD850nm值也隨之增加，6%、8%、10%鹽度條件下最大OD850nm值分別為3.18（64 h）、5.19（60 h）、5.42（96 h），均高于圖1的最高OD850nm值（2.8）。

由此可得兩種植物乳桿菌在低鹽環(huán)境下的生長(zhǎng)情況均優(yōu)于其在普通環(huán)境中生長(zhǎng)，說明非常適合利用于鹽漬等發(fā)酵產(chǎn)品。此外，雖然兩種植物乳桿菌在10%鹽度條件下菌密度相差較小，但菌株1.555的適應(yīng)期較菌株1.3919長(zhǎng)5 h，表明1.3919更加耐鹽，在實(shí)際發(fā)酵中能夠更快的適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境。

2.3.2 魯氏接合酵母在不同食鹽濃度中生長(zhǎng)情況比較

圖5 菌株2.1913（a）和2.371（b）在不同鹽度中的生長(zhǎng)曲線Fig.5 Growth curves in different salinities ofstrain 2.1913 (a) and 2.371 (b)

由圖5（a）可知，菌株2.1913在不同鹽度下，適應(yīng)期均為0～20 h左右，但隨著鹽度增加其對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期時(shí)長(zhǎng)也增加，分別為35 h（6%）、40 h（8%）、77 h（10%），其中8%條件下，增長(zhǎng)速率最大，此菌的平穩(wěn)期時(shí)長(zhǎng)較短，平均在10 h左右，隨后開始進(jìn)入衰亡期。3種鹽度下最大OD850nm值相差較大，10%鹽度條件下菌群雖增長(zhǎng)速率稍低，但對(duì)數(shù)增長(zhǎng)時(shí)期最長(zhǎng)，98 h時(shí)OD850nm值為最高（5.4），而6%條件下最低（3.38）。

由圖5（b）可知，菌株2.371的3條生長(zhǎng)曲線差距較大，說明此菌的生長(zhǎng)情況受環(huán)境鹽度影響較大，10%鹽度環(huán)境下在0～70 h期間的OD850nm值均低于其他2種鹽度，但期菌體增長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)至100 h，較6%、8%鹽度情況下分別長(zhǎng)52 h、44 h，且在100 h時(shí)達(dá)到最高OD850nm值（5.4），可知雖然較高的鹽度對(duì)2.371前期的生長(zhǎng)造成了一定程度的抑制，但也延長(zhǎng)了該菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)間。

結(jié)果表明，魯氏接合酵母2.1913、2.371均在10%鹽度中生長(zhǎng)最佳，且2株菌的生長(zhǎng)最旺盛時(shí)的菌密度一致，但菌株2.371的對(duì)數(shù)、穩(wěn)定生長(zhǎng)期都長(zhǎng)于2.1913，說明菌株2.371更適合利用于長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵產(chǎn)品。此外，植物乳桿菌1.3919較1.555更加具有耐鹽性，在實(shí)際發(fā)酵中能夠更快的適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境。而凝結(jié)芽孢桿菌1.3220的耐鹽能力以及產(chǎn)酸能力均要明顯低于其他菌株，因此選用植物乳桿菌1.3919與魯氏接合酵母2.371對(duì)辣椒汁進(jìn)行發(fā)酵。

2.4 菌株1.3919與2.371接入辣椒醬發(fā)酵過程中酸度變化

綜上所述，將單株微生物接入以鹽漬辣椒汁作為發(fā)酵劑來發(fā)酵干辣椒后，通過檢測(cè)其生長(zhǎng)曲線的情況，篩選出兩株優(yōu)良菌株，分別為植物乳桿菌1.3919與魯氏接合酵母2.371。為了解發(fā)酵過程中酸度的變化，則對(duì)菌株2.371菌株1.3919在整個(gè)發(fā)酵過程（30 d）中，每間隔5 d檢測(cè)一次酸度情況，并且與未接菌樣品P-KB進(jìn)行比較，結(jié)果見圖6。

圖6 接入不同菌種后辣椒發(fā)酵過程中的酸度變化Fig.6 Changes of acidity in pepper fermentation process after inserting different strains

由圖6可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，未接菌辣椒汁的酸度也有一定程度的增加，這是因?yàn)槔苯钒l(fā)酵本身所帶有的菌如乳酸桿菌、明串珠菌等具有一定產(chǎn)酸能力[11]；而植物乳桿菌1.3919與魯氏接合酵母2.371發(fā)酵辣椒汁時(shí)酸度均呈先上升后下降的趨勢(shì)，并在15 d達(dá)最高值，分別為1.23%、1.03%。發(fā)酵結(jié)束時(shí)（30 d）植物乳桿菌1.3919菌的酸度為1.23%，較未接菌發(fā)酵辣椒汁（P-KB）高0.78%。說明，植物乳桿菌1.3919產(chǎn)酸能力更強(qiáng)，與前期實(shí)驗(yàn)（圖2）結(jié)果一致。

3 結(jié)論

為篩選出適合接種于鹽漬發(fā)酵辣椒中的菌株，該研究測(cè)定了2株植物乳桿菌（1.3919、1.555）、2株產(chǎn)香魯氏接合酵母菌（2.1913、2.371）和1株凝結(jié)芽孢桿菌1.3220的生長(zhǎng)曲線、產(chǎn)酸能力及耐鹽性，并利用優(yōu)勢(shì)菌株對(duì)剁辣椒副產(chǎn)物辣椒汁進(jìn)行發(fā)酵。結(jié)果表明：在正常環(huán)境下，菌株1.3220對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期最短且最快進(jìn)入平穩(wěn)期，菌株1.3919的生長(zhǎng)繁殖能力最強(qiáng)且最快，OD850nm值在25 h達(dá)到最大為3.4；同類型的菌株產(chǎn)酸能力相似，植物乳桿菌中1.3919產(chǎn)酸能力最強(qiáng)（1.98%），其次為魯氏接合酵母2.1913，而凝結(jié)芽孢桿菌1.3220則幾乎不產(chǎn)酸。此外，5種菌在含鹽條件下的OD850nm值均大于其正常情況，且在10%鹽度條件下生長(zhǎng)情況最佳。說明這5種菌有較好的耐鹽能力，其中魯氏接合酵母2.371及植物乳酸桿菌1.3919最好。因此將上述所選的兩株最佳菌株分別接入以廢棄鹽漬辣椒水為發(fā)酵劑的干辣椒中進(jìn)行發(fā)酵發(fā)酵15 d后，各樣品酸度均達(dá)到最高值，其中以PL-1.3919最高（1.23%），比未接菌的提高了2.28倍，本研究分析了5株常見發(fā)酵菌株的產(chǎn)酸能力和耐鹽能力，并篩選兩株菌株對(duì)辣椒汁進(jìn)行發(fā)酵，為辣椒強(qiáng)化發(fā)酵提供參考，但對(duì)于風(fēng)味物質(zhì)以及有機(jī)酸形成等的影響還有待研究。