建始地區(qū)酸豇豆鹽水細菌多樣性及乳酸菌分離鑒定

向凡舒，黃 怡，陳小艷，侯強川，張振東，郭 壯

（湖北文理學院 食品科學技術學院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053）

泡菜作為我國最具代表性的發(fā)酵蔬菜制品，常以白菜、蘿卜、豇豆和辣椒等新鮮蔬菜為主料，并輔以姜、蒜和花椒等佐料浸于低濃度鹽水中自然發(fā)酵而成[1]。因泡制后口感清脆酸爽，豇豆（Vigna unguiculata（Linn.）Walp）成為了制作泡菜的主要原料。湖北省恩施土家族苗族自治州被譽為“世界硒都”，蘊藏著較為豐富的硒元素，建始縣作為其州轄縣，境內(nèi)少數(shù)民族眾多，飲食文化也獨具地方特色，發(fā)酵食品大體可分為“酸、辣、干、咸”四大類，其中酸豇豆作為酸味的代表在當?shù)鼐用耧嬍持惺遣豢苫蛉钡摹?/p>

雖然泡菜壇的壇沿常用水封以達到隔絕空氣進入的目的，但在取食泡菜的過程中會反復開蓋，從而導致其發(fā)酵過程并不是完全的厭氧過程，加之泡菜原料和制作器皿自身攜帶微生物，因而泡菜鹽水中的微生物類群是較為復雜的[2]。目前，已有眾多關于泡菜中微生物類群研究的報道，在不同食鹽濃度下乳酸菌均為泡菜發(fā)酵過程中的主導菌系[3]；蔡炯等[4]從四川腐敗泡菜中發(fā)現(xiàn)甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌為主要的致腐敗細菌。高通量測序技術的出現(xiàn)為泡菜微生物多樣性的解析提供了新的契機，LIANG H等[5]采用Illumina MiSeq高通量測序技術發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌、弧菌屬、假單胞菌屬和鹽單胞菌屬為青菜泡菜中的優(yōu)勢細菌；CAO J等[6]采用單分子實時測序技術發(fā)現(xiàn)，耐酸乳桿菌和短乳桿菌為四川地區(qū)泡菜鹽水中的優(yōu)勢細菌。使用高通量技術對微生物多樣性進行解析時，常僅對平均相對含量＞1.0%的細菌類群進行重點討論以保證研究結果的可信性，同時亦較關注在不同樣品中均存在的核心微生物類群，并認為其對發(fā)酵食品品質(zhì)的形成具有直接的作用[7]。

本研究在采用高通量測序技術對建始地區(qū)酸豇豆鹽水中細菌多樣性進行解析的基礎上，甄別了其核心細菌類群，同時對鹽水中蘊含的乳酸菌菌種分離鑒定，以期為華中地區(qū)泡菜制品微生物群落結構研究提供數(shù)據(jù)支持，同時為泡菜發(fā)酵劑的制備提供菌株支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸豇豆鹽水：5份酸豇豆鹽水樣品均于湖北省恩施土家族苗族自治州建始縣（E109°32'～110°12'，N30°32'～30°54'）龍坪鄉(xiāng)和高坪鎮(zhèn)采集，編號分別為JD1、JD2、JD3、JD4和JD5。采樣時使用不銹鋼酒提從泡菜壇中舀取約200 mL鹽水裝入潔凈樣品瓶中，帶回實驗室置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基：青島海博生物技術有限公司；Biowest瓊脂糖：上海貝晶生物技術有限公司；Axygen清潔試劑盒：康寧生命科學吳江有限公司；DNeasy mericon Food Kit脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；10×Buffer、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）Mix 和DNA聚合酶：北京全式金生物技術有限公司；引物338F/806R和M13F/M13R：天一輝遠（武漢）生物科技有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）top10：鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所自制。

1.2 儀器與設備

DG250型厭氧工作站：英國DonWhitley公司；VeritiFAST梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國Protein Simple公司；Illumina MiSeq高通量測序平臺：美國Illumina公司；R920機架式服務器：美國DELL公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 宏基因組提取、PCR擴增和高通量測序

參照基因組提取試劑盒中的方法提取酸豇豆鹽水樣品的總脫氧核糖核酸（DNA）。參照文獻[8]中的方法，對細菌16S rRNA V3-V4區(qū)進行PCR擴增。PCR擴增體系：10×Buffer 5 μL，dNTPs Mix 4 μL，正反向引物各0.8 μL，DNA聚合酶0.4 μL，DNA模板10 ng；PCR擴增程序：94 ℃、3 min預變性；95 ℃變性45 s，55 ℃退火30 s，75 ℃延伸45 s，循環(huán)30 次后；72 ℃延伸10 min。將擴增合格的PCR產(chǎn)物寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技公司進行測序。

1.3.2 生物信息學分析

采用QIIME（V1.7.0）平臺對細菌多樣性進行分析評價。參照文獻[8]的方法將測序得到的序列拼接對齊后，按照97%相似度對序列進行劃分構建操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）[9]并進行嵌合體檢查[10]，將含有嵌合體的OTU刪除，選擇余下OTU代表性序列進行同源性比對并注釋其分類學地位[11]，同時對各樣品細菌的α多樣性進行計算分析[12]。

1.3.3 乳酸菌的分離和鑒定

采用倍比稀釋涂布法對酸豇豆鹽水中乳酸菌進行分離。量取10 g酸豇豆鹽水裝入90 mL生理鹽水中稀釋到10-1梯度，置于37 ℃搖床搖30 min，吸取0.5 mL 10-1梯度稀釋液于4.5 mL生理鹽水中，稀釋到10-2梯度，按照此法依次稀釋到10-6梯度，分別吸取10-4、10-5和10-6梯度稀釋液100 μL涂布于含有1.0%CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，挑取含有透明圈的單菌落進行2～3 次劃線純化，選擇過氧化氫酶陰性且革蘭氏陽性的菌株使用30%的甘油保藏于-80 ℃?zhèn)溆肹13]。參照參考文獻[13]中的方法進行乳酸菌菌株基因組DNA提取和16S rRNA基因PCR擴增后，使用清潔試劑盒對擴增成功的PCR產(chǎn)物進行清潔純化，最后進行連接和轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆子送至天一輝遠（武漢）生物科技有限公司測序。

1.3.4 統(tǒng)計分析

利用Origin2017軟件和R軟件（V3.6.2）進行圖的繪制。

2 結果與分析

2.1 測序結果與α多樣性分析

基于MiSeq高通量測序技術，5 個樣品測序共得到了168 808 條有效序列，將序列按97%相似度劃分得到9 036 個OTU，各樣品的測序結果及各分類學地位數(shù)量如表1所示。

表1 樣品的測序結果與分類學地位Table 1 Sequencing results and taxonomic status of samples

由表1可知，樣品JD1、JD2、JD3、JD4和JD5的序列數(shù)分別為23 252、38 713、28 926、33 298和44 619 條，OTU數(shù)量分別為1 625、1 349、1 024、1 318和5 322 個。對每個OTU的代表性序列進行同源性比對后，所有序列被鑒定到15個門，39個綱，67個目，137個科和283個屬，不能被鑒定到門和屬水平的序列數(shù)分別占總序列數(shù)的0.034%和3.96%。由表1亦可知，經(jīng)α多樣性計算，樣品JD5的超1和香農(nóng)指數(shù)均為所有樣品中最高，分別為2 357.25和7.57，而其他樣品的超1指數(shù)均低于1 000，香農(nóng)指數(shù)均低于6。由此可見，不同酸豇豆鹽水中細菌豐度和多樣性存在一定的差異。

2.2 基于門和屬水平的細菌多樣性分析

本研究從門和屬水平上進一步對酸豇豆鹽水中細菌多樣性進行了解析，其中平均相對含量大于1.0%的細菌門如圖1所示。

圖1 平均相對含量＞1.0%的細菌門Fig.1 Bacterial phylum with an average relative content more than 1.0%

由圖1可知，硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）為酸豇豆中平均相對含量＞1.0%的細菌門，分別為84.41%、10.52%、2.63%和1.94%，其中Firmicutes和Pro teobacteria在所有樣品中均存在，而Bacteroidetes和Verrucomicrobia只在樣品JD5中占有較高的比例，分別為11.72%和9.68%。酸豇豆中平均相對含量大于1.0%的細菌屬如圖2所示。

圖2 平均相對含量＞1.0%的細菌屬Fig.2 Bacterial genus with an average relative content more than 1.0%

由圖2可知，酸豇豆鹽水中共有8個平均相對含量大于1.0%的細菌屬，分別為隸屬于Firmicutes的乳酸桿菌屬（Lactobacillus，57.02%）、魏斯氏菌屬（Weissella，9.33%）、葡萄球菌屬（Staphylococcus，7.07%）、片球菌屬（Pediococcus，3.40%）、明串珠菌屬（Leuconostoc，1.94%）和索絲菌屬（Brochothrix，1.07%），隸屬于Proteobacteria的假單胞菌屬（Pseudomonas，4.73%），隸屬于Verrucomicrobia的艾克曼菌屬（Akkermansia，2.54%）。乳酸菌是泡菜發(fā)酵過程中主要的優(yōu)勢菌群[2]，其中短乳桿菌（L.brevis）被認為是影響泡菜感官品質(zhì)的重要菌屬之一[14]，而本研究的酸豇豆鹽水中屬于乳酸菌菌群的Lactobacillus、Weissella、Pediococcus和Leuconostoc的累計平均相對含量達71.69%。然而，在樣品JD1和JD5中分別存在著少量的Staphylococcus和Pseudomonas，有報道指出，隸屬于金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[15]和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginos）[16]的部分“種”對人體均具有條件致病性。由此可見，在對建始地區(qū)酸豇豆鹽水中乳酸菌資源進行收集的同時，通過改善生產(chǎn)環(huán)境從而降低部分樣品中條件致病菌的含量亦具有積極意義。

2.3 基于OTU水平的細菌多樣性分析

在解析門和屬含量的基礎上，本研究進一步從OTU水平上對細菌多樣性進行了分析，各樣品中OTU的分布如圖3所示。

圖3 各樣品中OTU分布情況Fig.3 Distribution of OTUs in each sample

由圖3可知，樣品JD1～JD5中特有的OTU 個數(shù)分別為1 246、892、485、888和4 479個，各包含了5 463、5 539、847、3 186和19 124條序列，分別占各樣品總序列數(shù)的23.50%、14.31%、2.93%、9.57%和42.86%。由此可見，樣品JD5的細菌類群與其他樣品相比可能較為特殊，但每個OTU包含的序列量僅占總測序量的0.009 6%，因而其差異主要體現(xiàn)在若干相對含量極低的種系型上。

若某個OTU在5個酸豇豆鹽水樣品中均存在，則將其定義為核心OTU[17]。本研究共發(fā)現(xiàn)了44個核心OTU，包含了42 307 條序列，累計包含序列數(shù)占總序列數(shù)的25.06%。核心OTU中分別有6個、11個和13個被鑒定為Pseudomonas、Weissella和Lactobacillus，累計平均含量分別為4.61%、4.97%和14.46%；有2個OTU被鑒定為不動菌屬（Acinetobacter），累計平均相對含量為0.08%；各有1個OTU被鑒定為鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）、沙雷氏菌屬（Serratia）、根瘤菌屬（Rhizobium）、果膠桿菌屬（Pectobacterium）、紫色桿菌屬（Janthinobacterium）、腸球菌屬（Enterococcus）、布丘氏菌屬（Buttiauxella）、桿菌屬（Bacillus）和明串珠菌屬（Leuconos toc），但其累計平均相對含量均＜0.1%；有3個OTU不能鑒定到屬水平，累計平均相對含量為0.49%。相對含量＞1.0%的核心OTU如圖4所示。

圖4 平均相對含量＞1.0%的核心OTUFig.4 Core OTUs with average relative content more than 1.0%

由圖4可知，OTU944和OTU6914被鑒定為Lactobacillus，平均相對含量分別為9.40%和1.39%；OTU8518和OTU3519被鑒定為Pseudomonas，平均相對含量分別為3.33%和1.14%；OTU1176被鑒定為Weissella，平均相對含量為4.44%；該結果進一步證實了，建始地區(qū)酸豇豆鹽水中乳酸菌以Lactobacillus和Weissella為主。

2.4 乳酸菌的分離鑒定

由測序結果可知，建始地區(qū)酸豇豆鹽水中蘊含了極為豐富的乳酸菌資源，為進一步明確其中的乳酸菌類群，本研究采用純培養(yǎng)的方式對其中乳酸菌進行了分離鑒定，鑒定結果如表2所示。

表2 乳酸菌鑒定結果Table 2 Identification results of lactic acid bacteria

由表2可知，從5 個樣品中共分離出了13 株乳酸菌，除JD2-1被鑒定為發(fā)酵乳桿菌（L.fermentum）以外，其他12 株乳酸菌均被鑒定為植物乳桿菌（L.plantarum），占分離株的92.3%。由此可見，L.plantarum為建始地區(qū)酸豇豆鹽水中的優(yōu)勢乳酸菌。本研究團隊曾從采集自恩施土家族苗族自治州恩施市的6份酸豇豆鹽水樣品中分離到鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）、L.fermentum和L.plantarum3個種的23株乳酸菌，其中21 株為L.plantarum[18]，相同的原料、相似的地理生態(tài)環(huán)境和制作工藝，可能是導致兩個研究結果相同的根本原因之一。此外，樣品JD5中共分離了4 株L.plantarum，明顯高于其他4 個樣品，這可能與該樣品具有較高的細菌多樣性和豐度有關。雖然MiSeq高通量測序結果表明，Weissella亦為酸豇豆鹽水中的優(yōu)勢乳酸菌，但是采用純培養(yǎng)技術并未獲得其分離株。有研究表明泡菜鹽水群落結構會隨著泡菜的發(fā)酵進程而產(chǎn)生明顯變化，發(fā)酵后期酸耐受性較強的Lactobacillus成為優(yōu)勢菌，而不耐酸的Weissella和Leuconostoc則逐漸消失[19]。MiSeq高通量測序技術是基于細菌16S rRNA的某一個或幾個可變區(qū)間進行序列測定，因而即使微生物在發(fā)酵基質(zhì)中已經(jīng)死亡或失去活性，但只要其基因組DNA沒有降解，則可實現(xiàn)成功擴增[20]，從而導致了本研究現(xiàn)象的發(fā)生。此外，無法分離出Weissella菌株的原因還可能與所使用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件有關，雖然Weissella的分離培養(yǎng)基亦為MRS培養(yǎng)基[21]，但適當調(diào)整其成分構成有可能實現(xiàn)菌株的純培養(yǎng)。

3 結論

建始地區(qū)酸豇豆鹽水中乳酸菌的多樣性較高，乳酸菌群系主要由乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weis sella）、片球菌屬（Pediococcus）和明串珠菌屬（Leuconostoc）。Lactobacillus亦是酸豇豆鹽水中的優(yōu)勢菌群，平均相對含量達到57.02%，且主要以植物乳桿菌（L.plantarum）為主。