咸豐和當陽地區(qū)鲊廣椒細菌群落結(jié)構(gòu)差異性研究

李 娜，張苗苗，舒 娜，張振東，侯強川

（湖北文理學院 食品科學技術(shù)學院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053）

鲊廣椒是我國云南、貴州、四川等地區(qū)的特色傳統(tǒng)發(fā)酵食品，湖北省咸豐市、襄陽市、當陽市和荊門市亦有制作和食用鲊廣椒的習俗[1]。鲊廣椒通常以粉碎的大米面為主要原料，同時以鮮紅辣椒、玉米面和食鹽作為輔料，上述物料混合均勻后裝入壇中，同時塞入稻草并將壇子倒扣于水盆中發(fā)酵而成[2]。由于鲊廣椒的發(fā)酵原料為蔬菜和淀粉質(zhì)食材，發(fā)酵方式為厭氧固態(tài)發(fā)酵，制作方法與酸奶、泡菜及臘肉等發(fā)酵食品均存在較大的差異，形成了其有別于其他發(fā)酵食品的獨特菌群結(jié)構(gòu)[3]。

目前已有關(guān)于鲊廣椒菌群多樣性的研究，王玉榮等[4]采用MiSeq高通量測序技術(shù)對當陽地區(qū)鲊廣椒微生物多樣性進行解析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當陽地區(qū)鲊廣椒優(yōu)勢細菌屬包括乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、片球菌屬（Pediococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、肉胞菌屬（Carnimonas）等，其中乳酸菌的相對含量高達81.75%；雷炎等[5]通過對鲊廣椒中的乳酸菌進行分離鑒定，從中共分離鑒定出植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）10株、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）3株、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）和食品乳桿菌（Lactobacillus alimentarius）各1株，表明植物乳桿菌是鲊廣椒中的優(yōu)勢乳酸菌。然而，不同地區(qū)生產(chǎn)鲊廣椒所使用的各物料比例及制作工藝不盡相同，導致產(chǎn)品風味和菌群結(jié)構(gòu)可能存在較大區(qū)別[6]，鲊廣椒產(chǎn)品細菌群落結(jié)構(gòu)在不同地區(qū)間是否存在差異仍未得到有效回答。

為了揭示不同地區(qū)鲊廣椒產(chǎn)品細菌群落結(jié)構(gòu)特點及彼此間的差異，本研究采集了11份湖北省咸豐市的鲊廣椒樣品，并采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)全面揭示了咸豐地區(qū)鲊廣椒的菌群結(jié)構(gòu)。同時通過結(jié)合王玉榮等[4]采集自當陽地區(qū)的鲊廣椒的測序數(shù)據(jù)，探究兩地區(qū)鲊廣椒菌群結(jié)構(gòu)的異同。本研究將進一步豐富人們對不同地區(qū)鲊廣椒細菌群落結(jié)構(gòu)的認識，同時為后續(xù)鲊廣椒的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

鲊廣椒樣品：本研究11份樣品（XF1～XF11）于2018年10月采集自湖北省咸豐市不同農(nóng)戶家。所有樣品均由紅辣椒和大米發(fā)酵制作，發(fā)酵時間在一個月左右，無酸臭味且無霉斑，色澤微紅，外觀無明顯差異。樣品采集后裝入采樣袋并迅速置于含有冰袋的采樣箱，冷鏈運送回實驗室于24 h內(nèi)完成脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取。

1.1.2 試劑

QIAGENDNeasymericon Food試劑盒：德國QIAGEN公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）緩沖液、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶（5 U/μL）：北京全式金生物技術(shù)有限公司；16S rRNA V3-V4區(qū)引物：武漢天一輝遠生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

CT15RE臺式冷凍離心機：日本HITACHI公司；2100芯片生物分析儀：美國Agilent公司；ND-2000C微量紫外分光光度計：美國Thermo公司；vetiri梯度基因擴增儀：美國AB公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國ProteinSimple公司；MiSeqPE300高通量測序平臺：美國Illumina公司；R930機架式服務器：美國DELL公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA提取、PCR擴增及高通量測序

使用QIAGEN DNeasy maricon Food試劑盒分別提取11份鲊廣椒樣品的宏基因組DNA，以其為模板，使用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對樣品16S rRNA V3-V4區(qū)域進行PCR擴增。PCR擴增體系（20 μL）：10×PCR緩沖液（含Mg2+）4 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，正反向引物（5 μmol/L）各0.8μL，DNA聚合酶0.4μL，DNA模板10ng，雙蒸水（ddH2O）補充至20 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72 ℃末端延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物由上海美吉Illumina MiSeq高通量測序。

1.3.2 細菌多樣性分析

對測序后的序列進行質(zhì)控（目的片段堿基長度＞300bp，引物和標簽序列完全匹配，整條序列質(zhì)量＞20的堿基所占比例＞93%）。測序數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控后，使用QIIME（V1.9.1）平臺進行后續(xù)生物信息學分析[7]，主要分析步驟如下：（1）使用PyNAST校正對齊序列[8]；（2）使用Uclust工具在100%相似度條件下對操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）進行劃分得到非重復的測序序列集；（3）進一步在97%相似度條件下對步驟（2）得到的序列集進行OTU劃分[9]；（4）使用Vsearch去除屬于嵌合體序列的OTU[10]；（5）使用RDP classifier結(jié)合目前最常用的RDP（Relace 11.5）[11]、Greengene（Version 13.8）[12]和Sliva（Version 132）[13]數(shù)據(jù)庫進行同源性比對確定各OTU的分類學地位[14]，使用內(nèi)部腳本整合3個數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果，確定各OTU的最終分類學地位；（6）基于各OTU的代表性序列，使用FastTree軟件構(gòu)建進化樹；（7）標準化各樣品測序序列數(shù)后，在步驟（6）的基礎(chǔ)上進行α多樣性和β多樣性分析。通過繪制稀疏曲線和香農(nóng)（Shannon）多樣性曲線確定本研究各樣品測序深度是否足夠代表樣品中的菌群組成。通過計算相同測序深度下的OTU數(shù)量指數(shù)和Shannon多樣性指數(shù)評估樣品中相應菌群的豐度和多樣性，具體操作為以測序量最低的樣品為基準，各樣品隨機抽取相同的序列數(shù)，并計算上述兩個α多樣性指標，重復該過程1 000次，取各指標1 000次計算得到的平均值作為該樣品最終的α多樣性指數(shù)值。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

使用非參數(shù)的Mann-Whitney秩和檢驗對不同地區(qū)鲊廣椒樣品菌群組成進行差異顯著性檢驗，使用Benjaminiand Hochberg的方法校正多次檢驗的假陽性率[15]。使用基于非加權(quán)（Unweighted）UniFrac距離和加權(quán)（Weighted）UniFrac距離的主坐標分析（principal coordinates analysis，PCoA）直觀展示不同地區(qū)鲊廣椒樣品菌群結(jié)構(gòu)的差異。使用置換多元方差分析（permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA）檢驗地域?qū)噺V椒樣品影響的顯著性。使用Spearman相關(guān)性分析確定鲊廣椒菌群彼此間的相關(guān)性。使用Origin（V8.6）軟件和R語言軟件（V3.5.0）對數(shù)據(jù)進行可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 咸豐地區(qū)鲊廣椒樣品測序結(jié)果及α多樣性分析

對11份采集自湖北省咸豐市的鲊廣椒樣品細菌16S rRNA V3-V4區(qū)基因序列進行Illumina MiSeq高通量測序，共得到383 028條高質(zhì)量序列，平均每份樣品測序量為34 821條序列（表1）。為了反映當前測序量是否足夠代表樣品中的菌群組成，本研究使用稀疏曲線和Shannon多樣性曲線對各樣品測序量進行了評估，結(jié)果見圖1。由圖1a可知，隨著測序量增加，稀疏曲線斜率下降，但始終未達到水平狀態(tài)，但由圖1b可知，隨著測序量增加，所有樣品的Shannon多樣性曲線均已趨向水平，表明隨著測序量增加雖然有可能發(fā)現(xiàn)新的種，但當前測序量足以揭示出樣品中主要菌群的組成[16]。

圖1 各鲊廣椒樣品細菌菌群的稀疏曲線（a）和Shannon曲線（b）Fig.1 Rarefaction (a) and Shannon (b) curves of bacterial community of Zhaguangjiao samples

α多樣性指標可以反映不同樣品中菌群的豐度和多樣性差異。本研究使用獲得的OTU數(shù)量指數(shù)反映菌群的豐度，選取Shannon指數(shù)反映樣品中菌群的多樣性，結(jié)果見表1。

表1 鲊廣椒樣品的測序序列信息和α多樣性指數(shù)Table 1 Sequence information and α-diversity index of Zhaguangjiao samples

由表1統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，湖北省咸豐市的鲊廣椒樣品OTU數(shù)量指數(shù)和Shannon多樣性指數(shù)分別為1 156.0±102.6和6.8±2.0，整體擁有較高的細菌豐度和多樣性，但不同樣本間存在一定的差異，這種差異性可能與不同農(nóng)戶生產(chǎn)過程的衛(wèi)生條件不同、制作材料的差異等有很大關(guān)系。

2.2 咸豐地區(qū)鲊廣椒細菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

咸豐地區(qū)鲊廣椒樣品中共注釋得到25個細菌門和451個細菌屬，本研究將平均相對含量＞1%的細菌門和細菌屬分別定義為優(yōu)勢細菌門和優(yōu)勢細菌屬。其中優(yōu)勢細菌門包括硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），平均相對含量分別為85.33%、10.91%和2.49%。優(yōu)勢細菌屬共有6個，結(jié)果見圖2。

圖2 咸豐地區(qū)鲊廣椒屬水平主要細菌的相對豐度Fig.2 Relative abundances of major bacteria in Zhaguangjiao from Xianfeng region at the genus level

由圖2可知，咸豐地區(qū)鲊廣椒樣品中優(yōu)勢細菌屬分別為乳酸桿菌（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、鹽單胞菌屬（Halomonas）和明串珠菌屬（Leuconostoc），平均相對含量分別為76.63%、4.25%、3.87%、2.02%、1.74%、1.36%。由圖2亦可知，乳酸桿菌是所有鲊廣椒樣品中的主要菌屬，而不同的樣品間仍表現(xiàn)出了一定的菌群差異，如棒狀桿菌屬和鹽單胞菌屬主要在樣品XF7中有分布，而假單胞菌屬僅在樣品XF9中相對含量較高。值得注意的是，本研究分別在91%、81%和73%的樣本中檢測到了腸桿菌屬（Enterobacter）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）和芽孢桿菌屬（Bacillus），并且在64%的樣本中同時檢測到了上述三種菌屬。

乳酸桿菌屬和片球菌屬是咸豐地區(qū)鲊廣椒中的主要優(yōu)勢菌屬，這與王玉榮等[4]基于當陽地區(qū)采集的鲊廣椒樣品得到的結(jié)論一致。乳酸桿菌屬和片球菌屬均屬于乳酸菌的范疇，乳酸菌具有高效的乳酸產(chǎn)生能力和細菌素（如乳酸鏈球菌肽）分泌能力[17]，其本身也具有較高的酸耐受能力，同時可以抑制多種類型有害微生物的生長，乳酸菌的上述特性對于保證發(fā)酵食品的安全性亦具有十分重要的作用[18]，同時這可能也是兩者在鲊廣椒中相對含量最高的原因。此外，乳酸桿菌屬的細菌長期以來被授予普遍認為是安全的（generally recognized as safe，GRAS）地位[19]，該菌屬的眾多菌株在目前的益生菌市場廣泛應用。然而，目前產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中使用的乳酸桿菌屬的菌株多分離篩選自傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品和發(fā)酵蔬菜制品等[20]，而鲊廣椒作為我國華中及西南地區(qū)流行的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，一直未得到充分的關(guān)注和研究，加之其發(fā)酵基質(zhì)和制作工藝與乳制品和發(fā)酵蔬菜等均存在較大差異，導致其所蘊含的潛在益生菌資源未得到很好的挖掘。因此，在后續(xù)研究中進一步加強對鲊廣椒中乳酸菌的分離保藏和篩選將會對發(fā)酵食品的產(chǎn)業(yè)化推動具有重要意義。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)在部分樣品中假單胞菌屬占有較高的比例，該菌屬是引起皮膚、腸道、上下呼吸道和直腸周圍區(qū)域的感染的常見菌屬[21]。同時在大量樣本中檢測到了腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和芽孢桿菌屬的存在，這三類菌屬均屬于致病共棲菌的范疇[22-23]，對人體健康構(gòu)成潛在的威脅。表明鲊廣椒家庭作坊相對開放的制作環(huán)境引入了一些環(huán)境中的潛在有害菌，進一步優(yōu)化鲊廣椒的制作工藝尤為重要。

2.3 鲊廣椒中細菌核心菌群組成分析

為了揭示對鲊廣椒發(fā)酵可能起到關(guān)鍵作用的菌群，本研究將在咸豐地區(qū)和當陽地區(qū)[4]90%以上樣品中均出現(xiàn)的OTU定義為鲊廣椒的核心OTU，鲊廣椒中核心OTU的分布結(jié)果見表2。

表2 鲊廣椒核心OTU的分布Table 2 Distribution of core OTU in Zhaguangjiao

由表2可知，共有18個OTU滿足該閾值條件，其中有2個OTU注釋結(jié)果分別為片球菌屬和腸桿菌屬（Enterobacter），其余核心OTU注釋結(jié)果均為乳酸桿菌屬，再次表明乳酸桿菌屬和片球菌屬的細菌在鲊廣椒發(fā)酵中可能起到了主導作用。而腸桿菌屬是一種機會性的產(chǎn)生內(nèi)毒素的病原體[24]，有研究報道該菌屬占患有糖尿病、高血壓和其他嚴重代謝惡化的病態(tài)肥胖者腸道細菌的35%[25]。該菌屬在鲊廣椒產(chǎn)品中廣泛存在，提示人們需要進一步加強對鲊廣椒生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制。

2.4 咸豐與當陽地區(qū)鲊廣椒樣品細菌菌群結(jié)構(gòu)比較分析

本研究基于加權(quán)和非加權(quán)UniFrac距離對咸豐和當陽地區(qū)收集的鲊廣椒樣品進行了主坐標分析，結(jié)果見圖3。

圖3 基于加權(quán)UniFrac距離（a）和非加權(quán)UniFrac距離（b）咸豐與當陽地區(qū)鲊廣椒樣品細菌菌群結(jié)構(gòu)主坐標分析結(jié)果Fig.3 Results of principal coordinate analysis of bacterial community structure in Xianfeng and Dangyang based on weighted UniFrac distance (a) and unweighted UniFrac distance (b)

由圖3可知，僅在基于非加權(quán)UniFrac距離進行主坐標分析時兩個地區(qū)的樣品存在明顯的聚類趨勢。此外，基于非加權(quán)UniFrac距離的置換多元方差分析的結(jié)果亦顯示兩個地區(qū)的鲊廣椒樣品菌群結(jié)構(gòu)存在極顯著差異（P＜0.01）。結(jié)果表明，咸豐和當陽地區(qū)生產(chǎn)的鲊廣椒樣品中高豐度的菌群組成較為相似，而一些低豐度的菌群存在顯著差異。

通過進一步使用OTU數(shù)量指數(shù)和Shannon指數(shù)對咸豐和當陽地區(qū)采集的鲊廣椒樣品進行菌群豐度和多樣性評估，結(jié)果見圖4。

圖4 咸豐和當陽地區(qū)鲊廣椒樣品細菌α多樣性比較Fig.4 Comparison of α-diversity of bacteria in Zhaguangjiao samples from Xianfeng and Dangyang

由圖4可知，咸豐地區(qū)鲊廣椒樣品中菌群的OTU數(shù)量指數(shù)和Shannon指數(shù)均極顯著高于當陽地區(qū)樣品（P＜0.01），表明咸豐地區(qū)鲊廣椒樣品中細菌的豐度和多樣性極顯著高于當陽地區(qū)（P＜0.01）。為了揭示咸豐和當陽地區(qū)鲊廣椒樣品菌群的具體差異，本研究進一步使用Mann-Whitney秩和檢驗在屬水平對兩個地區(qū)鲊廣椒樣品的細菌菌群組成進行差異顯著性檢驗，發(fā)現(xiàn)在兩個地區(qū)共有35個細菌屬的相對含量存在顯著差異（P＜0.05）。其中銅綠假單胞菌屬（Pseudomonas）在咸豐地區(qū)樣品中的相對含量（3.87%）顯著高于當陽地區(qū)樣品（0.38%）（P＜0.01），而紅球菌屬（Rhodococcus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）則在當陽地區(qū)相對含量（0.30%、0.16%）顯著高于咸豐地區(qū)（0.01%、0.06%）（P＜0.01），其他存在顯著差異的菌屬在樣品中的相對含量均比較低（平均相對含量＜0.1%），這與主坐標分析結(jié)果相一致。然而，導致眾多低豐度菌屬在兩地區(qū)鲊廣椒樣品中存在顯著差異的原因尚不可知，本研究推測可能與兩個地區(qū)居民在鲊廣椒制作過程中使用的物料比例、制作工藝和加工環(huán)境存在一定差異有關(guān)[26]。

2.5 鲊廣椒樣品細菌菌群關(guān)聯(lián)性分析

為了進一步揭示鲊廣椒菌群彼此間共生或拮抗關(guān)系，本研究使用Spearman相關(guān)性分析在屬水平檢驗了鲊廣椒樣品細菌之間的相關(guān)關(guān)系，其中具有顯著相關(guān)性的菌群見圖5。

由圖5可知，乳桿菌屬與片球菌屬、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、棒狀桿菌屬和鹽單胞菌屬具有極顯著負相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）；葡萄球菌屬與鹽單胞菌屬、腸桿菌屬和棒狀桿菌屬之間具有顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。此外，魏斯氏菌屬（Weissella）與明串珠菌屬和腸桿菌屬之間亦存在顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。鲊廣椒的生產(chǎn)需多種微生物菌群協(xié)調(diào)作用，對這些微生物菌群相互作用關(guān)系的解析將有利于定向控制發(fā)酵過程中微生物種類，提高生產(chǎn)效率，改善鲊廣椒產(chǎn)品風味和保障產(chǎn)品質(zhì)量安全。

圖5 鲊廣椒樣品細菌屬之間的相關(guān)性Fig.5 Correlation of bacteria at genus level in Zhaguangjiao

3 結(jié)論

本研究采集了11份湖北省咸豐市的鲊廣椒樣品，在對咸豐地區(qū)鲊廣椒細菌群落結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)之上，通過結(jié)合之前研究報道的當陽地區(qū)鲊廣椒樣品分析數(shù)據(jù)，探究上述兩地區(qū)鲊廣椒菌群結(jié)構(gòu)的異同。結(jié)果表明，咸豐地區(qū)鲊廣椒樣品優(yōu)勢細菌門為硬壁菌門、變形菌門和放線菌門，平均相對含量分別為85.33%、10.91%和2.49%；優(yōu)勢細菌屬分別為乳酸桿菌、片球菌屬、假單胞菌屬、棒狀桿菌屬、鹽單胞菌屬和明串珠菌屬，平均相對含量分別為76.63%、4.25%、3.87%、2.02%、1.74%、1.36%。咸豐地區(qū)鲊廣椒中細菌的豐度和多樣性均極顯著高于當陽地區(qū)（P＜0.01），一些低豐度的菌群在兩個地區(qū)的鲊廣椒樣品中存在顯著差異（P＜0.05）。乳桿菌屬和片球菌屬是兩個地區(qū)鲊廣椒中的主要優(yōu)勢菌屬和核心菌屬，同時鲊廣椒中廣泛分布有腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和芽孢桿菌屬等致病共棲菌，進一步加強鲊廣椒生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制是提升鲊廣椒品質(zhì)和質(zhì)量安全亟待解決的問題。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，鲊廣椒發(fā)酵菌群彼此間存在密切的相關(guān)關(guān)系，表明鲊廣椒的生產(chǎn)需要多種微生物的協(xié)調(diào)作用。