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    組胺對(duì)新生大鼠離體脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元下行激活的影響

    2020-11-04 03:55:40黃媛媛汪萌芽
    關(guān)鍵詞:去極化興奮性離體

    汪 燕,黃媛媛,汪萌芽

    (皖南醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞電生理研究室,安徽 蕪湖 241002)

    組胺是一種由組氨酸合成的生物活性胺化合物,不僅存在于肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等非神經(jīng)元細(xì)胞,也作為神經(jīng)遞質(zhì)存在于神經(jīng)元中[1]。中樞組胺能神經(jīng)元起源于下丘腦的結(jié)節(jié)乳頭狀核(TMN)內(nèi),向廣泛區(qū)域發(fā)出投射,尤其是大腦皮質(zhì)、杏仁核、基底節(jié)區(qū)、海馬、丘腦和脊髓等[2-3]。組胺能系統(tǒng)參與了睡眠-覺(jué)醒周期、能量和內(nèi)分泌穩(wěn)態(tài)等機(jī)體多種生理功能的調(diào)節(jié),并參與突觸可塑性以及學(xué)習(xí)記憶和運(yùn)動(dòng)控制等[3-6]。組胺存在4種受體亞型,即H1~H4受體,又以H1~H3在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中明顯表達(dá)。不同之處在于,中樞組胺的H1和H2受體為突觸后受體,而組胺H3受體為突觸前自身異種受體[3,5]。

    組胺一直被認(rèn)為是全腦活動(dòng)的調(diào)節(jié)劑。小腦[7]、基底節(jié)區(qū)[8]、前庭核[9]和紅核[10]等多個(gè)大腦皮層下有大量組胺受體分布,它們通過(guò)軸突曲張?bào)w釋放,再經(jīng)促代謝型受體發(fā)揮作用。早在20世紀(jì)80年代末到90年代初,一系列的神經(jīng)解剖學(xué)研究就報(bào)道了下丘腦-脊髓組胺能直接投射到哺乳動(dòng)物脊髓的背角和腹角。免疫染色和示蹤研究也證明了從下丘腦后部到脊髓腹側(cè)有直接的組胺能投射[11-12]。從大鼠胚胎第14天起,脊髓腹角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在頸、胸和腰髓段就表現(xiàn)出組胺免疫反應(yīng)活性[12]。盡管組胺對(duì)脊髓感覺(jué)神經(jīng)元和痛覺(jué)的作用受到了廣泛的關(guān)注[13-16],對(duì)脊髓MN的激活作用也有涉及[17],但罕見(jiàn)關(guān)于組胺對(duì)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(motoneuron,MN)下行激活的影響的報(bào)道。本文主要通過(guò)脊髓切片的制備和細(xì)胞內(nèi)記錄方法,觀察組胺對(duì)離體脊髓同側(cè)腹外側(cè)索(ipsilateral ventrolateral funiculus,iVLF)電刺激誘發(fā)的MN興奮性突觸后電位(excitatory postsynaptic potential,EPSP)的影響,以明確組胺對(duì)脊髓下行激活調(diào)控運(yùn)動(dòng)輸出的可能機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與脊髓切片制備 按本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道方法[18],新生SD大鼠(8~14日齡)購(gòu)自南京江寧青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)[許可證號(hào) SCXK(蘇)2017-0001]。經(jīng)乙醚麻醉后,分離出腰骶膨大處脊髓段,用振蕩切片機(jī)(Vibratome 1500,Technical Products International Inc.,USA)制備400~500 μm脊髓橫切片4~6片,室溫下置于含95%O2和5%CO2混合氣體飽和的人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)中備用。從脊髓游離到切片制備完成需控制在15 min以?xún)?nèi)。ACSF配方(mmol/L):CaCl22.4,NaCl 127.0,KCl 1.9,KH2PO41.2,MgSO4·7H2O 1.3,Glucose·H2O 10.0,NaHCO326.0。

    1.2 細(xì)胞內(nèi)紀(jì)錄 脊髓切片于室溫下孵育40~60 min后,用膠頭滴管吸取置于自制的全浸式記錄浴槽內(nèi),用上、下兩個(gè)絲網(wǎng)相夾固定,經(jīng)恒流泵(HL-2,上海精科實(shí)業(yè)有限公司)持續(xù)灌流用混合氣體飽和的ACSF,灌流液的溫度應(yīng)控制在(28±3)℃。取充填3mol/L乙酸鉀,尖端阻抗為60~160 ΜΩ用含纖維微電極毛坯(FSG12,Dagan Co.,USA)拉制的微電極,在雙目立體顯微鏡(北京泰克儀器有限公司)下對(duì)脊髓腹角MN區(qū)進(jìn)行細(xì)胞穿刺。將一根同芯雙極刺激電極(Frederick Haer & Co.,USA)置于同側(cè)腹根用于電刺激進(jìn)行逆行激活鑒定,另一根刺激電極置于iVLF施加測(cè)試刺激(單脈沖,波寬0.1~0.3 ms,10次/分鐘,10~100 V)以誘發(fā)突觸反應(yīng)。記錄到的電信號(hào)經(jīng)Axoclamp 900A微電極放大器(Axon Instrument,Inc.,USA)處理后,通過(guò)Digidata 1440A轉(zhuǎn)換接口(Axon Instrument,Inc.,USA)輸入計(jì)算機(jī),用Clampex 10.2軟件(Axon Instrument,Inc.,USA)采樣、記錄和貯存。

    1.3 藥物 組胺(C5H9N3,Sigma,USA),用去離子純水配成10 mmol/L的母液,在-20℃冰箱中冷凍備用,使用前用標(biāo)準(zhǔn)ACSF將母液稀釋到所需濃度灌流給藥。

    2 結(jié)果

    2.1 MN及其iVLF-EPSP的基本電生理參數(shù) 在常規(guī)電流鉗模式下,選用靜息電位(resting potential,RP)負(fù)于-60 mV,且動(dòng)作電位(action potential,AP)有超射的,能穩(wěn)定記錄15 min以上的狀態(tài)良好的細(xì)胞,進(jìn)行逆行激活鑒定,若記錄到“全或無(wú)”特性的逆行 AP或碰撞試驗(yàn)呈陽(yáng)性,即可鑒定為MN,繼續(xù)用于實(shí)驗(yàn)。在54個(gè)穩(wěn)定記錄的MN,檢測(cè)其RP為(-64.71±4.23)mV,AP幅值為(75.68±7.44)mV、超射值為(11.77±5.65)mV(表1)。以同芯雙極電極刺激 iVLF,閾強(qiáng)度刺激在54個(gè)MN記錄到iVLF-EPSP,其幅值為(4.60±2.88)mV,時(shí)程為(52.87±29.32)ms,曲線(xiàn)下面積為(98.77±90.03)mV·ms(表2)。

    表1 離體MN基本電生理參數(shù)

    表2 離體MN閾刺激誘發(fā)iVLF-EPSPs的電生理參數(shù)

    2.2 組胺對(duì)脊髓MN電學(xué)性質(zhì)的影響 對(duì)14個(gè)MN給予100 μmol/L組胺灌流3~6 min,在11個(gè)細(xì)胞觀察到膜去極化反應(yīng)(P<0.01,表3),并伴隨膜電阻增大的趨勢(shì)。同時(shí)組胺還能延長(zhǎng)峰電位的半幅時(shí)程、上升時(shí)間、下降時(shí)間(P<0.01),降低峰電位的上升和下降斜率(P<0.01)。MN在組胺灌流后,AP的發(fā)放頻率明顯增加(圖1)。在低Ca2+/高M(jìn)g2+ACSF(Ca2+0.24 mmol/L,Mg2+13.0 mmol/L)條件下,組胺在同一MN誘發(fā)的去極化反應(yīng)無(wú)明顯改變(圖2)。

    該MN的RP為-70 mV,Control:用藥前記錄的RP和AP,Histamine:灌流組胺(100 μmol/L)5 min后記錄到同一MN的AP,Low Ca2+/High Mg2+:灌流低Ca2+/高M(jìn)g2+ACSF配置的組胺(100 μmol/L)后該MN的膜電位和AP,Wash:標(biāo)準(zhǔn)ACSF沖洗5 min后該MN的AP。

    表3 組胺(100 μmol/L)對(duì)離體MN膜電學(xué)性質(zhì)的影響

    以一個(gè)RP為-75 mV的MN為例。Control:初始的AP;Histamine:分別灌流組胺(100 μmol/L)3、6 min后所記錄到的同一MN的AP;Wash:ACSF沖洗5 min后該MN的AP。

    2.3 組胺增加MN自發(fā)放電 上述發(fā)生去極化的11個(gè)MN中,有5個(gè)MN除了出現(xiàn)如圖1的放電頻率增加,同時(shí)還增加自發(fā)放電。我們記錄到的初始AP幅度為(69.57±4.80)mV,放電頻率為(1.40±1.14)Hz;持續(xù)灌流組胺(100 μmol/L,2 mL/min)10 min后,AP幅度為(60.89±5.75)mV(P<0.05),放電頻率增加至(15.60±6.19)Hz(P<0.01),更換ACSF沖洗5 min后,自發(fā)放電頻率可恢復(fù)(圖3)。

    Control:一個(gè)RP為-75 mV的典型MN的自發(fā)放電;Histamin:組胺(100 μmol/L)灌流5 min后,同一MN的自發(fā)放電;Wash:ACSF沖洗5 min后該MN的自發(fā)放電。

    2.4 組胺對(duì)iVLF-EPSP的影響 在11個(gè)記錄到iVLF-EPSP的MN,灌流組胺(100 μmol/L)3~6 min,典型記錄見(jiàn)圖4A,測(cè)得的參數(shù)分析結(jié)果見(jiàn)圖4B~D,表明組胺(100 μmol/L)能增加iVLF-EPSP的幅度(P<0.05),增大曲線(xiàn)下面積(P<0.05),延長(zhǎng)時(shí)程(P<0.05),且作用具有可逆性。

    A:典型記錄圖顯示組胺(100 μmol/L)對(duì)脊髓MN的iVLF-EPSP有增大作用;B~D:組胺對(duì)MN的iVLF-EPSP幅度、曲線(xiàn)下面積及時(shí)程影響的統(tǒng)計(jì)圖。配對(duì)t檢驗(yàn):*P<0.05。

    3 討論

    脊髓MN的活動(dòng)依賴(lài)多通路調(diào)控,其中腦干發(fā)出的下行通路能直接或間接地(通過(guò)中間神經(jīng)元)影響脊髓 MN運(yùn)動(dòng)控制的輸出[19]。既往的離體MN的研究中,常常采用電刺激腹外側(cè)索激活下行纖維的方法,誘發(fā)MN的興奮性突觸后反應(yīng)。汪萌芽等的研究顯示,腹外側(cè)索誘導(dǎo)的EPSP主要由non-NMDA型興奮性氨基酸受體介導(dǎo),是以Na+、K+通透性增加為主的復(fù)合型離子機(jī)制[20]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用此技術(shù),觀察到組胺引起新生大鼠脊髓切片MN發(fā)生去極化反應(yīng),且該作用不受低Ca2+/高M(jìn)g2+ACSF(Ca2+0.24 mmol/L,Mg2+13.0 mmol/L)灌流的影響;組胺灌流離體MN后引起iVLF-EPSP幅度升高、曲線(xiàn)下面積增大、半幅時(shí)程延長(zhǎng)(P<0.05),該反應(yīng)具有可逆性;灌流100μmol/L組胺可呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴(lài)性增強(qiáng),表現(xiàn)為iVLF-EPSP的幅度、自發(fā)放電頻率均增加。翟祥薇與Liu等曾報(bào)道組胺通過(guò)激活與H1受體偶聯(lián)的Na+-Ca2+交換器和與H2受體耦聯(lián)的超極化激活環(huán)核苷酸門(mén)控陽(yáng)離子通道,共同介導(dǎo)了組胺能對(duì)這兩類(lèi)中間投射神經(jīng)元的去極化作用[21-22],故我們推測(cè)組胺通過(guò)突觸后H1和H2受體間接引起MN的去極化反應(yīng)來(lái)促進(jìn)突觸傳遞,通過(guò)增強(qiáng)大鼠脊髓下行激活來(lái)調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)控制的輸出。這一點(diǎn)與Wu等人關(guān)于組胺通過(guò)激活組胺H1和H2受體增強(qiáng)MN的興奮性的報(bào)道一致[17]。而組胺灌流后自發(fā)放電增多以及其對(duì)I-V曲線(xiàn)的影響中,可見(jiàn)組胺不但能誘導(dǎo)MN興奮,也能導(dǎo)致MN興奮性增高,推測(cè)組胺可增強(qiáng)MN對(duì)大腦皮層及腦干下傳的運(yùn)動(dòng)指令輸入的反應(yīng)。另外,在Wu等人的研究中提到[17],組胺對(duì)膜電阻的影響有顯著增加和降低兩種形式,我們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),組胺對(duì)膜電阻的作用是一個(gè)先降低后增加的過(guò)程,這可能與組胺的作用是受多重受體介導(dǎo)有關(guān),起初的膜電阻降低可能是與組胺H2受體結(jié)合的Ih通道激活和/或抑制鈣激活鉀通道導(dǎo)致,后期的膜電阻增高則考慮與H1受體結(jié)合的鉀離子通道被阻斷,鈣激活的陽(yáng)離子通道和/或Na+-Ca2+交換器被激活密切相關(guān)[22-24]。

    組胺誘導(dǎo)的MN興奮和興奮性增加,可增強(qiáng)MN對(duì)大腦皮層和腦干的運(yùn)動(dòng)指令以及脊髓局部回路的感覺(jué)及其它輸入反應(yīng)。因此,通過(guò)興奮MN,下丘腦-脊髓組胺能神經(jīng)可能直接調(diào)節(jié)最終的運(yùn)動(dòng)輸出,并積極而持續(xù)地調(diào)節(jié)脊髓的運(yùn)動(dòng)執(zhí)行和運(yùn)動(dòng)反射。越來(lái)越多的證據(jù)表明,脊髓損傷甚或腦卒中所導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)單位放電模式的改變可能是調(diào)節(jié)系統(tǒng)和興奮性控制系統(tǒng)的中斷造成的,這對(duì)脊髓側(cè)索硬化癥等運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退變病亦非常重要[25]。因此,神經(jīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng),包括中樞組胺能系統(tǒng),有可能為治療脊髓運(yùn)動(dòng)障礙提供新的、高效的治療策略。另一方面,由于下丘腦是脊髓MN組胺能神經(jīng)支配的來(lái)源,是非軀體(內(nèi)臟)功能的高級(jí)調(diào)控中心,可以推測(cè)下丘腦組織胺能投射對(duì)MN的直接興奮性調(diào)節(jié)可能有助于機(jī)體產(chǎn)生適當(dāng)?shù)能|體運(yùn)動(dòng)反射,以適應(yīng)非軀體活動(dòng)的變化。這種軀體-非軀體的整合可能在動(dòng)物面臨來(lái)自?xún)?nèi)外環(huán)境的挑戰(zhàn)時(shí),在產(chǎn)生協(xié)調(diào)的行為反應(yīng)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[26]。

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