響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取浙貝母蒽醌工藝及其抑菌活性研究

侯敏娜，侯少平，劉艷紅，王 珊，許海燕

(陜西國際商貿(mào)學(xué)院，陜西 咸陽 712046)

浙貝母(FritillariathunbergiiMiq.)是多年生草本植物，鱗莖是藥用部位[1,2]，產(chǎn)于四川、云南、浙江、陜西、甘肅等地[3,4]。該植物具有清熱化痰、散結(jié)解毒之功效，可用于治療風(fēng)熱咳嗽、肺癰喉痹、瘰疬、瘡瘍腫毒等癥?，F(xiàn)代藥理研究證實，浙貝母具有鎮(zhèn)咳、祛痰、松弛氣管平滑肌、鎮(zhèn)痛抗炎、降壓、抑菌、活血化瘀、抗?jié)?、止瀉等作用[5-9]。

在2020年全國抗擊新冠肺炎的中西藥結(jié)合治療中，浙貝母是中藥配方中組成藥味之一，其為止咳良藥，含有多種化學(xué)成分，活性成分以生物堿和皂苷類為主。多數(shù)植物藥中蒽醌類成分具有很好的抑菌活性[10.11]，然未見浙貝母藥材在這方面的報道。因此，本研究嘗試從浙貝母中提取蒽醌類成分，并對其抑菌活性進行檢測研究，以期為浙貝母藥材抑菌活性的相關(guān)研究及其臨床合理、有效利用提供可靠的參考依據(jù)。

目前，蒽醌類成分的提取方法常有：溶劑提取法、超聲提取法、微波提取法和CO2超臨界流體萃取法等，本研究利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取浙貝母蒽醌工藝。超聲提取法具有提取溫度低、效率高、省溶劑、時間短等獨特優(yōu)勢，是從中藥提取有效成分的一種高效、節(jié)能、環(huán)保式的現(xiàn)代技術(shù)手段。響應(yīng)面設(shè)計法(Response Surface Methodology，簡稱RSM)，是利用合理的試驗設(shè)計方案并通過實驗得到的數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的數(shù)學(xué)函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法。響應(yīng)面法與正交設(shè)計法、均勻設(shè)計法相比較，既保留了正交設(shè)計和均勻設(shè)計實驗次數(shù)少的優(yōu)點，又具有直觀、高效、方便及可在較短時間內(nèi)對所選試驗各參數(shù)進行全面研究等特點[12-14]。所以本研究采用方法所獲得的實驗結(jié)果具有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

浙貝母(購于陜西康宇制藥有限公司，經(jīng)我院中藥教研室雷國蓮教授鑒定，為百合科植物浙貝母的干燥鱗莖)；1，8-二羥基蒽醌對照品(中國藥品生物制品鑒定所，批號：110829-9702)；金黃色葡萄球菌(南京樂診生物技術(shù)有限公司)；大腸桿菌(南京樂診生物技術(shù)有限公司)；無水乙醇(天津市河紅區(qū)紅巖試劑廠)等，其余試劑均為市售分析純。

TU-1810紫外-可見分光光度計(上海長城制造有限公司)；KQ5200DE超聲波提取器(江蘇省昆山市淀山湖鎮(zhèn))；TDL-60B高速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠制造)；SHZ-D循環(huán)水式多用真空泵(李倉區(qū)恒通興達儀器儀表商行)；KQ-A玻璃儀器氣流烘干器(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制 準確稱取于105 ℃干燥至恒重的1，8-二羥基蒽醌對照品2.65 mg，置于25 mL容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度，即可制得標準溶液(濃度為0.106 mg/mL)。

分別精密移取標準品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別置于25 mL量瓶中，加入1%的醋酸鎂顯色劑 2.5 mL，搖勻，使其充分混合，顯色30 min，用95%乙醇定容至刻度，搖勻。用紫外-可見分光光度計在波長506 nm處測其吸光度。以吸光度A(y)為縱坐標，濃度C(x)為橫坐標，繪制標準曲線。結(jié)果表明，在0.0008～0.0048 mg/mL范圍內(nèi)，濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系(圖1)。

圖1 1，8-二羥基蒽醌標準曲線

1.2.2 提取方法 準確稱取經(jīng)干燥、粉碎后的浙貝母粉末2.000 g，置于具塞錐形瓶中，加入乙醇適量，超聲提取，過濾，濾液離心(3000 r/min，15 min)。按 1.2.1方法處理樣品后，用95%乙醇定容至刻度，搖勻。在波長506 nm處測其吸光度[15-18]，根據(jù)以下公式計算浙貝母蒽醌的提取率(Y)。

Y=C×V×D×10-3/M×100%

(1)

其中：C代表溶液濃度(mg/mL)；V代表溶液的體積(mL)；D代表稀釋倍數(shù)；M代表浙貝母粉末的質(zhì)量(g)。

1.2.3 單因素考察[19-21]

1.2.3.1 提取時間對浙貝母蒽醌提取率的影響 按照1.2.2 浙貝母蒽醌提取方法，當超聲功率設(shè)定為100 W，超聲溫度恒定65 ℃，料液比為1∶30 g/mL時，考察提取時間(10、15、20、25、30 min)對浙貝母蒽醌提取率(Y)的影響。

12.3.2 乙醇濃度對浙貝母蒽醌提取率的影響 按照1.2.2浙貝母蒽醌提取方法，在超聲功率設(shè)定為100 W，超聲溫度恒定65 ℃，料液比為1∶30 g/mL，提取時間為20 min時，考察乙醇濃度(70%、75%、80%、85%、90%)對浙貝母蒽醌提取率(Y)的影響。

1.2.3.3 料液比對浙貝母蒽醌提取率的影響 按照1.2.2浙貝母蒽醌提取方法，在超聲功率設(shè)定為100 W，超聲溫度恒定65 ℃，料液比為1∶30 g/mL，提取時間為20 min，乙醇濃度為75%時，考察料液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g/mL)對浙貝母蒽醌提取率(Y)的影響。

1.2.4 響應(yīng)面實驗優(yōu)化 根據(jù)Box-Benhnken中心組合的方法，結(jié)合單因素試驗結(jié)果，以浙貝母總蒽醌的提取率為響應(yīng)值(Y)，選取提取時間(A)、料液比(B)、乙醇濃度(C)3個對提取率影響較大的因素，各因素分別用-1、0和1表示低、中、高3個水平，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面分析實驗(表1)。

表1 實驗因素水平設(shè)計

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 使用Design- Expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

1.2.6 浙貝母蒽醌抑菌活性研究[22-25]

1.2.6.1 樣品制備 將從浙貝母中提取得到的蒽醌分別配制成濃度為2.5、5.0、7.5、10.0 mg/mL的4個梯度溶液，用濾膜過濾后，置冰箱中冷藏備用。

1.2.6.2 牛津杯法抑菌實驗 將已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基加熱至完全融化，倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿15 mL，待凝固。將菌懸液用移液槍移入培養(yǎng)皿中，涂布于培養(yǎng)基上，將牛津杯垂直放置于培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)皿中均勻放置4個牛津杯，向牛津杯中加入上述樣品溶液，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，測量抑菌圈直徑。以無機鹽NaCl為陰性對照，抑菌圈愈大，說明抑菌效果愈好。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果與分析

2.1.1 提取時間對浙貝母蒽醌提取率的影響 由圖2可知，當提取時間為20 min時，浙貝母蒽醌的提取率達最高。當提取時間小于20 min時，浙貝母蒽醌提取率呈明顯上升趨勢；當提取時間超過20 min時，其呈直線下降趨勢。可能是由于當提取時間較長時，浙貝母蒽醌分子在超聲波的剪切作用下發(fā)生破壞或分解，從而影響了提取率。故提取時間為20 min時浙貝母蒽醌的提取率最佳。

圖2 提取時間對浙貝母蒽醌提取率的影響

2.1.2 乙醇濃度對浙貝母蒽醌提取率的影響 乙醇濃度對浙貝母蒽醌提取率的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，當乙醇濃度為75%時，浙貝母蒽醌的提取率達最高。當乙醇濃度低于75%時，浙貝母蒽醌提取率呈明顯上升趨勢；當乙醇濃度超過了75%時，其呈現(xiàn)較為明顯的下降趨勢。原因可能是當乙醇濃度增大時，其會使一小部分脂溶性雜質(zhì)如葉綠素、油脂等溶出，阻礙了蒽醌的溶出，使其提取率降低。故乙醇濃度為75%時浙貝母蒽醌的提取率最佳。

圖3 乙醇濃度對浙貝母蒽醌提取率的影響

2.1.3 料液比對浙貝母蒽醌提取率的影響 料液比對浙貝母蒽醌提取率的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知，當料液比小于1∶25 g/mL時，隨著溶劑用量增加浙貝母蒽醌提取率呈直線上升趨勢；當料液比為1∶25 g/mL時，提取率達最高；但隨著溶劑用量進一步增加提取率略顯降低趨勢?？赡苁怯捎谝婚_始植物細胞膜內(nèi)外濃度差比較大，有利于其溶出。但當料液比為1∶25 g/mL時植物細胞中該成分已經(jīng)被較完全地提取出來，故再增加溶劑用量其提取量也無明顯提高，而且還會使生產(chǎn)成本升高。故料液比為1∶25 g/mL時浙貝母蒽醌提取率最佳。

圖4 料液比對浙貝母蒽醌提取率的影響

2.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化實驗結(jié)果與分析

以浙貝母蒽醌提取率(Y)為考察指標，在單因素實驗基礎(chǔ)上，對提取時間(A)、料液比(B)和乙醇濃度(C)這3個因素，按照響應(yīng)面法的三因素三水平，設(shè)計17組實驗，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析實驗設(shè)計及實驗結(jié)果

根據(jù)表1 ，以浙貝母蒽醌提取率(Y)為響應(yīng)值，用Design-Expert 8.0.6進行多元回歸擬合分析，可得到提取條件與浙貝母蒽醌提取率(Y)之間的二次多元回歸方程：

Y=0.16-3.250E-003A+3.500E-003B-3.000E-003C-7.750E-003AB+4.250E-003BC-7.425E-003A2-8.925E-003B2-0.018C2

(2)

式(2)中，Y代表浙貝母蒽醌的提取率，A代表提取時間，B代表料液比，C代表乙醇濃度。

該回歸模型的方差分析結(jié)果見表3。由表3可知，該模型具有極顯著性(P<0.001)，失擬項P=0.7459>0.05，不顯著，說明該二次方程模型很顯著，可以利用該模型確定最佳提取工藝條件?；貧w項AB、A2、B2、C2對浙貝母蒽醌提取率均達到了極顯著水平。進一步說明了建立的回歸方程有較好的擬合性，也證明了實驗設(shè)計的可行性。同時由F值可以看出，對浙貝母蒽醌提取率的影響順序依次為料液比(B)>提取時間(A)>乙醇濃度(C)。

表3 方差分析結(jié)果

應(yīng)用minitab 軟件，得到響應(yīng)面分析圖(圖5～圖7)。由圖5可以看出提取時間和乙醇濃度的曲面都有一定坡度，表明了兩者對浙貝母蒽醌的提取率均具有影響，其中乙醇濃度的影響程度較提取時間的影響程度要更大些。等高線圖趨于橢圓形，但不明顯，表明提取時間和乙醇濃度這兩個因素的交互項對浙貝母蒽醌的提取率沒有顯著影響?？纱_定最佳參數(shù)范圍為：提取時間20～25 min，乙醇濃度74%～76%。在此區(qū)間內(nèi)浙貝母蒽醌的提取率最大。

圖5 提取時間和乙醇濃度的響應(yīng)面圖和等高線圖

由圖6可以看出，料液比與乙醇濃度的曲面均有坡度，而且料液比的曲面坡度更陡，表示料液比的二次項對浙貝母蒽醌的提取率有明顯的影響，而乙醇濃度對其的影響較前者略小?？梢源_定兩因素最佳水平參數(shù)范圍：料液比1∶20～1∶26 g/mL，乙醇濃度74%～76%。在此范圍中浙貝母蒽醌的提取率最大。

圖6 料液比和乙醇濃度的響應(yīng)面圖和等高線圖

由圖7可以看出，料液比與提取時間的曲面均有坡度，而且提取時間的曲面坡度更陡，表示提取時間的二次項對浙貝母蒽醌提取率有明顯的影響，而料液比對其的影響較前者略小?？梢源_定兩因素最佳水平參數(shù)范圍：料液比1∶20～1∶26 g/mL，提取時間20～25 min。在此范圍中浙貝母蒽醌的提取率最大。

圖7 料液比和提取時間的響應(yīng)面圖和等高線圖

根據(jù)響應(yīng)曲面得出的最佳工藝是：料液比1∶22.47 g/mL、提取時間22.24 min、乙醇濃度74.08%。在此提取條件下，浙貝母蒽醌提取率的預(yù)測值為0.1635%。

2.3 工藝驗證

為了驗證響應(yīng)面模擬得出的最佳工藝條件的可行性，對模擬得出的數(shù)據(jù)進行放大驗證，結(jié)合實際的可操作性將提取工藝各參數(shù)調(diào)整為：料液比為1∶22 g/mL、提取時間22 min、乙醇濃度為74%。進行3批驗證試驗(表4)，測得平均總蒽醌提取率為0.1587%，與預(yù)測值0.1635%接近，表明模型擬合度良好，具有較好的可行性。故可應(yīng)用于浙貝母蒽醌的提取。

表4 工藝驗證結(jié)果

2.4 浙貝母蒽醌的抑菌活性實驗結(jié)果

浙貝母蒽醌的抑菌活性實驗結(jié)果見表5，從表5可以明顯看出，該蒽醌對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有一定的抑制作用，隨著浙貝母蒽醌濃度的增加，抑菌圈直徑呈增大趨勢。當浙貝母蒽醌溶液濃度為10 mg/mL時，對這兩種菌的抑制效果最好；其中對金黃色葡萄球菌的抑制效果最顯著，其抑菌圈直徑為5.18±0.6 mm，大腸桿菌抑菌圈直徑為3.06±0.3 mm。

表5 浙貝母蒽醌對不同菌種的抑菌圈直徑 mm

3 結(jié)論

本研究采用響應(yīng)面數(shù)學(xué)模型優(yōu)化了超聲-輔助提取浙貝母蒽醌的工藝，最終得到的最佳工藝條件為：料液比1∶22 g/mL、提取時間22 min、乙醇濃度74%，此時的實際提取率為0.1587%，與預(yù)測值0.1635%相差甚小，說明利用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型準確、可靠、可行，可用于浙貝母蒽醌的提取工藝。同時通過牛津杯法抑菌試驗發(fā)現(xiàn)，浙貝母蒽醌對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有一定的抑菌作用，且隨著浙貝母蒽醌濃度的增加，抑菌圈直徑呈增大趨勢；當浙貝母蒽醌溶液濃度為10 mg/mL時，對這兩種菌的抑制效果最好。這與含蒽醌植物的抗菌、抗炎、瀉下、抗癌等藥理活性及貝母的清熱化痰、散結(jié)解毒的功效相吻合。通過本課題的研究，為浙貝母蒽醌抗菌機理的研究奠定了一定的實驗基礎(chǔ)，同時也為該藥材在各領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供了參考依據(jù)。