免疫球蛋白基因重排在B細胞非霍奇金淋巴瘤診斷中的意義*

盧峰，羅志剛，李甫罡，王鋼，陳濤，郭曉蘭

(1.簡陽市人民醫(yī)院中心實驗室，四川簡陽 641400；2.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，四川南充 637100)

B細胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)是非霍奇金淋巴瘤中常見的一種類型(約占80%)[1]。B-NHL的組織類型多樣，臨床上通過形態(tài)學結合免疫組化染色可確診70%～80%的病例，但仍有20%～30%的患者與反應性淋巴組織增殖疾病(例如淋巴結炎、傳染性單核細胞增多癥等)難以區(qū)別[2]。免疫球蛋白(Ig)的克隆性基因重排是B-NHL的特征之一，利用分子生物學技術檢測基因重排是臨床上檢測B-NHL的主要手段之一。研究證實，使用BIOMED-2引物系統(tǒng)檢測病理組織和骨髓樣本Ig基因重排具有重要的臨床應用價值[2-3]。目前，國內外關于外周血標本Ig基因重排的相關研究主要集中于濾泡淋巴瘤(FL)及部分T細胞淋巴瘤[4-5]，而將外周血與骨髓標本Ig基因重排進行比較的報道較少。本研究擬采用多重聚合酶鏈反應(mPCR)技術及標準化BIOMED-2引物系統(tǒng)對B-NHL患者骨髓或(和)外周血標本進行Ig基因重排檢測，比較其陽性率，以期探討外周血標本檢測Ig基因重排的可行性。

1 材料和方法

1.1研究對象 收集2017年1月至2018年12月于簡陽市人民醫(yī)院血液科及腫瘤科就診的103例B-NHL患者作為研究對象，其中男58例，女45例，年齡27～78歲，中位年齡61.2歲。均根據2016年世界衛(wèi)生組織《造血和淋巴組織腫瘤分類》明確診斷[6]。排除標準：治療期間出院、病歷資料不全或者伴有其他系統(tǒng)惡性腫瘤的患者。按組織學分類分為慢性淋巴細胞白血病(CLL)/小B細胞淋巴瘤(SLL)59例，套細胞淋巴瘤(MCL)9例，彌漫大B細胞性淋巴瘤(DLBCL)14例，濾泡淋巴瘤(FL)5例，邊緣區(qū)淋巴瘤(MZL)4例，淋巴漿細胞淋巴瘤(LPL)7例，其余5例B-NHL類型未定。另收集同期就診的20例臨床明確診斷為反應性淋巴組織增生(包括淋巴結炎、傳染性單核細胞增多癥等)的患者作為對照組，其中男12例，女8例，年齡15～62歲，中位年齡52.3歲。本研究經醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準(批準文號：簡醫(yī)倫理2017041)，各研究對象均知情同意。

1.2主要試劑和儀器 Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒、PCR Mix、DNA Marker、BIOMED-2引物系統(tǒng)(上海生工公司)。C1000 Touch PCR儀、電泳儀、ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，Nano Drop超微量分光光度計(美國Thermo Scientific公司)。

1.3標本采集 收集兩組患者入院時空腹外周血標本3～5 mL，置于EDTA-K2抗凝管中待測；骨髓標本采集由臨床醫(yī)師行髂后上棘穿刺抽取3～5 mL，置于肝素抗凝管中待測。樣本均置于4 ℃保存，24 h內完成DNA提取。

1.4方法

1.4.1DNA提取 按照Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒說明書提取骨髓及外周血標本DNA。采用Nano Drop超微量分光光度計檢測提取DNA樣本的純度與濃度，取吸光度(A260/280 nm)值在1.8～2.0的DNA樣本用于后續(xù)實驗，對不純或濃度不足的樣本重新提取DNA。DNA樣本短期置于-20 ℃保存，或置于-80 ℃長期凍存。

1.4.2引物設計及PCR反應 引物設計根據BIOMED-2引物系統(tǒng)[3]，將48條引物組合在7組引物管中，具體分組見表1。PCR總反應體系為25 μL，包括PCR Mix 12.5 μL，DNA模板0.5 μL，100 μmol/L引物0.5 μL,ddH2O補足體積。PCR循環(huán)參數：95 ℃預變性7 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取上述擴增產物10 μL，行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，4S Green Plus核酸染料染色，并于ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)上掃描并分析。結果判讀：PCR擴增產物經電泳后，電泳條帶清晰，邊緣整齊，寬度<1 mm,條帶在預期的范圍以內判斷為克隆性重排。如果PCR擴增產物出現片狀彌散性條帶，且片段大小不在引物設計所預期的范圍以內，為非克隆性重排。

表1 BIOMED-2引物系統(tǒng)

1.5統(tǒng)計學分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行分析，定性數據以率表示，各組之間比較采用卡方檢驗。以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1B-NHL患者Ig基因單克隆重排檢測 CLL/SLL與非CLL/SLL型B-NHL患者兩組間IgH、IgK、IgH和IgK聯(lián)合檢測的陽性率差異均具有統(tǒng)計學意義(χ2=6.62，P=0.01；χ2=8.26，P=0.004；χ2=21.6，P=0.00)。MCL與DLBCL型的IgH、IgK、IgH和IgK聯(lián)合檢測的陽性率差異亦有統(tǒng)計學意義(χ2=6.66，P=0.01；χ2=4.41，P=0.036；χ2=6.63，P=0.01)。MCL與FL、MZL、LPL型比較，IgH和IgK重排陽性率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。20例反應性淋巴組織增生患者均未檢出Ig重排。見圖1、表2。

表2 B-NHL患者Ig基因單克隆重排檢測[n(%)]

2.2骨髓和外周血標本Ig基因重排檢測 70例患者外周血Ig基因重排陽性32例(45.7%)，骨髓Ig基因重排檢測陽性38例(54.3%)，兩者差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.03，P=0.31)。其中CLL/SLL患者外周血與骨髓標本Ig基因重排陽性率差異無統(tǒng)計學意義(69.2% vs 80.8%，χ2=0.92，P=0.34)；非CLL/SLL的B-NHL患者外周血與骨髓標本Ig基因重排陽性率差異亦無統(tǒng)計學意義(31.8% vs 38.6%，χ2=0.45，P=0.50)。見表3。

表3 骨髓和外周血標本Ig基因重排檢測[n(%)]

3 討論

B淋巴細胞免疫球蛋白基因由可變區(qū)(variable region,V)、多變區(qū)(diversity region,D)、鉸鏈區(qū)(joining region,J)、恒定區(qū)(constant region,C)組成。在B淋巴細胞分化發(fā)育過程中，VDJ區(qū)染色體分布呈不連續(xù)狀態(tài)，片段之間可有單核苷酸隨機插入的過程。通常情況下正常人體淋巴細胞和反應性淋巴組織增生病變中Ig重排方式多樣(即為多克隆重排)。而B-NHL患者體內腫瘤細胞起源于同一克隆，表現為Ig單克隆重排。因此Ig克隆性重排檢測可用于B-NHL的輔助診斷[7-8]。

本研究發(fā)現，103例B-NHL患者中IgH基因重排陽性率為41.7%，IgK基因重排陽性率為50.5%，IgH和IgK聯(lián)合檢出率為64.1%。這與肖穎等[9]報道的陽性率(65.7%)一致，但低于張巖等[2]報道的聯(lián)合檢測率(81.6%)?？紤]到B-NHL的異質性，不同亞型的B-NHL增殖、播散特點不同，除CLL/SLL以外的B-NHL早期病變可能局限于淋巴結，到進展期或者晚期才出現結外或骨髓浸潤，導致骨髓Ig基因重排檢測陽性率存在差異。本研究中20例反應性淋巴組織增生患者未檢測出Ig基因重排，說明BIOMED-2引物系統(tǒng)檢測Ig基因重排具有較高的特異性。本研究還發(fā)現，生發(fā)中心來源的DLBCL其IgH單克隆重排陽性率低于生發(fā)中心以前來源的MCL的IgH單克隆重排，差異具有統(tǒng)計學意義。同時也觀察到FL、MZL、LPL等生發(fā)中心以后來源的B-NHL其IgH單克隆重排陽性率低于MCL，但差異無統(tǒng)計學意義。研究表明，生發(fā)中心V區(qū)基因體細胞高頻突變(somatic hypermutation，SHM)可降低引物的退火效率，影響引物與基因的有效結合，導致PCR擴增失敗，而來源于生發(fā)中心以前的MCL幾乎不會受到SHM影響[10]。本研究中MCL患者IgH單克隆重排陽性率明顯高于DLBCL、FL、MZL、LPL，分析原因可能是由于MCL患者的腫瘤細胞來源于生發(fā)中心以前，并未與抗原接觸，較少受SHM影響，因此檢出率較高。此外，BIOMED-2引物系統(tǒng)同時包含了IgH和IgK檢測，IgK很少受體細胞超突變的影響[11]，在一定程度上可以彌補SHM帶來的缺陷。兩者聯(lián)合檢測可以提高Ig基因重排的檢出率。

以創(chuàng)傷性更小的血液標本代替骨髓標本Ig基因重排檢測是現今研究的目標。研究表明，淋巴組織中的正常淋巴細胞有歸巢現象，淋巴結組織中的淋巴細胞可以不斷地進入血液循環(huán)中，然后又回到淋巴組織，因此，B-NHL腫瘤細胞與正常細胞一樣，亦具有歸巢現象[12-13]。另有研究發(fā)現，治療后的B-NHL患者骨髓中殘留的腫瘤細胞并不高于外周血，這可能是由于使用造血刺激因子后造血干細胞被動員到外周血，而腫瘤細胞也隨之進入外周血循環(huán)[14]。本研究中骨髓與外周血標本Ig基因重排的陽性率差異無統(tǒng)計學意義，表明外周血標本檢測Ig基因重排在B-NHL診斷中的價值與骨髓標本檢測Ig基因重排基本相當。臨床上有些病例高度懷疑淋巴瘤，但又沒有淺表的病理組織可取或者患者不愿意做診斷性穿刺而導致診斷困難, 此時骨髓和外周血標本Ig基因重排檢測可以為淋巴瘤的診斷提供重要的依據。而外周血標本Ig基因重排檢測相對無創(chuàng)、方便取材、患者痛苦少、便于隨訪，易于臨床推廣，可以作為骨髓標本檢測Ig基因重排的有效補充。

綜上所述，應用BIOMED-2引物系統(tǒng)檢測Ig基因重排可作為B淋巴細胞來源的良、惡性疾病的輔助診斷手段。外周血與骨髓標本Ig基因重排檢測在B-NHL臨床診斷中的價值相當。但是本研究未能將病理組織樣本納入檢測范圍，對外周血、骨髓標本基因重排陽性吻合度存在的差異也沒有進一步深入探討，后續(xù)研究會將病理組織和穿刺液標本納入探討范圍，分析不同樣本來源的Ig基因重排檢測結果的差異。