LncRNA MEG3在膿毒癥患者血漿中的表達(dá)及其臨床意義

袁超，金娜

(1.湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，武漢 430015；2.武漢市江夏區(qū)第一人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，武漢 430000)

膿毒癥是由于宿主對感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙，其主要臨床特征為全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄長度超過200個核苷酸的長鏈RNA分子，可以調(diào)節(jié)相應(yīng)靶基因的表達(dá)，影響疾病的發(fā)生、發(fā)展。有學(xué)者認(rèn)為，某些LncRNA是膿毒癥的良好診斷標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者循環(huán)LncRNANEAT1與疾病風(fēng)險增加、嚴(yán)重程度升高、預(yù)后不良以及促炎細(xì)胞因子的高表達(dá)密切相關(guān)[2]。LncRNA 母系表達(dá)基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)是一種抑癌基因。Chen等[3]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNAMEG3在膿毒癥中呈高表達(dá)，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，下調(diào)LncRNAMEG3表達(dá)可抑制腎臟和心臟等主要器官的細(xì)胞凋亡，LncRNAMEG3可能成為膿毒癥的潛在治療靶點(diǎn)。此外，LncRNAMEG3還被證實(shí)與感染和炎癥相關(guān)疾病的進(jìn)展有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，被分枝桿菌感染后，巨噬細(xì)胞中LncRNAMEG3的表達(dá)水平降低，并可通過自噬消除分枝桿菌[4-5]。但目前關(guān)于LncRNAMEG3對膿毒癥患者預(yù)后等方面的研究較少。因此，本研究旨在檢測LncRNAMEG3在膿毒癥患者血漿中的表達(dá)水平，分析其臨床意義，以期為膿毒癥患者的診治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對象 選擇2017年1月至2019年10月湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科收治的膿毒癥患者65例，男29例，女36例，年齡(49.8±12.3)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合2016年由美國重癥醫(yī)學(xué)會(SCCM)與歐洲重癥醫(yī)學(xué)會(ESICM)聯(lián)合發(fā)布的《膿毒癥3.0定義及診斷標(biāo)準(zhǔn)》[6]；(2)年齡≥18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有各類腫瘤、慢性腎臟疾病、燒傷、急性胰腺炎、72 h內(nèi)有創(chuàng)傷或手術(shù)經(jīng)歷的患者。本研究共納入一般膿毒癥18例，嚴(yán)重膿毒癥24例，膿毒癥休克23例；急性生理學(xué)及慢性健康狀況(APACHE Ⅱ)評分為輕度16例，中度30例，重度19例；無凝血功能障礙25例，凝血功能障礙糾正16例，凝血功能障礙未糾正24例。另選擇同期于我院就診的體檢健康者65例作為健康人對照組，男31例，女34例，年齡(50.2±12.5)歲。兩組研究對象性別、年齡間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究通過湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查批準(zhǔn)[No. 2016倫審科字第(52)號]，患者均知情同意。

1.2主要儀器及試劑 CFX96實(shí)時熒光定量PCR儀、Mini-Protean3電泳分析儀、GELDOC 2000凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，Multiskan FC全自動酶聯(lián)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，Allegra X-64R高速臺式冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司)。Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3標(biāo)本采集 采集各患者入院時(體檢健康者于體檢時采集)的空腹靜脈血3 mL，4 ℃、950×g離心15 min，收集血漿，15 130×g離心15 min，去除細(xì)胞碎片，置于-80 ℃保存。

1.4RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 采用Trizol試劑提取血漿標(biāo)本中的總RNA，用Multiskan FC全自動酶聯(lián)儀檢測RNA的濃度和純度，取吸光度 (A260/280 nm)為1.8～2.0的標(biāo)本,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，置-20 ℃保存。

1.5實(shí)時熒光定量PCR LncRNAMEG3及內(nèi)參GAPDH的引物序列根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]，由上海生工公司采用Primerbank引物設(shè)計軟件(http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)設(shè)計并合成，引物序列見表1。熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括: SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA 2 μL，DEPC水補(bǔ)足至20 μL。實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù):95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 55 s；共35個循環(huán)。使用Step OneTM軟件在60 ℃時采集熒光信號并進(jìn)行熔解曲線分析，LncRNAMEG3的表達(dá)水平以2-ΔΔCt法計算，公式: ΔΔCt=[(實(shí)驗(yàn)組Ct目的基因-實(shí)驗(yàn)組Ct內(nèi)參基因)- (對照組Ct目的基因-對照組Ct內(nèi)參基因)]。每組設(shè)3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 實(shí)時熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1各組LncRNAMEG3表達(dá)水平比較結(jié)果 LncRNAMEG3在膿毒癥患者血漿中的表達(dá)水平(3.94±0.71)較健康人對照組(2.50±0.15)顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=16.064，P<0.05)；進(jìn)一步進(jìn)行亞組間比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膿毒癥休克患者LncRNAMEG3的表達(dá)水平較嚴(yán)重膿毒癥及一般膿毒癥均明顯升高(P<0.05)；APACHE Ⅱ評分為重度患者較中度及輕度患者顯著升高(P<0.05)；凝血功能障礙未糾正患者較凝血功能障礙糾正患者及無凝血功能障礙患者顯著升高(P<0.05)。見表2。

2.2LncRNAMEG3表達(dá)水平與膿毒癥患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 LncRNAMEG3表達(dá)水平與膿毒癥患者病情嚴(yán)重程度、APACHE Ⅱ評分以及凝血功能障礙是否糾正的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2分別為13.819、15.186和9.639，P均<0.01)；而與患者年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2 各組患者血漿中LncRNA MEG3的表達(dá)水平

2.3LncRNAMEG3表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier分析結(jié)果表明，LncRNAMEG3高表達(dá)膿毒癥患者的30 d存活率為26.47%(9/34)，顯著低于低表達(dá)者的70.97%(22/31)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.953，P<0.05)。見圖1。

表3 LncRNA MEG3表達(dá)水平與膿毒癥患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

作為固有免疫反應(yīng)的一個組成部分，LncRNA可以抑制和促進(jìn)炎癥信號。LncRNA在自身免疫病中可導(dǎo)致基因的異常表達(dá)，參與炎癥性疾病的進(jìn)展[8]。LncRNAMEG3具有良好的腫瘤標(biāo)志物功能。然而，目前國內(nèi)關(guān)于LncRNAMEG3與膿毒癥患者病理因素及預(yù)后情況的關(guān)系研究少見。本研究結(jié)果表明，LncRNAMEG3在膿毒癥患者血漿中的表達(dá)水平較健康人對照組顯著升高，與Na等[9]研究結(jié)果相似；其研究還發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者血漿LncRNAMEG3高表達(dá)可增強(qiáng)炎性細(xì)胞因子的誘導(dǎo)和釋放，從而導(dǎo)致組織的損傷和壞死，加速器官損傷、多器官功能衰竭，并能通過與miR-21相互作用，成為膿毒癥發(fā)生、發(fā)展的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。此外，本研究與Chen等[3]的研究結(jié)果均提示LncRNAMEG3可作為膿毒癥患者預(yù)后預(yù)測的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。

本研究回顧性分析了LncRNAMEG3表達(dá)水平與膿毒癥患者臨床病理參數(shù)及30 d存活率的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LncRNAMEG3高表達(dá)與患者病情嚴(yán)重程度、APACHE Ⅱ評分以及凝血功能障礙是否糾正等差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義；進(jìn)一步進(jìn)行亞組間比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膿毒癥休克患者、APACHE Ⅱ評分為重度患者或凝血功能障礙未糾正患者血漿 LncRNAMEG3的表達(dá)水平均顯著升高，提示LncRNAMEG3高表達(dá)可能與膿毒癥的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。此外，LncRNAMEG3高表達(dá)膿毒癥患者30 d存活率較低表達(dá)患者顯著降低，提示LncRNAMEG3高表達(dá)與膿毒癥患者高死亡率存在密切關(guān)系。以上結(jié)果表明，LncRNAMEG3可作為一個潛在的治療靶點(diǎn)，通過下調(diào)LncRNAMEG3的表達(dá)以發(fā)揮臨床治療膿毒癥的功效。

細(xì)胞凋亡是膿毒癥和嚴(yán)重?fù)p傷(如燒傷、大手術(shù)和創(chuàng)傷)的常見過程，這一過程發(fā)生在損傷的早期。細(xì)胞凋亡調(diào)控是危重病患者治療研究的一個新熱點(diǎn)[10-11]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重膿毒癥和感染性休克患者細(xì)胞凋亡和壞死細(xì)胞增加[12]。Lu等[13]研究表明，LncRNAMEG3在癌癥及敗血癥患者中分別表現(xiàn)為下調(diào)與上調(diào)的表達(dá)模式，但其在兩者中均發(fā)揮了促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用；LncRNAMEG3可能與p53相互作用，發(fā)揮調(diào)節(jié)癌細(xì)胞凋亡的功能。提示LncRNAMEG3可能通過類似的機(jī)制參與了膿毒癥的發(fā)病，但具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，LncRNAMEG3與患者病情及預(yù)后關(guān)系密切，可能作為膿毒癥臨床治療靶點(diǎn)與預(yù)后預(yù)測因子，為膿毒癥的臨床防治提供新思路。然而，本研究尚存在以下不足之處：(1)病例數(shù)較少，后期需擴(kuò)大樣本量對結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證及補(bǔ)充；(2)缺乏相關(guān)機(jī)制作用研究，今后擬通過動物及體外實(shí)驗(yàn)深入探討LncRNAMEG3在膿毒癥中的作用機(jī)制。