長非編碼RNA ARID2-IR在慢性腎小球腎炎中的作用及機(jī)制研究

張愛萍 賀芳 佘開儒

435200 黃石，湖北省陽新縣人民醫(yī)院腎內(nèi)科(張愛萍)，感染科(佘開儒)；430022 武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管外科(賀芳)

慢性腎小球腎炎(chronic glomerulonephritis，CGN)是原發(fā)性腎小球疾病的最常見形式，以蛋白尿、血尿、高血壓和水腫為基本臨床表現(xiàn)，病情緩慢，最終發(fā)展為慢性腎衰竭，其分子機(jī)制尚不清楚[1-2]。大量證據(jù)表明，CGN是由遺傳和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因素引起的多因素疾病[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，與復(fù)雜疾病有關(guān)的大多數(shù)單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphisms，SNPs)位于人類基因組的非編碼區(qū)，例如長非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)，但其作用機(jī)制尚不清楚。

LncRNA是一種轉(zhuǎn)錄本超過200個(gè)核苷酸，沒有蛋白編碼功能的特殊RNA分子[5-6]。盡管這些分子最初被認(rèn)為是沒有生物學(xué)相關(guān)性的轉(zhuǎn)錄“垃圾產(chǎn)物”，但最近的研究表明LncRNA不僅在細(xì)胞過程(例如增殖，分化和代謝)中而且在腫瘤、代謝和神經(jīng)退行性病變中起著重要作用[7-8]。據(jù)報(bào)道，LncRNA AT富集互動域2-IR(AT-rich interactive domain 2-IR，ARID2-IR)在慢性腎臟病中發(fā)揮著重要作用[9-10]，但在CGN中的作用尚不清楚。本研究將探討LncRNA ARID2-IR在CGN人群中的表達(dá)及其機(jī)制。

資料和方法

一、研究對象與試劑

1.研究對象 納入2018年至2019年在湖北省陽新縣人民醫(yī)院腎內(nèi)科確診為CGN的52例患者作為CGN組。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡>18歲；(2)患者尿化驗(yàn)異常(蛋白尿、血尿、管型尿)、水腫及高血壓病史達(dá)一年以上，并符合2003年國際腎臟病學(xué)會和腎臟病理學(xué)會聯(lián)合制定的關(guān)于CGN的國際標(biāo)準(zhǔn)[11]；(3)近1周未服用治療藥物；(4)患者基本資料和臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)繼發(fā)性腎小球疾病者；(2)遺傳性腎小球疾病者；(3)嚴(yán)重心理疾病、精神病患者；(4)存在其他惡性疾病，如腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病和心血管疾病等患者；(5)孕婦和哺乳期婦女。52例CGN患者通過腎活檢確定主要病理分型包括：系膜增生性腎小球腎炎(20例)、系膜毛細(xì)血管性腎小球腎炎(16例)、膜性腎病(9例)、局灶節(jié)段性腎小球硬化(7例)。另選45名健康成年人群作為對照組。本研究經(jīng)過湖北省陽新縣人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過(倫理批件號：YXL2018003)，所有受試者均簽署知情同意書。

2.試劑 RNA Lock血液RNA穩(wěn)定劑、高效血液總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒和SYBR Green熒光定量檢測試劑盒購自于天根生化科技有限公司。

二、方法

1.一般資料的收集 為所有受試者建立個(gè)人檔案，收集基本信息(包括年齡、性別、身高、體重)，計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)=體重(kg)/身高(m)2，測量收縮壓和舒張壓。

2.血生化檢測 采集兩組人群靜脈血，由醫(yī)院檢驗(yàn)科貝克曼庫爾特AU5800全自動生化分析儀檢測血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和血肌酐(serum creatinine，Scr)。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 用高效血液總RNA提取試劑盒提取外周血總RNA，檢測RNA濃度和純度后逆轉(zhuǎn)錄成cRNA。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增檢測基因表達(dá)。引物序列：LncRNA ARID2-IR上游5’-TTTTCCCACGCTGTCTGTCA-3’，下游5’-CAGTT TCCCCCGATGGTGAG-3’；IFT80上游5’-GCAAG GAACACCAGTGTATTCA-3’，下游5’-GGC CGTAA CTATCCCATACCTTA-3’；IGHG4上游5’-GGCTACC TCAGCGATAGCAG-3’，下游5’-GGGGTGTAATAG GGGGTCCC-3’；RLBP1上游5’-AAGGATGAGCTG AACGAGAGA-3’，下游5’-AGCCGGAAATTCACAT AGCCT-3’；ANKRD27上游5’-TTGACAGGAACA TCGCCTCTT-3’，下游5’-GAGAGCATTCGCTGAG TCTATG-3’；TSPAN6上游5’-ACTTGTTTCAAG AGCGTTCTGC-3’，下游5’-CAATGAGCACGAAGGG GACAT-3’；內(nèi)參β-actin上游5’-TCAGGTCATCAC TATCGGCAAT-3’，下游5’-AAAGAAAGGGTGTAA AACGCA-3’。引物由NCBI在線引物設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)，由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、兩組臨床資料比較

對照組與CGN組人群在年齡、性別和體質(zhì)量指數(shù)方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CGN組的收縮壓、舒張壓、BUN和Scr均顯著高于對照組(P<0.05)。(表1)

二、LncRNA ARID2-IR的表達(dá)及相關(guān)性分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測對照組與CGN組人群LncRNA ARID2-IR的表達(dá)。如圖1所示，CGN組LncRNA ARID2-IR的表達(dá)顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.543，P=0.013)。系膜增生性腎小球腎炎、系膜毛細(xì)血管性腎小球腎炎、膜性腎病和局灶節(jié)段性腎小球硬化4種病理類型之間LncRNA ARID2-IR表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.197，P=0.898)。

注：與對照組比較，aP<0.05圖1 兩組LncRNA ARID2-IR的相對表達(dá)量比較

如圖2A所示，LncRNA ARID2-IR表達(dá)與BUN呈顯著正相關(guān)(r=0.225，P=0.027)；如圖2B所示，LncRNA ARID2-IR表達(dá)與Scr呈顯著正相關(guān)(r=0.266，P=0.008)。

圖2 LncRNA ARID2-IR與腎功能指標(biāo)的相關(guān)性分析 A.LncRNA ARID2-IR與BUN的相關(guān)性分析；B.LncRNA ARID2-IR與Scr的相關(guān)性分析

三、LncRNA ARID2-IR下游靶基因通路富集及表達(dá)

通過Starbase數(shù)據(jù)庫(http：//starbase.sysu.edu.cn/)，我們對LncRNA ARID2-IR作用的下游靶基因進(jìn)行了預(yù)測。結(jié)果顯示一共有88個(gè)靶基因，我們對這些基因進(jìn)行功能富集分析，以推測LncRNA ARID2-IR的生物學(xué)功能。如圖3所示，這88個(gè)基因主要富集在鈣信號通路、甲狀腺激素信號通路、cAMP信號通路、催產(chǎn)素信號通路、Rap1信號通路、mTOR信號通路、胰島素分泌、TGF-beta信號通路、FoxO信號通路、胰島素抵抗10個(gè)通路中。根據(jù)與LncRNA ARID2-IR匹配得分，得分排名前5的靶基因?yàn)镮FT80、IGHG4、RLBP1、ANKRD27和TSPAN6，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證，相對于對照組，CGN組中IFT80(t=4.089，P<0.01)和RLBP1(t=2.147，P=0.034)高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

表1 兩組臨床資料比較

圖3 LncRNA ARID2-IR下游靶基因的通路富集

注：與對照組相比，aP<0.05圖4 LncRNA ARID2-IR下游主要靶基因的表達(dá)

四、LncRNA ARID2-IR、IFT80和RLBP1的ROC曲線

ROC曲線顯示，LncRNA ARID2-IR(圖5A)、IFT80(圖5B)和RLBP1(圖5C)的AUC分別為0.783、0.821和0.738，對于CGN具有診斷意義。

五、二分類Logistic回歸分析

進(jìn)行二分類Logistic回歸分析以確定LncRNA ARID2-IR、IFT80和RLBP1對CGN的影響，自變量為LncRNA ARID2-IR、IFT80和RLBP1，因變量為是否患有CGN。建立的二分類Logistic回歸模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，LncRNA ARID2-IR(OR=4.754，P<0.05)、IFT80(OR=3.518，P<0.01)和RLBP1(OR=4.718，P<0.05)水平升高會增加患CGN的風(fēng)險(xiǎn)(表2)。

圖5 三種指標(biāo)診斷CGN的ROC曲線 A.LncRNA ARID2-IR的ROC曲線；B.IFT80的ROC曲線；C.RLBP1的ROC曲線

表2 二分類Logistic回歸模型以確定LncRNA ARID2-IR、IFT80和RLBP1對CGN的影響

討 論

CGN的病理機(jī)制非常復(fù)雜，對于CGN的發(fā)病原因、預(yù)防和治療目前尚存在許多爭議，因此尋找CGN發(fā)生發(fā)展中新的生物標(biāo)記物成為現(xiàn)階段腎病研究的一個(gè)熱點(diǎn)[12]。越來越多的證據(jù)表明，LncRNA是基因調(diào)控和細(xì)胞功能的關(guān)鍵分子，并且在腎臟相關(guān)疾病中具有重要作用[10]。有研究報(bào)道在CGN患者中LncRNAs表達(dá)水平的失調(diào)[13-14]。Gao等[13]通過對CGN大鼠腎臟組織測序數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析，鑒定出40個(gè)顯著上調(diào)的LncRNA和24個(gè)下調(diào)的LncRNA，653個(gè)上調(diào)的mRNA和128個(gè)下調(diào)的mRNA，其中LncRNA NONRATT026650、LOC102547664、NONRATT77021989、NONRATT 012453、LOC102551856、LOC102553536和NONRATT7047175在CGN的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

LncRNA ARID2-IR被報(bào)道與腎臟疾病密切相關(guān)。Yang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA ARID2-IR過表達(dá)可能有助于糖尿病腎臟病中細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，而早期生長反應(yīng)蛋白1(early growth response protein-1，Egr1)可以通過上調(diào)LncRNA ARID2-IR來部分促進(jìn)糖尿病腎臟病中細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。Zhou等[9]通過動物模型研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA ARID2-IR的過表達(dá)促進(jìn)白細(xì)胞介素1β誘導(dǎo)的NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和炎性細(xì)胞因子表達(dá)，促進(jìn)NF-κB依賴性腎臟炎癥的發(fā)展，抑制LncRNA ARID2-IR的表達(dá)可對腎臟炎性疾病發(fā)揮治療作用。本研究中我們發(fā)現(xiàn)CGN組LncRNA ARID2-IR的表達(dá)顯著高于對照組。在CGN組中，LncRNA ARID2-IR表達(dá)與BUN和Scr呈顯著正相關(guān)，說明LncRNA ARID2-IR的上調(diào)和腎功能損傷有關(guān)。

在本研究中，通路富集分析表明，LncRNA ARID2-IR的靶基因主要參與鈣信號通路、甲狀腺激素信號通路、cAMP信號通路、催產(chǎn)素信號通路、Rap1信號通路、mTOR信號通路、胰島素分泌、TGF-beta信號通路、FoxO信號通路、胰島素抵抗10個(gè)通路。甲狀腺激素信號通路與CGN密切相關(guān)，甲狀腺激素影響腎臟發(fā)育、腎臟血流動力學(xué)、腎小球?yàn)V過率以及鈉和水穩(wěn)態(tài)[15]。胰島素抵抗與腎臟疾病進(jìn)展相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)IgA腎病患者的胰島素抵抗較高[16-17]。此外，研究發(fā)現(xiàn)胰島素/磷脂酰肌醇3-激酶/Akt和mTOR信號對于足細(xì)胞肥大和適應(yīng)至關(guān)重要[18-19]。腎臟中的脂肪因子和異位脂質(zhì)蓄積促進(jìn)了足細(xì)胞的胰島素抵抗和適應(yīng)不良的反應(yīng)，以應(yīng)對腎臟濾過的機(jī)械作用[20]。FoxO信號通路的激活可以減少有關(guān)通過SIRT1介導(dǎo)的脫乙酰作用，SIRT1基因是一種長壽基因，可以保護(hù)腎臟細(xì)胞免受各種細(xì)胞應(yīng)激的傷害[21-22]。通路富集分析表明，LncRNA ARID2-IR的靶基因與CGN進(jìn)展中的重要信號通路相關(guān)，進(jìn)一步支持了LncRNA ARID2-IR與CGN的潛在關(guān)聯(lián)。我們通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證了與LncRNA ARID2-IR匹配得分最高的5個(gè)靶基因IFT80、IGHG4、RLBP1、ANKRD27和TSPAN6，結(jié)果顯示CGN組IFT80和RLBP1的表達(dá)高于對照組人群。ROC曲線顯示LncRNA ARID2-IR、IFT80和RLBP1對于CGN具有診斷意義。Logistic回歸分析表明，LncRNA ARID2-IR、IFT80和RLBP1的上調(diào)能增加發(fā)生CGN的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，我們的發(fā)現(xiàn)表明CGN患者中LncRNA ARID2-IR的上調(diào)與CGN腎功能有關(guān)，其機(jī)制可能是通過調(diào)控靶基因IFT80和RLBP1實(shí)現(xiàn)的。我們的發(fā)現(xiàn)對后續(xù)進(jìn)一步的動物實(shí)驗(yàn)和離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)打下了理論基礎(chǔ)，為闡明LncRNA ARID2-IR在CGN進(jìn)展中的確切生物學(xué)功能和作用機(jī)制還需進(jìn)行深入研究。