G2/M細(xì)胞周期阻滯在急性腎損傷向慢性腎臟病轉(zhuǎn)變中的作用研究進(jìn)展

劉水英 尹建永 張芳菲 蘆澤源 王鋒

200233 上海，江蘇大學(xué)附屬上海市第八人民醫(yī)院腎內(nèi)科(劉水英，王鋒)；200233 上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院腎內(nèi)科(尹建永，張芳菲，蘆澤源，王鋒)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是一種廣泛存在的臨床綜合征，其病死率仍居高不下，尤其是在重癥監(jiān)護(hù)病房(>50%)[1-2]，并且至今缺乏有效的治療干預(yù)措施。AKI長期以來被認(rèn)為是一個可逆的過程，然而，在過去的數(shù)十年里，從動物模型和人類流行病學(xué)研究中得到的不斷發(fā)展的證據(jù)表明，很多AKI患者的腎功能并不能完全恢復(fù)，反而會在急性期后出現(xiàn)慢性化轉(zhuǎn)歸，逐步進(jìn)展成慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)甚至終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)[3]。最近一項(xiàng)薈萃分析證實(shí)，與正常人相比，AKI患者進(jìn)展為CKD的風(fēng)險增加8.8倍，進(jìn)展為ESRD的風(fēng)險增加3.3倍；長期隨訪中約1/3以上的AKI患者進(jìn)展至CKD或ESRD[4]。CKD在世界范圍內(nèi)越來越普遍，除了增加患者的病死率之外，還對個人的生理和心理產(chǎn)生了強(qiáng)烈的負(fù)面影響。最近二十年來，CKD的發(fā)病率增加了三倍多；此外，根據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，到2020年，它將成為全球死亡和殘疾的三大常見原因之一[5]。AKI已成為CKD及ESRD發(fā)生的獨(dú)立危險因素，日益受到重視。因此，探究AKI向CKD進(jìn)展中的關(guān)鍵致病分子機(jī)制，從而進(jìn)行針對性的干預(yù)已成為亟待解決的臨床問題。

一、腎小管上皮細(xì)胞異常修復(fù)

目前參與AKI后腎單位功能恢復(fù)的病理生理過程尚不完全清楚。在損傷后，腎小管細(xì)胞尤其是近端腎小管上皮細(xì)胞會失去極性及刷狀緣,膜蛋白比如β-整合素、Na+/K+-ATP酶錯位，如果損傷持續(xù)存在會導(dǎo)致小管細(xì)胞死亡[6]。在AKI后的正常修復(fù)過程當(dāng)中，存活的小管細(xì)胞先去分化，然后沿基底膜遷移、增殖，最后分化，恢復(fù)還原成有功能的腎單位[7-9]。然而，在許多情況下，嚴(yán)重的AKI或AKI后存在腎功能受損，將誘導(dǎo)促纖維化信號，導(dǎo)致修復(fù)不良和CKD。近年來，對AKI的修復(fù)不良的發(fā)生機(jī)制提出了許多不同的理論和機(jī)制。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)假說認(rèn)為腎小管細(xì)胞損傷后發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為上皮標(biāo)志物的丟失和間充質(zhì)特征的獲得。然而，最近的一些包括使用遺傳細(xì)胞譜系追蹤的研究，未能發(fā)現(xiàn)分化轉(zhuǎn)移的證據(jù)，因此對這一概念提出了質(zhì)疑[5，10-11]。但是，有研究發(fā)現(xiàn)小管上皮細(xì)胞經(jīng)歷部分EMT，在疾病的發(fā)展過程中，細(xì)胞表達(dá)上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，并與基底膜保持聯(lián)系。Lovisa等[12]進(jìn)一步證明，該部分EMT足以通過在G2期細(xì)胞周期停滯，誘導(dǎo)小管功能受損，導(dǎo)致小管上皮細(xì)胞異?；謴?fù)，進(jìn)而發(fā)展為腎纖維化。

二、細(xì)胞周期阻滯

1.腎臟細(xì)胞周期生理、病理生理學(xué) 細(xì)胞周期由4個具有特定特征的不同階段組成(G0～G1、S、G2和M期)。其中G2期是細(xì)胞有絲分裂(M期)前細(xì)胞快速生長和蛋白質(zhì)合成的階段。在M期，細(xì)胞生長停止，并有序的進(jìn)展到細(xì)胞分裂。細(xì)胞周期的進(jìn)展被周期蛋白(cyclins)、周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)及其抑制劑(如p15、p16INK4a、p21和p27)精細(xì)控制[11]。CDK與cyclins形成復(fù)合物，導(dǎo)致CDK的激活和下游靶點(diǎn)的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化，從而促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展[11]。為了確保細(xì)胞周期過程的保真度，在細(xì)胞分裂期間存在許多稱為檢查點(diǎn)的質(zhì)量控制步驟[11]。G2/M檢查點(diǎn)是細(xì)胞有絲分裂過程中一個重要的檢查點(diǎn)，常被DNA損傷激活。

正常生理?xiàng)l件下，小管上皮細(xì)胞分裂率極低。然而，在AKI后，細(xì)胞分裂率急劇增加，以取代壞死/凋亡細(xì)胞。這在近端小管的S3段尤其普遍[6]。輕度損傷后，存活的小管細(xì)胞增殖，覆蓋暴露的基底膜，恢復(fù)細(xì)胞數(shù)量[11]。結(jié)合增殖，這些細(xì)胞也會短暫地去分化，表達(dá)胚胎學(xué)標(biāo)記物，然后再分化成特殊的小管細(xì)胞，導(dǎo)致腎單位的修復(fù)[9]。當(dāng)新生的小管生長受阻、無法分化并萎縮時，這些小管表現(xiàn)出病理信號、旁分泌和自分泌活性，干擾腎間質(zhì)和腎間質(zhì)細(xì)胞之間的正常相互作用，導(dǎo)致異常修復(fù)和纖維化[13]。

2.G2/M期阻滯是AKI向CKD轉(zhuǎn)化的重要發(fā)病機(jī)制 一系列研究表明，腎小管上皮細(xì)胞中的G2/M期阻滯是導(dǎo)致AKI后異常修復(fù)和腎纖維化的重要驅(qū)動因素[14-16]。雖然腎小管上皮細(xì)胞不會轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，但受損的近端上皮細(xì)胞可以通過旁分泌機(jī)制在纖維化過程中發(fā)揮重要作用，其特征是G2/M期停滯和促進(jìn)原纖維因子的產(chǎn)生。Yang等[14]證實(shí)G2/M期阻滯參與腎損傷后的纖維化,通過對腎損傷后腎小管上皮細(xì)胞周期行為的觀察，他們發(fā)現(xiàn)在G2/M期上皮細(xì)胞周期停滯與損傷后修復(fù)不良引起的腎纖維化之間存在因果關(guān)系;他們在缺血、藥物及梗阻所致AKI模型中發(fā)現(xiàn)，損傷后的小管細(xì)胞很多阻滯于G2/M期，無法去分化，呈現(xiàn)促纖維化的表型，能夠產(chǎn)生和分泌多種促纖維化因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)，進(jìn)而促進(jìn)腎臟纖維化進(jìn)展。此外，近端小管上皮細(xì)胞阻滯于G2/M期可激活c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase，JNK)信號通路，上調(diào)促纖維化細(xì)胞因子的產(chǎn)生。這就建立了一個促纖維化的微環(huán)境，通過該微環(huán)境，成纖維細(xì)胞被永久激活[17]，表現(xiàn)為持續(xù)增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積[6，18-19]。并且通過藥理學(xué)干預(yù)，增加損傷后G2/M期阻滯細(xì)胞數(shù)量可使纖維化結(jié)局惡化，而促進(jìn)G2/M期活動的干預(yù)可減少纖維化[11，15-16]。以G2/M檢查點(diǎn)為靶點(diǎn)，在損傷階段維持細(xì)胞周期的正常進(jìn)展，有望成為阻止CKD進(jìn)展的一個有吸引力的治療靶點(diǎn)[11]。Cianciolo等[15]報(bào)道組蛋白乙酰酶抑制劑可減少G2/M期阻滯細(xì)胞數(shù)量，減少損傷后小管萎縮和間質(zhì)纖維化。有研究表明Twist(編碼Twist家族bHLH轉(zhuǎn)錄因子1)和Snail 1(編碼Snail家族鋅指蛋白1)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，可促進(jìn)持續(xù)的TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的G2期阻滯，用TGF-β1體外誘導(dǎo)EMT也會誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生G2/M期阻滯，限制細(xì)胞的再生和修復(fù)潛能；通過敲除Twist和Snail 1基因抑制EMT，導(dǎo)致G2/M期抑制的小管上皮細(xì)胞數(shù)量顯著減少，可減少腎實(shí)質(zhì)和間質(zhì)性纖維化[20-21]。

3.參與AKI后G2/M期阻滯調(diào)控的相關(guān)因子 然而，G2/M期阻滯細(xì)胞分泌促纖維化因子的確切細(xì)胞機(jī)制尚不清楚。近年來，許多學(xué)者對腎小管上皮細(xì)胞G2/M期調(diào)控進(jìn)行了研究，為腎臟纖維化進(jìn)展開辟了新的治療途徑。

(1)毛細(xì)血管共濟(jì)失調(diào)突變基因/Rad3相關(guān)蛋白激酶通路：DNA損傷導(dǎo)致毛細(xì)血管共濟(jì)失調(diào)突變基因/Rad3相關(guān)蛋白激酶(Ataxia Telangiectasia Mutated/Ataxia Telangiectasia and Rad3-related protein，ATM/ATR)通路活化，細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶(checkpoint kinase 2，CHK2)活化后磷酸化抑癌基因p53和磷酸酶cdc25，抑制Cdc2導(dǎo)致G2/M阻滯[22-25]。在正常情況下，這種阻滯確保了DNA在繼續(xù)有絲分裂前的修復(fù)時間，研究中發(fā)現(xiàn)這種突變的細(xì)胞更易受到DNA損傷和基因組不穩(wěn)定的影響，并經(jīng)歷G2/M期停滯。這導(dǎo)致范可尼貧血相關(guān)核酸酶1突變的患者發(fā)生腎小管萎縮和纖維化[26]。Romanov等[27]發(fā)現(xiàn)低劑量的馬兜鈴酸通過激活DNA損傷檢查點(diǎn)通路ATM-CHK2-p53-p21，引起活性氧產(chǎn)量的增加，可導(dǎo)致p53依賴的p21積累，在G2/M期誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。p21是Nishioka等[28]最早探索的蛋白之一，這種蛋白似乎在AKI和CKD進(jìn)展過程中發(fā)揮不同的作用。p21在AKI期間似乎具有保護(hù)作用，這是通過p21-/-小鼠有更明顯的腎功能障礙和死亡率來評估的，而在5/6腎切除術(shù)后CKD的進(jìn)展過程中，p21-/-小鼠的組織病理學(xué)損傷較少。p53是p21轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)因子，在AKI后也會上調(diào)，其抑制或基因缺失可減少腎臟損害[29]。Liu等[30]在細(xì)胞培養(yǎng)(人和大鼠腎小管上皮細(xì)胞)和小鼠單側(cè)輸尿管梗阻模型中發(fā)現(xiàn)了一個缺氧激活的p53反應(yīng)的促纖維化通路，在缺氧時，由缺氧誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)的p53上調(diào)抑制細(xì)胞周期進(jìn)展，導(dǎo)致G2/M期細(xì)胞的積累，并激活促纖維化因子TGF-β和CTGF介導(dǎo)的信號通路，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生和腎纖維化。

(2)p38-絲裂原活化蛋白激酶通路和Wee1激酶：不同應(yīng)激刺激(如缺氧)也可通過p38-絲裂原活化蛋白激酶(p38-mitogen-activated protein kinase，p38-MAPK)通路誘導(dǎo)G2/M期阻滯。MAPK可以磷酸化cdc25，導(dǎo)致其泛素化。因此，cdc25不再能夠激活Cdc2/cyclin A復(fù)合物，從而抑制G2期到M期的轉(zhuǎn)變[31]。Borst等[32]報(bào)道的另一項(xiàng)重要發(fā)現(xiàn)表明，MAPK信號通路的重要中介物JNK，即使在嚴(yán)重缺血損傷后數(shù)周，在近端小管上皮細(xì)胞中仍被激活。這種持續(xù)的激活是由于G2/M期細(xì)胞被抑制，導(dǎo)致促纖維化細(xì)胞因子的上調(diào)。馬兜鈴酸處理的細(xì)胞中產(chǎn)生大量活性氧，3個主要的MAPKs中，ERK1/2和p38被激活，而JNK未被激活；通過藥物抑制ERK1/2和p38以及N-乙酰-L-半胱氨酸抑制活性氧生成，可以減少部分G2/M檢查點(diǎn)細(xì)胞，減輕腎臟纖維化，腎小管上皮細(xì)胞凋亡水平下降[27]。Chen等[33]發(fā)現(xiàn)人Wharton's Jelly間質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞來源的微泡(microvesicles，MVs)可以通過ERK1/2信號傳導(dǎo)減輕G2/M期阻滯，從而緩解缺血再灌注損傷大鼠的腎臟纖維化。

G2/M阻滯的第三個重要介質(zhì)是Wee1激酶。Wee1是一種酪氨酸激酶，它通過磷酸化Cdc2的酪氨酸殘基使Cdc2處于非活性狀態(tài)[34]。Cdc2的再活化是通過cdc25去磷酸化實(shí)現(xiàn)的[35]。

(3)其他機(jī)制(如自噬、microRNA)：Liu等[36]首次發(fā)現(xiàn)缺氧時，miR-493在近端小管上皮細(xì)胞中高表達(dá)，而降低了細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子STMN-1的表達(dá)，增加了G2/M期細(xì)胞和促纖維化因子在近端小管上皮細(xì)胞中的比例，這些作用可以通過miR-493抑制劑在體外逆轉(zhuǎn)，表明miR-493-STMN-1通路參與了缺氧誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞G2/M期阻滯和腎纖維化。

Li等[37]發(fā)現(xiàn)西羅莫司增強(qiáng)自噬可以抑制膠原蛋白1的積累和腎纖維化；而通過近端小管上皮細(xì)胞特異性缺失自噬相關(guān)基因5(autophagy-related gene 5，ATG5)消融自噬，細(xì)胞周期在G2/M期明顯停止，間質(zhì)纖維化嚴(yán)重，ATG5表達(dá)增強(qiáng)，可拯救G2/M期阻滯，表明ATG5介導(dǎo)的近端上皮細(xì)胞自噬是一種關(guān)鍵的宿主防御機(jī)制，通過阻斷G2/M阻滯來預(yù)防腎纖維化。Canaud等[38]進(jìn)一步證實(shí)了近端腎小管細(xì)胞在G2/M期成為西羅莫司自噬空間偶聯(lián)區(qū)(TOR-autophagy spatial coupling compartments，TASCCs)的靶點(diǎn)，從而促進(jìn)了類似于衰老相關(guān)分泌表型的促纖維化分泌；細(xì)胞周期蛋白G1可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞中G2/M期阻滯和TASCC的形成，細(xì)胞周期蛋白G1的缺失減少了體內(nèi)G2/M期細(xì)胞和TASCC的形成；特異性敲除小管上皮細(xì)胞中TASCC關(guān)鍵成分可降低CKD小鼠的腎纖維化進(jìn)展速度。

綜上所述，我們對近年來AKI向CKD轉(zhuǎn)化的認(rèn)識進(jìn)展強(qiáng)調(diào)了腎小管上皮G2/M期阻滯在異常修復(fù)過程中的重要作用，其中對G2/M期阻滯調(diào)控相關(guān)因子的研究，為設(shè)計(jì)有針對性的治療策略以促進(jìn)適應(yīng)性腎臟修復(fù)和減少AKJ后的進(jìn)展為腎纖維化和CKD提供了重要的機(jī)會。