對比劑急性腎損傷動物模型的研究進展

王豆豆 胡杰 袁萌 高婷婷 董紅霖

030000 太原，山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血管外科

對比劑急性腎損傷(contrast-induced acute kidney injury，CI-AKI)根據(jù)2018年歐洲泌尿生殖放射學(xué)會(ESUR)CI-AKI防治指南定義為：使用碘對比劑后48～72 h內(nèi)發(fā)生的血肌酐(serum creatinine，Scr)升高超過0.3 mg/dL(26 μmol/L)，或大于基線值的1.5～1.9倍[1-2]，其病理改變基礎(chǔ)是腎髓質(zhì)缺血缺氧、腎小管上皮細胞直接損傷以及腎小管阻塞[3]。病理生理變化為急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)的代謝終產(chǎn)物及內(nèi)源性有害物質(zhì)保留在體內(nèi)，導(dǎo)致水電解質(zhì)及酸堿平衡紊亂和內(nèi)分泌功能障礙，最終可出現(xiàn)心腎綜合征(cardiorenal syndrome，CRS)，是指對于心臟或腎臟來說，各種原因?qū)е聝蓚€器官出現(xiàn)的急慢性臟器功能不全，可互為影響，互為因果[4]。臨床上多表現(xiàn)為非少尿型AKI，易漏診，其發(fā)生與晚期心血管事件、死亡風(fēng)險增加有關(guān)[5]。CI-AKI已成為院內(nèi)獲得性AKI的第三大病因，發(fā)病率僅次于腎灌注不足和腎毒性藥物所致AKI，其發(fā)病率急劇上升，尤其在高齡、糖尿病、高血壓等高?；颊咧械陌l(fā)病率達40%，其中約11%發(fā)展為慢性腎臟病、終末期腎病。本文通過總結(jié)幾種CI-AKI動物模型的制備方法，為進一步研究CI-AKI提供新視角。

一、吲哚美辛及N-硝基-L-精氨酸甲酯聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)CI-AKI模型

1.病理損傷機制 研究發(fā)現(xiàn)，在正常小鼠腹腔注射碘克沙醇對比劑，腎功能、Scr水平未見明顯改變；而在已存在腎損傷的基礎(chǔ)條件下注射碘克沙醇對比劑，Scr水平則顯著升高，可達到CI-AKI診斷標準，表明在已存在基礎(chǔ)腎損傷的情況下應(yīng)用對比劑較正常條件下更容易發(fā)生AKI[6]。

吲哚美辛為非甾體抗炎藥，是環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)的抑制劑，而COX是機體產(chǎn)生前列腺素的限速酶，吲哚美辛通過抑制前列腺素的產(chǎn)生從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛、抗炎、解熱作用。在腎臟中，COX-1和COX-2這兩種酶的亞型都參與維持腎灌注，故吲哚美辛可導(dǎo)致腎灌注減少，從而導(dǎo)致功能障礙。實驗結(jié)果顯示：吲哚美辛可導(dǎo)致腎臟中激活的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活性二聚體水平降低，從而導(dǎo)致腎臟一氧化氮(NO)合成減少，表現(xiàn)為腎臟亞硝酸鹽水平降低，腎灌注減少，繼而腎小球和腎小管損傷[7]。長期使用非甾體抗炎藥可作用于血管內(nèi)皮細胞，影響血管的生成，亦可通過抑制促血管生成因子如血管內(nèi)皮生長因子等的表達而阻斷血管的生成[8]。

N-硝基-L-精氨酸甲酯為NOS抑制劑。Godo等[9]在文章中描述NO是由細胞內(nèi)左旋精氨酸(L-arginine，L-Arg)經(jīng)NOS作用合成，在生理狀態(tài)下，L-Arg作為前體物質(zhì)在細胞內(nèi)固有型NOS的作用下，經(jīng)氧化、脫氫、裂解、水解等反應(yīng)，最終生成NO和L-瓜氨酸。NO具有許多良性心血管生理效應(yīng)，如舒張血管、調(diào)節(jié)局部血流、抑制血管平滑肌細胞增殖、抑制血小板黏附聚集、防止血栓形成等。NOS抑制劑與NO合成底物L(fēng)-Arg競爭NOS，使NO合成減少，從而造成腎功能不全。

2.模型構(gòu)建 Jeong等[6]在研究氧化應(yīng)激在CI-AKI發(fā)病中的作用中選用雄性C57BL/6J小鼠，隔夜脫水16 h后，間隔15 min依次腹腔注射吲哚美辛(10 mg/kg，溶于乙醇)、N-硝基-L-精氨酸甲酯(10 mg/kg，溶于0.9%生理鹽水)、碘海醇(4 000 mg碘/kg)，24 h后安樂死，收集血清尿素氮并摘除腎臟。Yue等[10]在CI-AKI藥物篩選實驗中使用8～10周齡SD大鼠，在禁水12 h后，腹腔注射10%水合氯醛(0.32 mL/100 g)麻醉，小鼠左股靜脈插管固定，間隔15 min依次注射吲哚美辛(10 mg/kg)，N-硝基-L-精氨酸甲酯(10 mg/kg)、76%泛影葡胺(10 mL/kg)，泛影葡胺注射時間不少于5 min，對比劑注射24～48 h后，收集大鼠尾靜脈血檢測Scr水平，結(jié)果顯示Scr水平較注射前相對升高25%，符合CI-AKI診斷標準(2003年ESUR指南標準)，提示造模成功。

二、脫水加呋塞米注射誘導(dǎo)CI-AKI模型

1.病理損傷機制 研究發(fā)現(xiàn)，脫水患者發(fā)生AKI的風(fēng)險增加[11]。呋塞米是一種常用的利尿劑，可抑制髓袢升支上皮細胞管腔內(nèi)側(cè)的Na-K-Cl轉(zhuǎn)運體導(dǎo)致尿鈉排泄和利尿[12]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在充分水化的基礎(chǔ)上給予小劑量呋塞米可以預(yù)防CI-AKI，水化可保證患者有充足的血容量，不僅能改善腎臟缺血，還能加速對比劑排泄，減輕對比劑對腎小管的毒性。呋塞米可直接擴張腎血管，降低腎血管阻力，并增加腎血管血流量，尤其是腎皮質(zhì)深部血流量，且由于其袢利尿作用可預(yù)防過度水化引起的水腫。但是血容量不足的患者應(yīng)用利尿劑，可能導(dǎo)致腎前性缺血，加重腎髓質(zhì)的缺血、缺氧[13]。持續(xù)輸注呋塞米并不能降低AKI發(fā)生率或有AKI風(fēng)險患者的病死率[14]。

2.模型構(gòu)建 Sun等[15]在實驗中使用250～300 g大鼠，脫水3 d后肌內(nèi)注射呋塞米(10 mL/kg)，20 min后尾靜脈注射對比劑碘海醇(350 mg碘/mL，10 mL/kg)，結(jié)果顯示：Scr水平較基礎(chǔ)值升高了42.9%，符合對比劑腎病診斷標準；Cheng等[16]在研究中使用250～300 g大鼠，脫水48 h后肌內(nèi)注射呋塞米(10 mL/kg)，30 min后尾靜脈注射對比劑碘海醇(350 mg碘/mL，15 mL/kg)，結(jié)果顯示：在對比劑應(yīng)用24 h后Scr水平較基礎(chǔ)值升高50%，達到了CI-AKI的診斷標準。

三、腎切除術(shù)加脫水誘導(dǎo)CI-AKI模型

1.病理損傷機制 5/6腎切除后的大鼠腎功能不全以及高血壓導(dǎo)致大鼠對CI-AKI的易感性增加，但是單一干預(yù)不能產(chǎn)生可靠的模型，因此對大鼠進行額外損傷預(yù)處理是建立CI-AKI大鼠的關(guān)鍵，通過實驗發(fā)現(xiàn)大鼠術(shù)后6周腎功能穩(wěn)定，既往預(yù)處理多采用腎毒性藥物及缺血損傷，但是會影響研究結(jié)果，而脫水48 h幾乎不會影響大鼠的血容量，脫水48 h后未注射對比劑前大鼠的Scr、血尿素氮以及尿肌酐水平?jīng)]有變化[17]。

2.模型構(gòu)建 Liu等[17]在研究中使用180～200 g大鼠，腹腔注射4%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后行右腎切除+左腎2/3切除術(shù)，術(shù)后6周脫水48 h，尾靜脈注射對比劑碘克沙醇(10 mL/kg)，結(jié)果顯示：對比劑應(yīng)用24 h后Scr水平較基線水平增加25%，達到了CI-AKI的診斷標準。

四、應(yīng)用糖尿病小鼠誘導(dǎo)CI-AKI模型

1.病理損傷機制 CI-AKI在糖尿病、慢性腎臟病人群中發(fā)生率超過50%，其病死率高達34%[18]。CI-AKI的危險因素包括急性腎功能不全、糖尿病、高齡、腎毒性藥物、充血性心力衰竭及血流不穩(wěn)定等，而糖尿病被認為是CI-AKI的獨立危險預(yù)測因子，發(fā)生CI-AKI的概率是5.7%～29.4%[19]。

2.模型構(gòu)建 王明秋等[18]在研究中使用250～300 g雄性SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，禁食12 h后給予腹腔一次性注射鏈脲佐菌素(STZ，60 mg/kg)，72 h后尾靜脈采血，血糖儀測定血糖，血糖≥16.7 mmol/L、空腹胰島素水平不低于正常范圍最低值表示2型糖尿病大鼠模型造模成功，將造模成功的大鼠納入實驗組，給予尾靜脈注射碘普羅胺(12 mL/kg)，構(gòu)建CI-AKI模型，實驗結(jié)果顯示：糖尿病CI-AKI大鼠Scr水平在48～72 h時升高大于25%，且其腎組織病理改變有腎小管管腔擴張變形、空泡形成及部分腎小管上皮細胞壞死性改變，提示糖尿病CI-AKI模型成功建立。陳軍[20]在研究中使用180～200 g雄性SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，禁食24 h，腹腔注射2%的STZ(60 mg/kg，3 mL/kg)，3 d后測定隨機血糖，若血糖≥16.7 mmol/L提示造模成功，繼續(xù)飼養(yǎng)第10周末，留取24 h尿液后，連續(xù)2 d，分別經(jīng)雙側(cè)股靜脈每天注入76%的復(fù)方泛影葡胺(10 mL/kg，10 min內(nèi)緩慢打入)，脫水24 h后處死大鼠，進行指標檢測，結(jié)果顯示：造模后Scr顯著升高，達到CI-AKI診斷標準。

五、總結(jié)

綜上所述，在以上幾種CI-AKI模型中，每種造模方法各有其優(yōu)缺點(表1)。吲哚美辛及N-硝基-L-精氨酸甲酯聯(lián)合應(yīng)用加對比劑造模所用時間比較短，花費相對比較少，但是由于對大鼠腎損傷較重，創(chuàng)傷較大，大鼠死亡率稍高，且模型中所用的泛影葡胺非臨床上常用的對比劑，但眾多研究仍采用此對比劑進行實驗研究，因此本研究仍可反映CI-AKI的基本過程，新型CI-AKI的研究有待進一步進行，且由于應(yīng)用血管損傷藥物，對于研究對比劑腎病的發(fā)生機制有一定局限性。

應(yīng)用5/6腎切除術(shù)+脫水+對比劑造模，廣泛地用于研究慢性腎臟病，由于腎臟組織大部分被切除，死亡率較高，操作復(fù)雜，成模率低，且對于應(yīng)用腎臟組織進行后續(xù)實驗研究的影響較大，因此限制了其在實驗研究中的應(yīng)用。

應(yīng)用糖尿病大鼠加對比劑進行造模，由于在臨床上患有糖尿病的患者日漸增多，進展到糖尿病腎病的患者也在增多，因此在糖尿病腎病基礎(chǔ)上建立CI-AKI模型更符合臨床實際情況，且對大鼠創(chuàng)傷較小、死亡率較低、模型組成模率高、腎損傷較輕，然而腎損傷較輕可能和糖尿病腎病造模時間相對較短，未發(fā)展到腎衰竭的終末階段有關(guān)，大鼠在發(fā)生糖尿病10周后雖然腎功能出現(xiàn)損傷，此時按照病程考慮此時大鼠處于糖尿病腎病的代償階段，腎臟處于高代謝狀態(tài)，因此延長糖尿病造模時間可能會增加CI-AKI的程度。此外，單次腹腔大劑量注射STZ建立的糖尿病更接近于1型糖尿病，這和臨床上糖尿病以2型糖尿病患者居多的情況仍存在差異，且由于糖尿病會對血管、神經(jīng)造成一定影響，會影響實驗研究。

表1 對比劑急性腎損傷各造模方法的比較

脫水+呋塞米注射+對比劑造模，操作步驟簡單，不需要進行復(fù)雜的手術(shù)操作，容易復(fù)制，且脫水48 h不影響老鼠的血容量致低灌注以及對Scr沒有影響，不會導(dǎo)致腎功能惡化。由于對比劑是通過尾靜脈注射的，黏稠度較高，如果注射速度過快或者因尾靜脈穿刺失敗注射到皮下組織，24 h后鼠尾會因缺血而壞死，因此應(yīng)熟練操作以及接受相關(guān)專業(yè)培訓(xùn)。脫水加呋塞米注射由于對腎臟血管損傷作用較小，可用于CI-AKI發(fā)病機制的研究。研究者可根據(jù)自己的研究目標選擇最適合的動物模型，并且將各種模型的優(yōu)缺點考慮在內(nèi)，將不會影響模型的使用。

隨著實驗動物科學(xué)的不斷發(fā)展，各種CI-AKI動物模型的制備從實驗動物的選擇到實驗方法、實驗手段等將會日臻完善，從而為人類更深刻地認識CI-AKI的發(fā)病機制和病理生理過程以及預(yù)防和研究新的治療藥物提供重要的實驗手段。