狼瘡腎炎中基因表達(dá)芯片的生物信息學(xué)分析

姜秋竹 楊會(huì) 周曉霜

030604 太原，山西醫(yī)科大學(xué)(姜秋竹)；030012 太原，山西省人民醫(yī)院(周曉霜)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫疾病，可以影響許多器官，臨床表現(xiàn)多種類型，嚴(yán)重程度各不一致[1]。在所有年齡組中，女性人群患SLE較男性更為普遍，女性與男性患病比例為8～15∶1之間[2]。狼瘡腎炎(lupus nephritis，LN)是SLE最常見和最重要的腎臟并發(fā)癥，其主要發(fā)病機(jī)制為免疫復(fù)合物沉積，臨床表現(xiàn)為血尿、蛋白尿和水腫等癥狀[3]。由于其機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)有的治療方案大多數(shù)是藥物聯(lián)合使用[4]。早期診斷對(duì)LN的治療至關(guān)重要。但是現(xiàn)有的研究仍沒有對(duì)于LN診斷和治療的標(biāo)記物進(jìn)行全面分析。

生物信息學(xué)是融合了現(xiàn)代基因技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，利用生命科學(xué)技術(shù)和計(jì)算機(jī)科學(xué)來共同挖掘疾病相關(guān)通路、找出關(guān)鍵基因，從而探索疾病的發(fā)生機(jī)制[5]。因此，本研究擬利用大數(shù)據(jù)庫獲取LN的相關(guān)基因芯片，將芯片信息進(jìn)行整合，比較正常腎組織和LN腎組織的基因表達(dá)，篩選出差異基因，找出LN發(fā)病的重要基因，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)，獲得LN潛在的調(diào)控靶點(diǎn)和調(diào)控機(jī)制，為LN分子標(biāo)志物研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。

資料與方法

一、研究資料的獲取

在美國國立生物中心的GEO數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中獲得LN的表達(dá)譜芯片(GSE32591)。GSE32591是基于GPL14663構(gòu)建的記憶芯片，分為正常腎組織(29例)基因表達(dá)譜和LN腎組織(64例)基因表達(dá)譜。

二、方法

1.差異基因數(shù)據(jù)篩選 采用GEO數(shù)據(jù)庫提供的GEO2R在線分析的辦法，獲取全部相關(guān)基因的表達(dá)矩陣文件。將結(jié)果保存后，對(duì)其進(jìn)行差異表達(dá)分析，顯著性閾值P<0.05，|log2(FC)|>1，去除重復(fù)的數(shù)據(jù)，匹配探針的基因名。

2.差異基因富集分析 獲得差異基因后，從三個(gè)方面(包括生物途徑、細(xì)胞定位和分子功能)進(jìn)行基因本體論(gene ontology，GO)功能注釋蛋白相互作用分析。進(jìn)行京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路注釋富集分析。

3.蛋白質(zhì)相互作用分析 使用STRING(Search tool for the retrieval of interacting genes)數(shù)據(jù)庫來構(gòu)建蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡(luò)，分析的結(jié)果通過Cytoscape 軟件進(jìn)行可視化分析。利用Cytoscape的cytoHubba插件通過MCC算法，篩選出蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中得分最高的10個(gè)基因定義為hub基因。

結(jié) 果

一、LN發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)差異表達(dá)基因分析

在差異表達(dá)分析中，獲取了146個(gè)上調(diào)基因和28個(gè)下調(diào)基因(圖1)。分別挑取數(shù)據(jù)集中上調(diào)和下調(diào)的前十位基因作為展示(表1)。

圖1 表達(dá)差異基因的火山圖

表1 基因差異分析結(jié)果

二、LN發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)差異基因富集分析

用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)得到的174個(gè)差異基因進(jìn)行GO分析，結(jié)果如圖2～4所示。就生物通路而言，差異基因主要參與I型干擾素信號(hào)通路、病毒防御反應(yīng)、γ-干擾素介導(dǎo)的信號(hào)通路、病毒反應(yīng)和病毒基因組復(fù)制的負(fù)調(diào)控等生物途徑。就細(xì)胞定位而言，差異基因的表達(dá)主要分布在胞外體、細(xì)胞外成分、MHCⅡ類蛋白復(fù)合物、血液微粒和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔側(cè)的組成成分等部位。就分子功能而言，差異基因主要與MHCⅡ類受體活性、抗原肽結(jié)合、雙鏈RNA結(jié)合、血小板衍生生長因子結(jié)合和絲氨酸型內(nèi)肽酶活性相關(guān)。KEGG分析結(jié)果表明，差異基因與甲型流感病毒感染、金黃色葡萄球菌感染、單純皰疹病毒感染、利什曼病和哮喘等通路有關(guān)(圖5)。

圖2 差異基因的生物通路

圖3 差異基因的細(xì)胞定位

圖4 差異基因的分子功能

圖5 KEGG通路分析

三、構(gòu)建LN發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)基因的蛋白網(wǎng)絡(luò)及尋找核心基因

在蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中尋找連接數(shù)前十位基因作為核心基因，并且定義為hub基因。經(jīng)過篩選發(fā)現(xiàn)IFI35、MX2、OAS3、IFI6、IRF7、OAS2、IFIT2、RSAD2、OAS1、MX1是LN發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中的核心基因。(圖6～7)

圖6 差異基因蛋白網(wǎng)絡(luò)

圖7 核心基因蛋白網(wǎng)絡(luò)

討 論

SLE具有廣泛的臨床和免疫學(xué)表現(xiàn)，LN是其最常見的腎臟并發(fā)癥和死亡原因[6]。LN的發(fā)生發(fā)展涉及異常凋亡、自身抗體產(chǎn)生、免疫復(fù)合物沉積、補(bǔ)體激活等多種致病途徑[7]。這些原因相互作用導(dǎo)致多器官受損，發(fā)生不同程度的腎臟受損[8]。其中DNA損傷是一個(gè)重要原因。DNA的損傷反應(yīng)過程中，P21引起的細(xì)胞周期阻滯是關(guān)鍵反應(yīng)[9]。P21是一種關(guān)鍵的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，它可以通過抑制多種細(xì)胞周期蛋白依賴激酶來促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯[10]。在以往的研究過程中，P21在腎小管中上調(diào)，并且定位于細(xì)胞核中，在細(xì)胞核中誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯[11]。雖然已經(jīng)有大量的研究工作對(duì)LN的機(jī)制進(jìn)行了研究，但其中的分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步的探索。因此，本文通過對(duì)正常腎組織和LN腎組織的基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以確定與LN發(fā)生發(fā)展中的P21通路相關(guān)的差異表達(dá)基因，分析得到了174個(gè)差異基因，其中包括146個(gè)上調(diào)基因和28個(gè)下調(diào)基因。

功能富集分析結(jié)果顯示，174個(gè)差異基因主要參與了I型干擾素信號(hào)通路、病毒防御反應(yīng)、γ-干擾素介導(dǎo)的信號(hào)通路、病毒反應(yīng)和病毒基因組復(fù)制的負(fù)調(diào)控等過程，位于胞外體等部位。對(duì)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，得到了10個(gè)hub基因，包括：IFI35、MX2、OAS3、IFI6、IRF7、OAS2、IFIT2、RSAD2、OAS1、MX1。關(guān)于IFI35在LN的機(jī)制研究過程中有所報(bào)道[12]，IFI35(35 kDa)蛋白是一種干擾素誘導(dǎo)的蛋白，具有抗菌和天然防御功能，它還與細(xì)胞增殖有關(guān)。研究表明，IFI35的基因表達(dá)在SLE中上調(diào)并低甲基化，提示IFI35是SLE的治療靶點(diǎn)[13]。IFI6基因最初被鑒定為干擾素誘導(dǎo)的眾多基因之一，編碼蛋白可能在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起重要作用[14]。IRF7基因編碼干擾素調(diào)節(jié)因子7，是干擾素調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，在病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞基因(包括干擾素β鏈基因)的轉(zhuǎn)錄激活中起著重要作用[15]。前述研究結(jié)果提示干擾素家族蛋白與LN的活動(dòng)程度有一定的相關(guān)性。MX2基因編碼的蛋白具有細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)形式，是動(dòng)力蛋白家族和大型GTPases家族的成員，核形態(tài)蛋白以顆粒狀分布于核膜下的異染色質(zhì)區(qū)，廣泛抑制許多RNA和DNA病毒的初期復(fù)制[16]。IFIT2基因表達(dá)下調(diào)可激活蛋白激酶C通路并可以促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展，而且IFIT蛋白可通過細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制作用于抗病毒免疫應(yīng)答和先天免疫[17]。RSAD2是Ⅰ型干擾素介導(dǎo)的與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的病毒抑制基因，在過往的研究中發(fā)現(xiàn)，此基因在LN患者表達(dá)明顯升高[18]。OAS3基因和OAS2基因分別編碼一種包含在2'，5'-寡腺苷酸合成酶家族中的蛋白酶，該酶家族在抑制細(xì)胞蛋白合成和抗病毒感染方面發(fā)揮重要作用[19]。OAS1基因由干擾素誘導(dǎo)，編碼一種合成2'，5'-寡腺苷酸的蛋白質(zhì)，該基因的多態(tài)性與病毒感染和I型糖尿病的易感性有關(guān)[20]。MX1基因編碼一種鳥苷三磷酸代謝蛋白，參與細(xì)胞抗病毒反應(yīng)，該編碼蛋白由Ⅰ型和Ⅱ型干擾素誘導(dǎo)，可抑制幾種不同RNA和DNA病毒的復(fù)制過程[21]。上述分析得到的hub基因可為后續(xù)LN發(fā)病機(jī)制的研究提供新的方向。

KEGG分析結(jié)果顯示，差異基因與甲型流感病毒感染、金黃色葡萄球菌感染、單純皰疹病毒感染、利什曼病和哮喘等通路有關(guān)。在以往的報(bào)道中，有因甲型H1N1流感感染引起的肉芽腫性間質(zhì)性腎炎而導(dǎo)致急性腎損傷的案例[22]。這個(gè)病例表明，甲型H1N1流感應(yīng)該被考慮在肉芽腫性間質(zhì)性腎炎與急性腎損傷兒童的鑒別診斷中[23]。金黃色葡萄球菌感染、單純皰疹病毒感染、利什曼病和哮喘等信號(hào)通路在LN機(jī)制中有重要作用，對(duì)這些潛在的通路進(jìn)行進(jìn)一步研究有助于深入對(duì)LN的認(rèn)識(shí)。

綜上所述，本研究利用綜合生物信息學(xué)方法分析了的參與LN發(fā)生的差異表達(dá)基因，由于目前對(duì)于這些差異基因的認(rèn)識(shí)有限，還需要進(jìn)一步的研究進(jìn)行驗(yàn)證。本研究找到了10個(gè)LN發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的核心基因，為探討LN的分子機(jī)制提供依據(jù)，其中MX2、OAS3、IFI6等差異表達(dá)基因可作為LN治療的潛在靶點(diǎn)。