DNA 步行器的構(gòu)建及其在生物分析中的應(yīng)用

廖 妮， 楊 芳， 潘美辰， 劉 偉， 卓 穎*

(1. 西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 重慶 400715)

(2. 攀枝花學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院, 四川攀枝花 617000)

0 引言

分子機(jī)器在生物體中無處不在，執(zhí)行各種生理功能，包括機(jī)械驅(qū)動、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。DNA 以其精確的堿基配對、序列可編程性、結(jié)構(gòu)可控性、易合成和修飾，被認(rèn)為是構(gòu)建人工分子機(jī)器理想的元件。 到目前為止，研究人員已經(jīng)設(shè)計出多種性能優(yōu)良的DNA 分子機(jī)器， 它可以在納米尺度上執(zhí)行特定的功能， 如：DNA 納米機(jī)器人[1-2]、DNA 鑷子[3-4]和DNA 步行器[5-6]等。 DNA步行器作為一種新型的人工納米機(jī)器，它是對自然產(chǎn)生的分子步行器（如動力蛋白、肌球蛋白和驅(qū)動蛋白）的人工模擬。 組成它的核酸能夠部分或全部地沿著精心設(shè)計的DNA 軌道自主地、漸進(jìn)地運(yùn)動并整合運(yùn)動過程中信號。該文將從DNA步行器的組成及其在生物傳感分析方面的應(yīng)用進(jìn)行概述。

1 DNA 納米步行器的構(gòu)建

從結(jié)構(gòu)上講，DNA 步行器由三個基本部件組成，包括行走鏈、軌道鏈和燃料分子或其他形式的驅(qū)動行走的能量輸入（也稱為驅(qū)動力）。 驅(qū)動力打破初始平衡， 促進(jìn)光能或化學(xué)能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能，使行走鏈沿著軌道鏈運(yùn)動。 然后，通過消耗燃料分子，恢復(fù)反應(yīng)平衡，從而產(chǎn)生信號。 平衡不斷地被打破和恢復(fù)，最后輸出放大的信號。 在驅(qū)動力的刺激下，目標(biāo)物直接或者間接的參與導(dǎo)致反應(yīng)的熱力學(xué)和動力學(xué)平衡破壞而傾斜，然后其他的能量轉(zhuǎn)化為機(jī)械能， 這樣預(yù)先設(shè)計的DNA 鏈（行走鏈）就可以沿著軌道鏈行走。

1.1 行走鏈

根據(jù)DNA 步行器中行走鏈的數(shù)量，DNA 步行器可以分為 （1） 單足DNA 步行器、（2） 雙足DNA 步行器和（3）多足DNA 步行器。只有一條行走鏈可自由活動的單足DNA 步行器是最簡單的形式。 目前有兩種典型的單足DNA 步行器，分別如圖1 和圖2 所示。 圖1 中的單足DNA 步行器有一條長長的步行鏈， 其一端固定在剛性基質(zhì)（金納米顆粒）上，另一端由目標(biāo)物驅(qū)動激活并沿著軌道鏈行走[7]。圖2 中的單足DNA 步行器的行走鏈?zhǔn)且粭l兩端可自由移動的短鏈，該行走鏈由目標(biāo)物驅(qū)動激活并在外切酶的輔助下，完成在軌道鏈上的行走[8]。

圖1 DNA 行走鏈和DNA 軌道鏈共同組裝在的單個AuNP 的三維DNA 納米機(jī)器Fig.1 Schematic illustrating the principle of the 3-D DNA nanomachine constructed by co-conjugating DNA walker and DNA track(substrate)components on a single AuNP.Copyright 2016 ACS

圖2 Exo Ⅲ驅(qū)使的DNA 步行器在球型核酸上的行走示意圖Fig.2 Schematics for Exo III-powered stochastic DNA walkers that move on the SNA surfaces.Copyright 2017 Wiley

單足DNA 步行器在實際應(yīng)用上存在一定的不足，步行鏈太短會導(dǎo)致行走速度較慢，行走空間范圍有限。 而行走鏈太長，則行走軌跡難以控制并可能會脫離軌道，使得反應(yīng)暫時中止，只有等到行走鏈結(jié)合在另一條DNA 軌道上， 反應(yīng)才能繼續(xù)進(jìn)行， 從而導(dǎo)致行走過程中的步數(shù)減少，信號放大效率較低。

雙足DNA 步行器的行走鏈兩端相對自由，其行走鏈的兩端都可以沿著軌道鏈行走。 由于雙足DNA 步行器的行走鏈可以在軌道鏈上有更多作用位點， 與單足DNA 步行器相比， 雙足DNA步行器表現(xiàn)出更強(qiáng)的穩(wěn)定性和更高的反應(yīng)效率。如圖3 所示，Chai 等[9]設(shè)計了一種目標(biāo)物觸發(fā)的雙足DNA 步行器并應(yīng)用于目標(biāo)物的靈敏檢測。此外，Chen 等[10]采用核酸等溫擴(kuò)增反應(yīng)引發(fā)的一個無酶雙足DNA 步行器，構(gòu)建了一個靈敏、快速檢測microRNA 的電化學(xué)發(fā)光（ECL）生物傳感器。雖然雙足DNA 步行器的行走范圍比單足DNA 步行器寬，但是它們對運(yùn)動軌跡的可控性相對較差。

圖3 基于雙足DNA 步行器的電化學(xué)基因傳感器的構(gòu)建示意圖Fig.3 Illustration of the bipedal DNA walker based electrochemical genosensor.Copyright 2019 ACS

當(dāng)DNA 步行器的行走鏈增加時， 可以增加與軌道鏈的作用位點，提高反應(yīng)速率。 因此，多足DNA 步行器的研究成為趨勢。 目前，已經(jīng)報道的多足DNA 步行器主要有三足型、 四足型以及球型等。 如圖4 所示，Li 等[11]設(shè)計了一種四足DNA步行器，它有4 條行走鏈，在目標(biāo)蛋白鏈霉親和素（SA）存在下，生物素修飾的行走鏈與固定在金屬上的發(fā)卡發(fā)生催化發(fā)卡自組裝-H1（MB-CHAH1）相互作用進(jìn)而打開發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 此外，Zhang等[12]將DNA 行走鏈和DNA 軌道鏈分別固定在金納米顆粒上，形成球型DNA 步行器。 在目標(biāo)物的作用下， 球型DNA 步行器的行走鏈被激活并與球型軌道鏈雜交，在酶的作用下，軌道鏈被切割，同時，相鄰的行走鏈可以與下一條軌道鏈結(jié)合（圖5）。該球型DNA 步行器以寨卡病毒核糖核酸片段為模型， 構(gòu)建的傳感器具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和回收率高的優(yōu)點。 多足DNA 步行器的行走鏈可以與軌道鏈協(xié)同結(jié)合，使得行走鏈穩(wěn)定不易脫軌，實現(xiàn)信號的多重累積。

圖4 基于等溫鏈置換聚合酶鏈反應(yīng)的DNA 步行器對親和素靈敏檢測的原理示意圖Fig.4 A schematic illustration of the principle for the sensitive detection of SA based on an ISDPR-DNA walker.Copyright 2018 ACS

圖5 目標(biāo)物引發(fā)的粒子間相對運(yùn)動的DNA 步行器示意圖Fig.5 Schematic illustration of the interparticle relatively motional DNA walker triggered by the target.Copyright 2020 RCS

1.2 軌道鏈

DNA 步行器的設(shè)計要求軌道鏈與行走鏈牢固地結(jié)合，同時軌道鏈通常還擔(dān)任電化學(xué)或光學(xué)信號的輸出功能。 根據(jù)行走鏈的運(yùn)動方式和運(yùn)動范圍，軌道鏈的類型大致可分為一維直線、二維平面和三維球型核酸軌道。 Zhang 等[13]將二維平面軌道鏈介導(dǎo)的分子信標(biāo)在內(nèi)切酶的輔助下實現(xiàn)了對細(xì)胞因子干擾素-γ 的靈敏檢測（圖6）。干擾素-γ 可以與DNA 雙鏈上的適配子結(jié)合從而激活行走鏈，在內(nèi)切酶的輔助下，觸發(fā)軌道鏈離開電極表面打開分子信標(biāo)2 從而實現(xiàn)對目標(biāo)物的檢測。 由于三維球型核酸軌道擁有更多與行走鏈結(jié)合的位點，因而引起了研究者廣泛的興趣。 Luo等[14]將磁性分離技術(shù)和球型核酸軌道DNA 步行器擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建了一種靈敏的電化學(xué)生物傳感器實現(xiàn)了對人類免疫缺陷病毒脫氧核糖核酸的檢測。 如圖7 所示，通過將大量的軌道鏈固載在磁性納米顆粒上形成球型核酸軌道，一方面可以提高軌道鏈的固載量，提供大量可以和行走鏈結(jié)合的位點，提高反應(yīng)速率。 另一方面可以從復(fù)雜的樣品中特異地捕獲和分離目標(biāo)，大大提高檢測靈敏度。 與二維的軌道鏈相比，將所有的DNA 軌道鏈結(jié)合在一個球型的納米顆粒表面，可以提高DNA 軌道鏈的固載密度， 從而加快催化反應(yīng)的速度。但是軌道鏈固定是隨機(jī)的。因此，準(zhǔn)確定量的設(shè)計DNA 軌道鏈可以有效地提高DNA的行走效率。

圖6 DNA 步行器和內(nèi)切酶輔助信號放大的生物傳感器用于干擾素-γ 的快速靈敏檢測Fig.6 Schematic diagram showing the principle of DNA walker and nicking enzyme assisted signal amplification method based biosensor for simple and ultrasensitive detection of IFN-γ.Copyright 2018 Elsevier

圖7 DNA 步行器和磁性分離放大的電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建Fig.7 Illustration of the DNA walker and the magnetic separation-amplified single-particle electrochemical biosensor.Copyright 2021 ACS

1.3 驅(qū)動力

通常DNA 步行器的行走需要外界的一些驅(qū)動力，比如，酶，光照，化學(xué)反應(yīng)或者核酸單元等。當(dāng)目標(biāo)物存在時，初始平衡可以從熱力學(xué)或動力學(xué)上向一個方向傾斜，反應(yīng)體系從高能級轉(zhuǎn)變?yōu)榈湍芗墶?驅(qū)動力的類型通常由目標(biāo)物質(zhì)的性質(zhì)決定。 DNA 步行器通常是由核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶和脫氧核酸酶等推動DNA 行走鏈沿著軌道鏈行走。 由于酶參與的反應(yīng)對環(huán)境要求較高，因此，熵驅(qū)動擴(kuò)增作為一種無酶參與的反應(yīng)在生物分析中顯示出獨特的優(yōu)勢。 如圖8 所示，Yang 等[15]報道了一種熵驅(qū)動的DNA 步行器放大策略。 該生物傳感器的界面由三條鏈在金電極上自組裝而成，兩個不同功能的適配體與不同的目標(biāo)凝血酶的位點結(jié)合， 鄰位觸及引發(fā)固定在三鏈DNA復(fù)合物中的一個短鏈DNA 的鏈置換， 從而暴露出一個預(yù)先鎖定的結(jié)構(gòu)域， 與亞甲基藍(lán)標(biāo)記的DNA 鏈 （MB-DNA） 雜交。 隨后，MB-DNA 的toehold-介導(dǎo)的鏈置換導(dǎo)致適體/蛋白質(zhì)復(fù)合物的釋放和回收。 最終，大量的MB-DNA 鏈被傳感器的表面捕獲，對凝血酶產(chǎn)生顯著放大的電化學(xué)反應(yīng)。 熵驅(qū)動擴(kuò)增具有簡單、非機(jī)械化的特點，克服了有酶介導(dǎo)的反應(yīng)對環(huán)境要求高的缺點。

圖8 熵驅(qū)動的DNA 步行器測定凝血酶的原理圖Fig.8 Schematic diagram of entropy-driven DNA walkers for thrombin determination.Copyright 2017 ACS

2 DNA 步行器在生物分析中的應(yīng)用

DNA 步行器以其快速的行走動力學(xué)和靈敏的處理速度有利于在一定時間內(nèi)獲得較高的信號增益。 因此，DNA 步行器被認(rèn)為是一種理想的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和放大工具， 特別是與DNA 擴(kuò)增反應(yīng)包括催化發(fā)夾自組裝，鏈置換反應(yīng)，滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，酶反應(yīng)以及多種反應(yīng)策略相結(jié)合在生物分析中引起了廣泛的關(guān)注。 接下來主要從按照不同檢測對象，如DNA、microRNA、蛋白質(zhì)、霉菌毒素和細(xì)胞檢測等方面展開介紹。

2.1 DNA 步行器在DNA 檢測方面的應(yīng)用

DNA 步行器作為一種理想的信號傳導(dǎo)和放大工具，可適用于特定DNA 的檢測。 Tao 等[16]研制了一個基于DNA 步行器和目標(biāo)物引發(fā)的催化發(fā)夾自組裝的模塊化生物傳感平臺并用于乙型肝炎病毒（HBV）核酸的檢測，檢測范圍為0.5～50 nmol/L。 此外，Zheng 等[17]開發(fā)了一種將DNA 滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）反應(yīng)和DNA 步行器相結(jié)合的生物傳感器，并用于人類免疫缺陷病毒（HIV）核酸的檢測。 該生物傳感器具有較高的選擇性和靈敏性，能夠在實際樣品中檢測目標(biāo)DNA，在生物學(xué)研究和臨床應(yīng)用上表現(xiàn)出誘人的前景。 該方法在生物研究和臨床診斷中具有廣闊的應(yīng)用前景。 此外， 基于DNA 步行器的生物傳感器也被應(yīng)用于突變基因的檢測，如圖9 所示，Wu 等[18]構(gòu)建了DNA 步行器結(jié)合滾環(huán)級聯(lián)放大納米機(jī)器實現(xiàn)了對腫瘤相關(guān)基因p53 的超靈敏檢測，該生物傳感器在人血中p53 基因的準(zhǔn)確檢測中具有實用價值。DNA 步行器較早應(yīng)用于DNA 傳感方面，但對病毒和細(xì)菌等特異性DNA 的檢測還有待進(jìn)一步研究。

圖9 三維DNA 步行器與三維DNA 滾環(huán)機(jī)器結(jié)合的級聯(lián)擴(kuò)增策略示意圖Fig.9 Schematic illustration of the cascade amplification strategy of a 3D DNA walker coupled with a 3D DNA rolling machine.Copyright 2020 ACS

2.2 DNA 步行器在microRNA 分析中的應(yīng)用

MicroRNAs 作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子的非編碼短小RNA。 它們的核酸序列有很高的相似性，但在細(xì)胞中的表達(dá)水平很高， 這增加了檢測的難度。因此，提高microRNA 的檢測靈敏度具有重要意義。 已經(jīng)有許多文獻(xiàn)報道了基于DNA 步行器的生物傳感器，他們在檢測microRNAs 方面表現(xiàn)出了良好的選擇性、 靈敏度和重復(fù)性等優(yōu)異性能。 Liu 等[19]采用多環(huán)芳烴作為電化學(xué)發(fā)光體（DPA NBs），Pt-Ag 合金納米花為共反應(yīng)促進(jìn)劑結(jié)合單足DNA 步行器構(gòu)建了一個新型的ECL“off-on”開關(guān)的生物傳感器（圖10）。 鎖住的DNA行走鏈和修飾有猝滅探針的DNA 軌道鏈同時固定在電極界面上，使得初始的ECL 信號處于“信號關(guān)閉”狀態(tài)。 在目標(biāo)物microRNA 141（miRNA-141）和核酸外切酶T7 存在下，激活DNA 行走鏈與DNA 軌道鏈雜交， 猝滅探針離開電極界面恢復(fù)強(qiáng)烈的ECL 信號，使其處于“信號開啟”狀態(tài)。此基于DNA 步行器的生物傳感器對miRNA-141的檢測下限可達(dá)29.5 amol/L。 最近，我們采用了四-(4-氨基苯)乙烯（TAPE）調(diào)控的苝微晶作為新型ECL 發(fā)光材料， 結(jié)合行走鏈的位置可控的DNA 步行器實現(xiàn)了對microRNA let-7a 的靈敏檢測[20]。該工作中提出的位置可控的策略能夠增加反應(yīng)效率和提高DNA 步行器在行走中的動力學(xué)，這為臨床生物分析中生物分子的靈敏檢測提供新的思路（圖11）。 與電化學(xué)發(fā)光傳感器相比，由于熒光傳感器可以實現(xiàn)均相檢測， 因此用于microRNA 檢測的熒光傳感器也迅速涌現(xiàn)。 Yang等[21]巧妙地設(shè)計了Janus 三維DNA 納米機(jī)器用于同時靈敏地檢測兩種不同的microRNA。 它可以有效地消除由于兩個不同的信號探針接近時導(dǎo)致的信號干擾， 提高了對microRNA 的檢測靈敏度。

圖10 基于一步法DNA 步行器放大的生物傳感器對miRNA-141 的檢測示意圖Fig.10 Ultrasensitive detection of miRNA-141 based on the one-step DNA walker amplification.Copyright 2018 ACS

圖11 位置可控的DNA 步行器的制備(A)及對microRNA let-7a 的檢測示意圖(B)Fig.11 Schematic illustration of the location-controllable DNA walker fabrication(A),the operating principle of the biosensor based on the location-controllable DNA walker for let-7a determination.Copyright 2021 ACS

2.3 DNA 步行器在蛋白質(zhì)分析中的應(yīng)用

快速、 靈敏地檢測與臨床相關(guān)的蛋白質(zhì)，如一些生物標(biāo)志物等，在疾病的早期診斷中起著至關(guān)重要的作用。 由于缺乏核酸擴(kuò)增類似的蛋白質(zhì)擴(kuò)增技術(shù)，低豐度蛋白質(zhì)的分析仍然面臨著巨大的挑戰(zhàn)。DNA 步行器在行走的過程中具有信號累積放大的優(yōu)勢，為實現(xiàn)蛋白質(zhì)的靈敏檢測提供了有效的途徑。 Chen 等[22]提出了基于蛋白質(zhì)結(jié)合誘導(dǎo)的鄰近識別和聚合酶驅(qū)動的DNA 步行器策略，用于蛋白質(zhì)的靈敏檢測。 如圖12 所示，設(shè)計兩個DNA 探針分別固定在電極上和作為DNA行走鏈。 蛋白質(zhì)與這兩個探針上標(biāo)記的識別元件的結(jié)合帶來了它們的鄰近雜交， 在DNA 聚合酶存在下， 標(biāo)記有探針的Fc-P3 發(fā)生DNA 聚合，DNA 行走鏈釋放，繼而與相鄰的固定化探針上進(jìn)行雜交，再進(jìn)行聚合酶驅(qū)動的DNA 步行器操作。實現(xiàn)了對蛋白質(zhì)的靈敏識別和選擇性檢測，對地高辛抗體檢測限為80 pmol/L。 因此，該研究為基于DNA 步行器檢測蛋白質(zhì)提供了一種簡單、通用和一步放大的的電化學(xué)發(fā)光方法。 核糖核酸酶H（RNase H）是一種細(xì)胞內(nèi)核糖核酸酶，在細(xì)胞過程中起著至關(guān)重要的作用，尤其與許多疾病過程有關(guān)。 Wang 等[23]提出了一種新的基于RNaseH驅(qū)動的DNA 步行機(jī)的信號放大策略， 用于特異和靈敏的RNaseH 活性檢測。 該方法已成功地用于復(fù)雜環(huán)境中RNaseH 活性的檢測和相關(guān)抑制劑的篩選。 因此，RNaseH 驅(qū)動的DNA 步行器為RNaseH 活性檢測提供了一個新的平臺。

圖12 基于DNA 步行器的生物傳感器對抗地高辛抗體檢測原理示意圖Fig.12 Schematic diagram of the DNA walkers based biosensor for anti-dig antibody.Copyright 2019 Elsevier

2.4 DNA 步行器在霉菌毒素分析中的應(yīng)用

霉菌毒素是真菌界生物產(chǎn)生的一種有毒次生代謝物。 它可以污染各種食物，導(dǎo)致食物急性中毒，嚴(yán)重的將導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。 將DNA 步行器引入到生物傳感器的構(gòu)建中，適合于真菌毒素的快速、靈敏分析。 通常霉菌毒素的檢測是利用相應(yīng)的適體作為分子識別元件，可以將霉菌毒素分析轉(zhuǎn)化為相應(yīng)核酸檢測。赭曲霉毒素A 是毒性最大、分布最廣、產(chǎn)毒量最高、對農(nóng)產(chǎn)品的污染最重、與人類健康關(guān)系最為密切，是繼黃曲霉毒素后又一個引起世界廣泛關(guān)注的霉菌毒素。如圖13所示，Zhong 等[24]設(shè)計了多位點錨定的DNA 步行器應(yīng)用于赭曲霉毒素A 的檢測。在目標(biāo)物的存在下可以完成轉(zhuǎn)換形成球型DNA 步行器。 多位點錨定的DNA 步行器可以實現(xiàn)高的局部濃度，提高了反應(yīng)速率，為赭曲霉毒素A 的檢測提供了新的方向。 此外，Zhou 等[25]設(shè)計了一種基于滾環(huán)擴(kuò)增輔助放大的多足DNA 步行器， 用于銅綠假單胞菌的檢測。 基于DNA 步行器構(gòu)建的傳感器可以實現(xiàn)對霉菌毒素的靈敏檢測， 在食品安全、環(huán)境檢測和疾病診斷等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖13 DNA 步行器對赭曲霉毒素A 的檢測示意圖Fig.13 Schematic illustration of the OTA-induced multisite-anchored DNA nanomachines based biosensor.Copyright 2021 ACS

2.5 DNA 步行器在細(xì)胞分析中的應(yīng)用

DNA 步行器除了用于DNA、microRNAs、蛋白質(zhì)和真菌毒素的檢測外，具有強(qiáng)大富集信號能力的DNA 步行器同樣適用于細(xì)胞分析。 Miao等[26]提出了一種基于金納米粒子的多足DNA 步行器用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測。 淀粉樣多肽寡聚物（AβO）被廣泛認(rèn)為是診斷阿爾茨海默病的最有前途的生物標(biāo)志物。 Yin 等[27]設(shè)計了一種三維DNA 步行器，用于在癌細(xì)胞中AβO 的檢測。該策略具有靈敏度高、特異性高、使用方便等優(yōu)點，為阿爾茨海默病的早期診斷提供了廣闊的前景。 此外，Peng 等[28]報道了將整個DNA 步行器構(gòu)建在一個20 nm 的金納米顆粒（AuNP）上，上面修飾有數(shù)百條底物鏈作為軌道鏈，以及幾十個被鎖住保持沉默的DNA 酶分子（圖14）。該DNA 步行器與細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)物相互作用， 激活了DNA 酶分子開始在AuNP 上的自主行走。 基于DNA 步行器的信號放大原理能夠檢測單個癌細(xì)胞中特定的microRNAs。 DNA 步行器為癌細(xì)胞的檢測提供了強(qiáng)有力的工具。 但是進(jìn)一步擴(kuò)大DNA 步行器對臨床樣本的檢測仍然有許多問題需要解決，如DNA 步行器對復(fù)雜樣品的高選擇性，高濃度的細(xì)胞或血清蛋白可能會阻礙DNA 步行器的行走等。

圖14 DNA 步行器對活細(xì)胞中特定microRNAs 的檢測示意圖Fig.14 Schematic diagram of the DNA walkers for the detection of the specific miRNA.Copyright 2017 Springer Nature

3 總結(jié)

DNA 步行器具有結(jié)構(gòu)可控及整合行走過程中的信號等優(yōu)點，在生命分析領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。但是，DNA 步行器未來還有很多地方需要改進(jìn)。比如，DNA 步行器檢測目標(biāo)單一， 難以適用于復(fù)雜生物環(huán)境分析。 此外，生物體內(nèi)各種核酸酶也會對DNA 步行器的檢測造成干擾。總之，DNA 步行器的研究雖然取得了較大的進(jìn)展，但是要克服上述難題還需要科研工作者們不懈的努力。