基于DNA 納米結(jié)構(gòu)的表面增強拉曼生物傳感研究

吳彩駿， 楊 霞

（西南大學化學化工學院， 重慶 400715）

0 引言

散射光中除了與入射光頻率相同的瑞利射線外，還存在與入射光頻率不同并且強度較微弱的射線， 即拉曼（Raman） 散射。 Raman 現(xiàn)象自1928 年[1]被發(fā)現(xiàn)以來，拉曼光譜以其快速檢測、樣品要求少、無損分析以及優(yōu)異的指紋特性等巨大優(yōu)勢，在化學和生物分析方面受到了廣泛的關注。 但是由于大多數(shù)分子與光子作用的截面積僅有約10-30cm2，明顯小于熒光截面，導致其拉曼信號微弱[2]，因此拉曼散射的強度只有入射光強度的10-10左右[3]。 不僅如此，拉曼散射對光源的強度以及單色性要求很高，同時還容易受到熒光或其他污染物質(zhì)的干擾。 這種非常低效的拉曼散射嚴重限制了拉曼技術(shù)的發(fā)展。 直到上世紀60 年代，激光技術(shù)以及光電轉(zhuǎn)換器件的問世為拉曼光譜帶來了曙光， 自此拉曼散射的強度被提高，拉曼散射技術(shù)的應用也更加廣泛了。

在1974 年，F(xiàn)leischman 等[4]首次觀察到粗糙銀電極上吸附的吡啶分子具有較強Raman 散射信號。 1977 年， Jeamaire、 Van Duyne[5]和M. G.Albrecht、Creighton[6]等人驗證了在粗糙銀電極上，每個吡啶分子的Raman 信號平均增強了105～106倍。 這種當分子吸附在粗糙的貴金屬材料表面（如金和銀納米材料）時，分子的非彈性光散射（即拉曼散射） 的程度會大大增強的現(xiàn)象被稱為表面增強拉曼散射 （Surface-enhanced Raman Scattering，SERS）。1979 年，Creighton 等人發(fā)表了一篇關于Ag/Au 膠體表面SERS 的綜述[7]，將金屬膠體的尺寸、材料以及表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR） 的波長與SERS 效應相關聯(lián)。他們證明金屬膠體的SPR 效應會導致巨大的表面增強拉曼效應，將其稱之為等離子體共振增強拉曼。 而且SERS 技術(shù)利用金屬納米結(jié)構(gòu)成功地拓寬散射截面，從而增強少量樣品的拉曼信號強度。

起初，SERS 作為一門小眾學科，僅出現(xiàn)在擁有電化學和拉曼光譜兩方面專業(yè)知識的科學家的視野中，當時在研究拉曼光譜前，需要對光學和激光領域有深入的了解。 1997 年，Shuming Nie等人通過SERS 技術(shù)探測了單個羅丹明6G 分子和單個納米晶體， 證明了SERS 的信號強度非常靈敏，完全可與熒光相媲美[8]。近二十年來，SERS技術(shù)在納米科學和納米技術(shù)方面發(fā)展迅速，比如，SERS 活性納米粒子的合成方法、納米結(jié)構(gòu)不同表面的制備方法以及表征所制備納米結(jié)構(gòu)的分析方法等。 如今，SERS 技術(shù)由于其無損微量檢測，以及強大的指紋特性，現(xiàn)已廣泛應用于痕量分子檢測、 生物分子分析和材料表征等多個領域，并與電化學、催化、生物化學、高分子化學等多個學科聯(lián)用，使得該技術(shù)在單一和多學科中的巨大潛力不斷被開發(fā)。

1 表面增強拉曼散射增強機理

SERS 的增強機理主要包括物理增強 （電磁場增強）[9-11]和化學增強[12-13]。 其中，入射和散射光與金屬納米結(jié)構(gòu)之間的相互作用（即電磁場增強 （electromagnetic enhancement，EM） 機制）是SERS 信號增強的主要來源。 首先，電磁波表面波可以在導電材料和介質(zhì)之間的界面上廣泛傳播。激光作為電磁波（外部驅(qū)動力）的一種，可以激發(fā)金屬中離域的自由電子（等離子體振蕩）使其發(fā)生集體振蕩[14]。 在金屬納米結(jié)構(gòu)中，可以耦合傳導電子振蕩的電磁場振蕩模式產(chǎn)生表面等離子體激元。 它們的特征是在金屬表面處電場明顯增強，而在納米范圍內(nèi)遠離表面時，電場矢量之和卻呈指數(shù)衰減。 大多數(shù)SERS 活性基底是基于貴金屬材料（金，銀，銅等），一方面因為它們化學性質(zhì)穩(wěn)定；另一方面由于它們自身可以發(fā)生d-d 躍遷，使等離子體振動頻率處于可見光區(qū)；最重要的是貴金屬納米材料可以支持表面等離子體激元。 這類能夠支持表面等離子體的納米材料稱為等離子體材料[15]。它們的等離子體激元峰可以在可見光區(qū)域觀察到，因此可被頻率約1014～1015Hz的光激發(fā)而產(chǎn)生共振[11]。 在入射光共振激發(fā)時，入射激光輻射的振蕩電場驅(qū)動金屬表面自由電子發(fā)生振蕩，導致其電荷分離[10,16]（如圖1（a）（b）所示， 電磁輻射與不同金屬納米材料的相互作用）， 該過程可以有效增強分子所在位置的局部電場強度。 這種光的頻率與集體振動的電子的共振頻率耦合時，入射光與貴金屬納米結(jié)構(gòu)相互作用， 使光有效集中于納米結(jié)構(gòu)表面狹窄的空間內(nèi)， 金屬納米粒子表面的自由電子由此產(chǎn)生共振，使得周圍的電磁場顯著改變的現(xiàn)象稱為局域表面等離子體共振 （localized surface plasmon resonance，LSPR）[17-19]。當金屬表面的分析物分子被激發(fā)后，產(chǎn)生的拉曼信號會再次激發(fā)金屬納米結(jié)構(gòu)的LSPR，經(jīng)過多級激發(fā)，遠程光譜儀接收到納米結(jié)構(gòu)局域內(nèi)的分子的SERS 信號顯著增強[20]。

圖1 （a）電磁輻射與金屬納米球相互作用的示意圖。（b）金屬納米棒中電子的橫向和縱向振蕩[10]Fig.1 (a)Schematic diagram of interaction between electromagnetic radiation and metal nanospheres.(b)Transversal and longitudinal electron oscillations in metal nanorods[10]

SPR 效應取決于很多因素， 比如粒子的形狀[21]、尺寸和周圍介質(zhì)的性質(zhì)等[17,22-23]。 研究表明，不同形狀的納米材料中，LSPR 被入射光激發(fā)后，其能量可以集中在納米尺度的特征上（如邊緣、尖端或縫隙），使局部電磁場強度大大提高。除此之外，在電化學粗糙電極表面等非優(yōu)化系統(tǒng)中，由于納米結(jié)構(gòu)表面隨機無序，其SERS 增強因子僅為105，而優(yōu)化過的排列有序、形狀規(guī)則的納米粒子平均SERS 增強因子可達到107。因此具有等離子體特性的納米材料極大地擴展了SERS 的應用[24]。

電磁場的強度與等離子體納米材料的結(jié)構(gòu)形態(tài)、空間排列、介電函數(shù)以及粒子間等離子體耦合等因素有關。 在等離子體材料的納米尖端、粒子本身的納米隙以及粒子間納米隙周圍存在高度局域化的電磁場，被稱為SERS 熱點[25-26]。它廣泛存在于單個等離子體納米結(jié)構(gòu)、耦合等離子體納米結(jié)構(gòu)，與等離子體結(jié)構(gòu)的雜化結(jié)構(gòu)等具有不同性質(zhì)的電磁耦合區(qū)域中[27]。 SERS 熱點通過激發(fā)表面等離子體共振而產(chǎn)生，而且嚴重依賴于納米環(huán)境的幾何參數(shù)[28-29]。 但耦合納米材料的間隙在EM 增強機制中所起的主導作用并沒有被大部分SERS 研究者注意到。 直至1981 年，Metiu團隊計算出了納米球二聚體的局部場增強會隨粒子間距離變化[30]。 1983 年，Metiu 團隊計算了由一個金屬球接近一個平坦的金屬表面組成的結(jié)構(gòu)的局部電磁場增強[31]。 這兩個結(jié)果預測了Au或Ag 納米粒子二聚體或帶有納米間隙的顆粒膜上的等離子體納米結(jié)構(gòu)將是增強SERS 的重要因素。 研究表明，金（銀）納米粒子二聚體和具有粒子間納米隙的低聚體的間隙中存在很強局域電磁場[27,32]，它們的消光光譜和SERS 增強因子強烈依賴于間隙大小[14]。 F.Javier 等人證明了將金納米球二聚體的間隙尺寸從10 nm 減小到2 nm時，SERS 的影響因子會從105增大到109[33]。圖2中展示了不同的耦合等離子體納米結(jié)構(gòu)，電磁場增強主要集中在納米間隙中的熱點區(qū)域，這類材料具有優(yōu)異的SERS 活性， 其SERS 平均強度比單一納米結(jié)構(gòu)高約4 個數(shù)量級。

在集中體系，納米粒子彼此更接近，集體特性明顯，相鄰粒子之間的相互作用可以極大的增強SPR 效應， 從而獲得高強度的SERS 信號[23]。SERS 技術(shù)由于超靈敏單分子檢測， 已經(jīng)成為鑒定、表征、檢測、材料科學和生物分析的強大工具，SERS 拉曼峰的相對強度也被廣泛用于研究被吸附分子的表面構(gòu)型、電荷轉(zhuǎn)移機制、等離子體介導的光催化等領域。

化學增強 （chemical enhancement，CM）[34-35]對SERS 的機理如下。 CM 機制包括：（1）基態(tài)相互作用，如表面絡合作用或化學吸附引起的吸附質(zhì)拉曼極化率增加，并非是共振增強；（2）類共振拉曼過程，這也有助于自由分子或表面絡合物的拉曼極化率變化；（3）通過光子驅(qū)動的電荷轉(zhuǎn)移，在主要具有金屬性質(zhì)的電子態(tài)和主要具有分子性質(zhì)的電子態(tài)之間產(chǎn)生新的共振；（4） 在極負的施加電壓下，由于分子的溶劑化而使靜態(tài)或動態(tài)極化率增大，從而產(chǎn)生富電子的電化學界面。 因此，SERS 的化學增強強烈依賴于分子/物質(zhì)之間的相互作用反映在光電場中電子密度形變的難易程度， 以及被分析物在基底表面的特定位置。然而，這兩種增強機制都需要被分析物分子靠近等離子體表面。因此，將EM 增強和CM 增強機制相結(jié)合，對于SERS 實現(xiàn)超痕量檢測至關重要。

2 表面增強拉曼散射的基底

SERS 中使用的理想等離子體納米結(jié)構(gòu)通常被稱為SERS 基底，這類材料一般化學穩(wěn)定性好，不僅容易重復制備，而且表現(xiàn)出較好的空間均勻性，最重要的是有較高的SERS 增強因子。

（1）金屬納米材料基底

目前SERS 基礎研究中， 貴金屬材料被廣泛應用于實踐，其中最常用到金和銀納米材料。 因為用波長短能量高的激光激發(fā)時，其自身擁有的離域電子在不同能量范圍內(nèi)發(fā)生帶內(nèi)和帶間躍遷而發(fā)生LSPR，使SERS 極大增強[37]。 經(jīng)過總結(jié)，制備具有較強局域電磁場等離子體納米材料以及擁有豐富熱點的SERS 基底是增強SERS 信號的關鍵。 研究者發(fā)現(xiàn)，金屬納米粒子的形貌和尺寸以及空間結(jié)構(gòu)和排列形式對等離子體特性具有非常大的影響。

由于不同形貌和尺寸的納米粒子具有各向異性， 特別是那些具有尖銳尖端和邊緣的材料，有利于實現(xiàn)更大的電磁場增強。 研究者利用一鍋法合成金納米花，實現(xiàn)了對miRNA 155 的超靈敏檢測[38]。 金納米花不僅具有較大的表面積，而且由于具有鋒利的花瓣而集中電荷來增強電磁場，而且花瓣之間會存在納米空腔，可以極大的增強LSPR。 Li 等[39]制備了金納米立方體，用于谷胱甘肽的靈敏定量檢測，通過立方塊的面之間相互耦合，形成“熱面”，來增強SERS 信號。Xu 等[40]利用超聲聚集誘導法富集金納米棒，利用納米棒聚集后產(chǎn)生的熱點來增強SERS 信號。 除了單一金屬的納米材料，研究者還制備了不同形貌的金/銀納米復合材料，并將拉曼分子放置在金銀納米縫隙中，利用納米粒子內(nèi)部的相互耦合，極大程度的增強LSPR，提升SERS 效應。Ma 等[41]將羅丹明B分子嵌入Au/Ag/Au 雜化納米結(jié)構(gòu)的第一個納米間隙（寬度～1.9 nm）中，并通過添加多層納米間隙進一步提高了SERS 信號。除此之外，研究者還利用種子介導法制備了不同形貌，不同尺寸的金銀納米材料（例如三角納米板[42]，納米島[43]，金銀雜化啞鈴狀納米結(jié)構(gòu)[41]）來制造納米隙或納米空腔，以此來增強電磁場，增強SERS 信號。

除此之外，不同維度（零維、一維、二維和三維）的貴金屬都可以作為SERS 基底。因為金屬表面之間的納米間隙能產(chǎn)生豐富的有效熱點，尤其是當間隙降低到1 nm 以下時，金屬的LSPR 效應表現(xiàn)更加明顯，SERS 的信號將被放大多個數(shù)量級。 零維納米顆粒就是分散在溶液中而獨立存在的納米粒子。 一維金屬納米粒子陣列是利用相鄰納米顆粒結(jié)合，產(chǎn)生熱點，是局域電磁場增強，例如金納米球二聚體（如圖2（a））等。二維金屬納米粒子陣列主要應用于無序納米粒子。 該法通過物理或化學作用，使無序的納米粒子以密集有序的方式排列時，由于集體特性使等離子體共振更明顯，而這種結(jié)構(gòu)的熱點區(qū)域在比表面的分布密度可以最大化，從而提供額外的拉曼增強。 此外，由于減少了損耗（延遲或阻尼效應），二維周期陣列的電磁場效應可以比無序金屬納米顆粒薄膜高幾個數(shù)量級。 目前已經(jīng)有多種制備二維周期陣列的方法，例如，劉洪林教授課題組[44]利用界面能下降在水油兩相界面上自組裝了單層二維金納米球， 這種SERS 基底可以快速捕獲農(nóng)藥分子并定位到等離子體熱點區(qū)域。 三維金屬納米粒子陣列，可以在三維模板上修飾金屬納米粒子或者形成其他更復雜的組裝體， 這些三維SERS 基底為目標分析物的吸附提供了較大的比表面積，并在激光照明區(qū)域內(nèi)提供了密度較大的熱點。 Liu等[45]利用水包油的軟模板法合成了三維銀納米膠來增強SERS 信號。 這類三維材料雖然單個組裝體熱點密集，但依然面臨固體基底的團聚度及咖啡環(huán)效應的難題。

圖2 耦合納米粒子中的熱點區(qū)域，以及金納米粒子SERS 增強分布的有限元仿真模擬（FEM）。 （a）納米球二聚體，（b）納米立方體二聚體，（c）Au@SiO2 核殼納米球二聚體，（d）Au@Pt 核殼納米球二聚體。 （e）金納米顆粒聚集物（左）和低聚物（右）。 （f）金核衛(wèi)星納米結(jié)構(gòu)（左）和金納米棒垂直自組裝（右）。 （g）將Ag 沉積在預組裝的SiO2 或聚苯乙烯球上，制備的納米凸起（左）或納米空陣列（右）。 （h）納米七聚體（左）和納米錐四聚體（右）。 在（e-h）中，白點為吸附拉曼信號分子。 （a-d）引用自文獻[27]，（e-f）引用自文獻[36]Fig.2 Hot spot regions in coupled nanoparticles,and finite element simulation(FEM)of the SERS-enhanced distribution of gold nanoparticles.(a)Nanosphere dimer,(b)nanocube dimer,(c)Au@SiO2 core-shell nanosphere dimer,(d)Au@Pt core-shell nanosphere dimer.(e)Gold nanoparticle aggregates(left)and oligomers(right).(f)Gold core-satellite nanostructures(left)and gold nanorod vertical self-assembly(right).(g)Nanobumps(left)or nanohollow arrays(right)prepared by depositing Ag on pre-assembled SiO2 or polystyrene spheres.(h)Nanoheptamer(left)and nanocone tetramer(right).In(e-h),the white dots are adsorbed Raman signal molecules.(a-d)cited by ref[27]，(e-f)cited by ref[36]

在實踐中，金納米材料最為通用，因為它具有更好的生物相容性，化學性質(zhì)更穩(wěn)定，不易被氧化，以及更廣泛的可用納米顆粒形狀。 而銀納米材料增強效果顯著， 但因其不穩(wěn)定性而受到局限。

除此之外， 過渡金屬也在SERS 基底材料中嶄露頭角，但其增強效果欠佳，該材料常包裹在Au NPs 表面，形成核殼結(jié)構(gòu)來改善自身SERS 增強信號[46]?，F(xiàn)在，越來越多的金屬、金屬氧化物以及金屬雜化納米材料作為SERS 增強基底， 被應用于催化、生物標志物檢測和醫(yī)藥臨床等領域。

（2）半導體材料基底。 近年來，研究者發(fā)現(xiàn)一些半導體襯底表現(xiàn)出優(yōu)異的SERS 效果， 這主要是依賴于襯底與被吸附分子之間的化學相互作用（CM 機制）[13,47]。 與貴金屬基底相比，半導體基底對被測物分子表現(xiàn)出很強的選擇性，可以選擇性地增強非完全對稱的振動模式[12,48]。

由于納米科學和納米技術(shù)的迅猛發(fā)展，很多研究者開始關注半導體增強拉曼散射，并制備了多種半導體材料SERS 活性基底， 例如金屬氧化物，金屬硫化物，金屬碲化物等。 常見的半導體基底有：二氧化硅[49]，主要用于促進干涉增強拉曼散射和制造SERS 波導和微透鏡； 二氧化鈦[50]，因為它具有高化學穩(wěn)定性，高折射率，多功能表面功能化，與等離子體納米粒子的協(xié)同耦合以及優(yōu)異的生物相容性被用于生物傳感和藥物分析；氧化鋅[51]，該納米材料由于表面存在缺陷能級，可以使電荷轉(zhuǎn)移到分子的未占據(jù)態(tài)，從而導致了完全對稱和非完全對稱模式的出現(xiàn)， 可以增強SERS 信號。 這也表明富集的缺陷態(tài)可以有效地促進電荷轉(zhuǎn)移通道和振動耦合，從而產(chǎn)生了較強的SERS 效應；其他還有NiO[52]，CuO[53]，V2O5[54]，ReO3[55]，WxOy[56]，ReS2[57]等半導體材料均被應用于SERS 基底。 雖然SERS 的CM 增強機理還未完善， 但它仍然為如何構(gòu)建基于半導體的SERS傳感器提供了基礎， 而且半導體繼承了SERS 的分子特異性和原位分析能力等優(yōu)點，已經(jīng)被用于一些有前景的應用。

（3）其他納米材料基底。例如，石墨烯，MOFs，聚集誘導有機物，硫化物和雜化納米材料（如金屬/半導體[58]、金屬/石墨烯[59]、金屬/MOFs[60]等）。許多新型等離子體納米材料 （可用EM 機理解釋）可通過調(diào)整納米材料的尺寸、形狀、空間組織、納米粒子自組裝和性質(zhì)等，實現(xiàn)更好的電荷轉(zhuǎn)移或更好地約束電場，從而誘導SERS 增強。新型非等離子體納米材料 （可用CM 機理解釋）能夠更好地促進原子缺陷引起的電荷轉(zhuǎn)移，從而實現(xiàn)SERS 增強，而且這類材料可以解決金屬和半導體無法解決的部分問題， 例如石墨烯對熒光染料[61]（羅丹明，甲苯胺藍等）具有顯著的猝滅作用，這很大程度上消除力熒光對拉曼的干擾。 這類材料擴展了SERS 在材料和生命科學方面的應用。

3 表面增強拉曼散射基底的制備方法

研究者近二十年來探究了很多制備SERS 基底的方法，總體可以分為自上而下策略和自下而上策略，這里介紹幾種典型制備方法。

常見的自上而下制備方法有：（1） 將含納米粒子的溶液滴在硅片等固體基質(zhì)上，干燥后使其固定化。 因為該法操作簡單，檢測快速而被研究者廣泛應用。 但直接沉積的納米粒子通常不會均勻分布，常出現(xiàn)咖啡環(huán)效應[62]，即干燥后的液滴邊緣有明顯的堆積物質(zhì)。 該方法制備的SERS 基底最大的問題在于被測物分子的重現(xiàn)性欠佳，通常需要引入比率法輔助降低背景信號。 （2）利用原子層沉積[63]（如圖3 所示），電沉積，噴濺沉積等沉積技術(shù)將等離子體納米顆粒沉積在硅、石英、多孔氧化鋁等表面上來制備SERS 基底。該方法可以應用于多種表面，可以將等離子體納米材料以單層膜/多層膜的形式均勻的鍍在基底上，使其緊密排列， 增強材料的SPR 效應， 從而增強SERS 信號。 但不足之處在于該法強烈依賴相關高性能儀器，大大限制了它的使用。 （3）模板法，為納米材料的生長提供生長一種主題構(gòu)型，從而控制SERS 基底的均勻程度。 這類基底中納米粒子之間的間距一般都比較大。 （4）刻蝕法，是一種利用化學或物理方法，選擇性去除材料表面的方法，例如采用氧等離子體刻蝕法對聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）靜電紡絲納米纖維進行修飾，以促進銀納米粒子（Ag NPs）的生長，并將表面鍍銀納米粒子的PMMA 納米纖維作為表面增強拉曼散射（SERS）的活性襯底[64]（如圖4 所示）。 這類基底在可控層次結(jié)構(gòu)方面有突出優(yōu)勢。 （5）納米光刻技術(shù)，是一種高度靈活的納米制造方法，它可以控制納米粒子的大小、形狀和粒子間距，使最簡單的結(jié)構(gòu)形成單層周期粒子陣列。 在LSPR 激發(fā)下，金屬尖銳的尖端導致電磁場增強。 其他還有許多制備方法， 例如組裝聚合物/納米粒子，納米陣列，金銀納米球二聚體等。

圖3 不同形式的原子層沉積的單層SERS 基底[63]Fig.3 Different forms of atomic layer deposition of monolayer SERS substrates[63]

圖4 （a）Ag NPs 在PMMA 納米纖維上的示意圖；（b）PMMA 薄膜（上）和Ag NPs 附著在PMMA 薄膜（下）的照片；（c），（d）是Ag NPs 修飾在PMMA 納米纖維膜前后的SEM 圖[64]Fig.4 (a)Schematic diagram of Ag NPs on PMMA nanofibers.(b)Photographs of PMMA film(top)and Ag NPs attached to PMMA film(bottom).(c),(d)SEM images of Ag NPs modified in PMMA nanofiber membrane before and after,respectively[64]

常見的自下而上制備方法有：（1） 液液界面自組裝。 可以在液相種自組裝的材料通常是在溶液中靜電平衡且動態(tài)穩(wěn)定，或者對界面具有可逆親和力，或者具有可以共價結(jié)合的表面配體的納米粒子[65]。 而溶液中的納米粒子是亞穩(wěn)態(tài)的，可以長時間穩(wěn)定懸浮在溶液中，但在儲存或使用過程中，它們會溶解、聚集或沉淀，這會影響納米粒子潛在的等離子體特性和SERS 基底增強。 因此，可以將不同性質(zhì)的配體有效地修飾納米粒子的外表面，改變納米粒子的溶解度以及靜電作用力，精準調(diào)控納米粒子之間的距離，消除其形成界面時的阻礙力，指導納米粒子的自組裝。 設計合理的SERS 增強基底和納米粒子界面穩(wěn)定性時，需要考慮粒子間相互作用以及界面的范德華力、靜電力、溶劑張力和表面配體的協(xié)同貢獻[66-67]。 由于液相界面納米顆粒陣列的均勻性遠優(yōu)于溶膠中的隨機聚集以及固體表面上的固定陣列， 這類自組裝界面可以形成多層次有序結(jié)構(gòu)，集體特性明顯，等離子效應較強，有很好的SERS 增強效果。 而且界面高度有序的納米顆粒陣列更方便、成本更低，同時具有可變性和通用性， 可以確保分析物分子集中在納米間隙中，界面陣列上的液相SERS 正在成為一種有前途的傳感平臺。 Lu 等[68]報道了一種簡單有效的化學交聯(lián)策略， 在Au NPs 表面修飾可聚合分子丙烯酰胺，通過丙烯酰胺的光聚合，在空氣-水界面上制備大規(guī)模單分子層金納米粒子薄膜，其尺寸可智能調(diào)節(jié)，而且易于轉(zhuǎn)移（如圖5 所示）。 Gurunatha等[69]報道了一種使用專門設計的剛性的且具有超強親和力的α-Rep 蛋白對，以它們與金納米粒子的結(jié)合驅(qū)動了大量獨立的單粒子厚膜的膠體定向組裝。 而且這些組裝后的聚集物可以通過自由蛋白質(zhì)的結(jié)合可逆地分解。 該方法可應用于生物傳感、細胞靶向或功能納米材料工程（如圖6）。

圖5 大面積交聯(lián)單層膜的光學、SEM 和TEM 圖片。 （A）-（D）紫外燈照射前，丙烯酰胺未聚合的界面，（E）-（H）紫外燈照射后，丙烯酰胺聚合的界面[68]Fig.5 Optical,SEM,and TEM images of large-area cross-linked monolayer films.(A)-(D)Unpolymerized interface of acrylamide before UV lamp irradiation.(E)-(H)The interface of acrylamide polymerization after ultraviolet lamp irradiation[68]

圖6 由競爭蛋白作為刺激物誘導α-Rep 蛋白對的分解過程的示意圖和透射電鏡圖像[69]Fig.6 Schematic diagram and transmission electron microscope images of the catabolism of α-Rep protein pairs induced by competing proteins as the stimulus[69]

（2）聚合物制備柔性基底法。Sun 等[70]利用白砂糖和軟白糖作為成孔試劑，制備了一種多功能的聚二甲基硅氧烷（PDMS）海綿，并借助3-巰基丙基三甲氧基硅烷（APTMS）在PDMS 海綿上進行多次Ag NPs 沉積，實現(xiàn)SERS 增強，用于檢測表面和溶液中的農(nóng)藥殘留。 Zhang 等[71]用PDMS印章轉(zhuǎn)移單層納米顆粒，并利用金蝕刻劑逐層蝕刻印在硅基板上的金納米粒子膜， 形成高效、均勻的多層表面增強拉曼散射（SERS）基底，系統(tǒng)地研究了納米粒子層數(shù)和蝕刻時間對SERS 基底性能的影響。 研究表明，使用自下而上的化學方法可以實現(xiàn)低成本、大規(guī)模、均勻、高增強因子、低檢測限的SERS 基底。

4 DNA 技術(shù)在表面增強拉曼傳感器中的應用

DNA 除了作為遺傳信息載體和將遺傳密碼翻譯成蛋白質(zhì)的核心角色外，還常被用于組裝界面結(jié)構(gòu)，構(gòu)建納米結(jié)構(gòu)，或者將寡核苷酸探針與被分析的DNA 或RNA 靶點雜交。最簡單的DNA雜交方式是雙螺旋DNA 雙鏈剛性結(jié)構(gòu)， 它的形成是基于Watson-Crick 堿基對互補原則[72]，由腺嘌呤（A）—胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）-鳥嘌呤（G）堿基對間形成氫鍵而組成。 現(xiàn)在，DNA 技術(shù)在生物分析、DNA 計算、DNA 納米技術(shù)和納米醫(yī)學等方面都有廣闊的應用。 DNA 在SERS 生物傳感器中的應用主要集中于核酸信號擴增技術(shù)，和DNA 與納米材料可預測的組裝。

4.1 基于DNA 核酸信號擴增策略

近年來，高靈敏和特異性的核酸檢測在傳染病診斷、microRNA 檢測以及生物醫(yī)學研究等領域應用廣泛。 核酸檢測一般是通過預先設計用來結(jié)合被測目標核酸的互補片段—寡核苷酸信號探針，然后利用對探針的信號的采集，間接檢測目標物。 為了降低目標物的檢測限（LOD），研究者設計了不同信號放大策略，將探針或目標物進行多次循環(huán)， 使探測器獲得放大的被測物信號。最初研究者設計了聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）[73]， 它可以很好的降低DNA檢測的LOD。然而，它需要昂貴的熱循環(huán)器，這限制了它在核酸實際檢測中的應用。 隨著DNA 技術(shù)的發(fā)展逐漸成熟，研究者發(fā)現(xiàn)，可以在恒溫條件下進行生物標記物擴增檢測的等溫擴增技術(shù)，因其操作簡單、檢測快速、類似PCR 的靈敏度、低成本和高能源效率而迅速成為PCR 技術(shù)的替代方法[72]。等溫擴增技術(shù)又分為無酶擴增和酶促反應。 常用的目標物信號無酶擴增技術(shù)有（1）鏈置換擴增 （strand displacement amplification，SDA）。SDA 反應可以在靶標結(jié)合后擴增短靶標識別序列，例如適配體，可與生物傳感器結(jié)合進行分析檢測。 （2）催化發(fā)卡自組裝反應（catalytic hairpin assembly，CHA）。 CHA 作為一種無酶信號增強循環(huán)反應， 通過兩個DNA 發(fā)夾結(jié)構(gòu)在等溫條件下的雜交和置換， 可以將目標物信號放大數(shù)百倍。但由于DNA 發(fā)卡之間的非特異性反應， 導致較高背景信號。 （3） 熵驅(qū)動DNA 鏈置換（entropy drives DNA strand replacement）反應，是通過熵增驅(qū)動的，而不是由新堿基對形成所釋放的自由能驅(qū)動的無發(fā)夾信號擴增策略。 這是一種獨特的驅(qū)動力，在放大過程中，系統(tǒng)的吉布斯自由能保持不變，而且不受酶的干擾，系統(tǒng)中的特異性反應減少， 為準確檢測目標物提供了更可靠的平臺。如圖7 所示，譚蔚弘院士課題組[74]報告了一種基于分子工程的、熵驅(qū)動的三維DNA 放大器，它可以實現(xiàn)對活細胞內(nèi)特定的mRNA 目標物的超靈敏檢測。 除此之外，還有滾環(huán)擴增反應，雜交鏈式反應等方法應用于核酸鏈式雜交循環(huán)來實現(xiàn)目標物信號放大。 但由于無酶反應有一定的非特異性反應而導致背景信號較高，所以酶催化的級聯(lián)放大 （enzyme-catalyzed cascade amplification）反應進入了人們的視線，利用鏈置換聚合酶、核酸外切酶、核酸內(nèi)切酶、切口酶、或雙特異性核酸酶等對目標物進行循環(huán)， 提高檢測靈敏度。 但在SERS 生物傳感器中， 酶這類生物大分子會在吸附在基底材料上而阻礙基底的SERS 增強， 影響目標物的信號。 因此，信號放大策略在傳感器的實際應用中常使二者結(jié)合，經(jīng)過了精心的設計和優(yōu)化，來降低核酸分子檢測的LOD。近幾年，許多課題組成功構(gòu)建了很多基于核酸擴增技術(shù)的SERS 生物傳感器，實現(xiàn)了對多種的生物標志物，miRNA 及金屬離子的靈敏檢測。核酸擴增技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于智能構(gòu)建現(xiàn)代光學納米生物傳感器（例如熒光、SERS、電化學發(fā)光和SPR 等）中。

圖7 （a）熵信標四面體的構(gòu)建和（b）燃料四面體的構(gòu)建；（c）熵驅(qū)動的3D DNA 放大器催化放大信號增強特定mRNA 表達的機制[74]Fig.7 (a)Construction of the entropy beacon tetrahedron module and(b)the fuel tetrahedron module.(c)Mechanism of entropy-driven 3D DNA amplifier catalyzed amplification signal to enhance specific mRNA expression[74]

4.2 基于DNA 結(jié)構(gòu)的納米材料自組裝

由于等離子體在金屬表面附近的局域表面等離子體共振效應可以產(chǎn)生各種新奇的現(xiàn)象和特別的應用，因此它的研究在光學領域中占據(jù)的位置越來越重要。 而DNA 核酸序列利用分子自組裝、堿基配對的特異性識別，可逆結(jié)合以及末端可靈活修飾的優(yōu)勢[75]，不僅可以使有機分子在納米級別精密自組裝，而且可以精確調(diào)節(jié)無機納米粒子在空間中的排列及間距。 因此，越來越多的研究者利用自組裝的DNA 納米結(jié)構(gòu)作為支架來創(chuàng)建高級等離子體結(jié)構(gòu)，并探究這類材料在光學功能的應用。

當兩個金屬納米粒子之間的距離不同時，它們的等離子體激元共振程度不一樣，從而會導致其SERS 信號的改變。 這是由于金屬納米粒子的等離子體共振強烈依賴于周圍介質(zhì)的影響。 在SERS 傳感器中，DNA 結(jié)構(gòu)的作用可以總結(jié)為兩種：（1）通過DNA 雜交調(diào)控拉曼分子與活性基底的距離，以此改變SERS 信號。前文提到金屬表面的LSPR 效應會隨著距離（納米范圍）增加而指數(shù)下降，而發(fā)卡型DNA 可以一端修飾巰基（或者氨基等）固定在金（或銀）納米顆粒上，另一端修飾拉曼分子，當DNA 發(fā)卡結(jié)構(gòu)保留時，拉曼分子貼近SERS 活性基底表面而有強的拉曼信號。 當體系中存在與發(fā)卡DNA 互補的核酸鏈時， 剛性的DNA 雜交雙鏈代替發(fā)卡結(jié)構(gòu)，使拉曼分子在納米層面遠離基底而SERS 信號降低[76]。 除此之外，還可以通過精密調(diào)控核酸鏈的堿基數(shù)或不同的DNA 結(jié)構(gòu)，來調(diào)控拉曼分子與基底之間的具體距離。 （2）通過DNA 結(jié)構(gòu)對等離子體材料的組裝，制備具有集體特性的SERS 基底。 DNA 自組裝對納米粒子的間距和由此產(chǎn)生的間隙大小具有優(yōu)異的控制功能。 制備DNA 組裝的等離子體納米結(jié)構(gòu)一般依賴于金屬納米粒子的功能化， 例如，末端修飾巰基的DNA 可以通過金-硫化學鍵功能化Au NPs， 末端修飾氨基的DNA 可以通過氨基與羧基交聯(lián)，功能化Ag NPs、檸檬酸鹽還原的Au NPs 以及其他有機材料。 如圖8 所示，F(xiàn)an 等[77]利用DNA 互補的特性，將四個金核殼納米材料聚集成環(huán)狀結(jié)構(gòu)， 并通過他們的LSPR 吸收峰模擬了該四聚體的磁共振形成，最終證明該四聚體具有較強的SPR 效應。 而且DNA 結(jié)構(gòu)組裝的納米材料可以通過DNA 的可逆性結(jié)合和釋放，對這類具有集體特性的等離子體選擇性增強或減弱。 但環(huán)境的溫度，溶劑蒸發(fā)以及其他表面效應會導致原本固定的DNA 雙螺旋變形甚至解旋，從而潛在地影響設計的等離子體效應，因此在設計過程中需要仔細考慮和進一步研究。

圖8 （a）硫代DNA 功能化的納米殼與金納米球結(jié)合，可形成密實的五聚物結(jié)構(gòu)的TEM 圖像。 （b）具有類法諾共振的五聚體的兩種模式的消光光譜和表面電荷示意圖[77]Fig.8 (a)Thio-DNA functionalized nanoshells combined with gold nanospheres to form dense pentamers.TEM image of the structure.(b)Schematic diagrams of the extinction spectra and surface charges of the two modes of heteropentamer with Fano-like resonances[77]

DNA 納米技術(shù)為等離子體的組裝方式帶來了前所未有的研究方向。 這種耦合效應不僅提高了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，減少了粒子間距離，還對特性等離子體組合的發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了深遠的影響。 這種利用DNA 功能化的納米材料自下向上組裝方式，可以打破許多傳統(tǒng)制造SERS 基底方法的限制， 推動了納米光子學的發(fā)展。

因此， 通過將SERS 策略與DNA 技術(shù)相結(jié)合， 可以極大程度的改善SERS 技術(shù)的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，構(gòu)建具有突出穩(wěn)定性能的可高效高靈敏檢測生物分子的SERS 傳感平臺。

5 結(jié)論

SERS 生物傳感器與熒光、電致化學發(fā)光、以及電化學生物傳感器相比，有突出的優(yōu)勢，不僅制備過程簡單，而且生物相容性好，靈敏度高，最終重要的是可以無損檢測，這非常有利于細胞內(nèi)生物標志物的檢測。但由于SERS 技術(shù)過于靈敏，極容易察覺到周圍環(huán)境的變化，而生物傳感器中往往牽涉到復雜的生物系統(tǒng)，比如不同DNA 鏈，酶，緩沖液，兩相溶劑等，這往往會改變等離子體材料表面的電場，有時甚至會干擾拉曼分子的檢測。 因此，在往后的研究中，需要重點關注和克服其他分子結(jié)構(gòu)對基底材料的影響。 除此之外，很多拉曼分子常常伴隨熒光現(xiàn)象而對SERS 檢測結(jié)果造成干擾。 雖然金納米材料對熒光具有猝滅作用，但該作用依然受到材料尺寸的約束；半導體材料也只有與被測分子發(fā)生有效的電荷轉(zhuǎn)移時才能猝滅熒光。 因此，需要制備不同結(jié)構(gòu)的SERS活性基底，從原理上減弱熒光干擾。 合理設計更多性能優(yōu)良的SERS 基底， 實現(xiàn)SERS 技術(shù)重現(xiàn)性和靈敏度雙提升， 使SERS 傳感器可以廣泛應用在生物，醫(yī)學，臨床等領域。