光致電化學生物傳感器中信號放大技術(shù)的應用進展

鄧寒梅, 劉圣星

（1. 海南醫(yī)學院，急救與創(chuàng)傷研究教育部重點實驗室，海南?？?570102）

（2. 海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院，海南?？?570102）

0 引言

光致電化學（PEC）是一種將光能轉(zhuǎn)化為電能的現(xiàn)象，在光照下，光電活性物質(zhì)的基態(tài)電子吸收能量后躍遷到激發(fā)態(tài)。 激發(fā)態(tài)電子通過電子調(diào)節(jié)機制發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移，最終形成光電流。 光致電化學生物傳感器是基于光電化學理論發(fā)展起來的分析檢測平臺， 能對某種物質(zhì)進行信號響應，以實現(xiàn)對離子、小分子、蛋白質(zhì)、酶、核酸、微生物和細胞等物質(zhì)的檢測， 可應用于物質(zhì)的定量分析、食品的檢測、環(huán)境的監(jiān)測和生物事件的記錄，在太陽能電池、光能轉(zhuǎn)化相關(guān)器件、光電催化、水質(zhì)分析、大氣監(jiān)測、生物識別、基礎(chǔ)醫(yī)學研究、臨床診療和生物醫(yī)藥相關(guān)的領(lǐng)域具有重要的指導意義[1-5]。 光致電化學生物傳感器結(jié)合了電化學與光學的特點，具有易集成化、微型化、操作簡便、穩(wěn)定性強、分析成本低等優(yōu)勢，引起了研究者們的廣泛關(guān)注。 傳感器主要由光源、識別系統(tǒng)、信號轉(zhuǎn)換器和信號接收元件組成，根據(jù)信號轉(zhuǎn)化方式的不同可以分為半導體生物傳感器、測光型生物傳感器、壓電晶生物傳感器、測熱型生物傳感器和光電化學生物傳感器等[6-8]。 依據(jù)信號輸出方式則可分為陰極光電流和陽極光電流型傳感器。 其中目標物濃度變化引起識別前后的信號變化，這些因素導致的信號變化形成了信號衰減型（signal off）、信號增強型（signal on）、信號增強-衰減-增強型（signal on-off-on）、信號增強-衰減-超級增強型（signal on-off-super on）等模式光致電化學生物傳感器。 通過檢測目標物的類型不同，可以稱為DNA 傳感器、 免疫傳感器、 酶傳感器和細胞相關(guān)的傳感器等[9]。 原理上，光致電化學（PEC）可以看作是電致化學發(fā)光(ECL)的逆過程，電致化學發(fā)光是通過施加電壓，體系中的物質(zhì)進行電子轉(zhuǎn)移發(fā)光以達到檢測光強度。 光致電化學則是利用光激發(fā)物質(zhì)產(chǎn)生電子轉(zhuǎn)移記錄光電流信號，從而實現(xiàn)目標物的檢測。 在整個分析中，研究者們將更多的目光投入到靈敏分析相關(guān)的研究。 信號放大策略能直接影響檢測的靈敏度，其放大效率與傳感器的檢測效果息息相關(guān)。 為了提高檢測的靈敏度，在PEC 傳感器的構(gòu)建過程中開發(fā)各類信號放大技術(shù)來提高信號輸出倍數(shù)，增大了目標物檢測范圍的同時還降低了檢測限。 此外，信號放大策略還極大地增強了生物傳感器的抗干擾能力，并有利于對假陽性信號的篩查。 因此，設(shè)計有效且與分析物相匹配的信號放大策略尤為重要。

1 納米材料信號放大技術(shù)

納米材料是一種催化性能較好﹑比表面積較大和生物相容性較強的材料， 具有小尺寸效應﹑量子尺寸效應﹑表面效應﹑宏觀量子隧道效應和介電限域效應。 在光學、熱學、電學、磁學、力學等方面會有獨特的性質(zhì)，在光致電化學生物傳感器中得到廣泛的應用。 納米材料在光致電化學生物傳感器中可以作為基底材料，由于其比表面積大可用于固載大量生物探針，與生物分子之間有較好的生物相容性和強烈吸附力。 此外，還可通過化學鍵連接生物分子作為橋梁將生物分子連接在電極上。 還可作為生物分子的載體，用來固載抗體﹑核酸﹑酶和光電活性物質(zhì)等。 納米材料本身可以作為光電活性材料產(chǎn)生增強的信號，主要分為有機光電活性材料﹑無機光電活性材料和復合型光電活性材料，某些貴金屬金（Au）、銀（Ag）、鉑（Pt）、鈀（Pd）等或者其他的一些無機納米材料具有很好的催化活性，能通過催化反應在電解質(zhì)溶液中產(chǎn)生電子供受體或沉淀來有效地放大信號。

張春陽課題組[10]首次利用錳模擬酶（MnME）和硫化鉍（Bi2S3）納米棒構(gòu)建了一種用于檢測多核苷酸激酶（PNK）的傳感器（如圖1）。 利用納米棒和金納米粒子作為基底，電極上的捕獲探針能與金納米粒子與錳模擬酶（MnME@AuNPs）復合材料標記的信號探針進行雜交形成雙鏈DNA。在沒有PNK 的情況下， 錳模擬酶能夠刺激催化反應在電極表面生成大量的沉淀物質(zhì)，阻礙電極上的電子轉(zhuǎn)移，得到信號較小的初始信號。 當PNK存在的情況下， 雙鏈DNA 被磷酸化可以被外切酶剪切， 使電極上的MnME@AuNPs 被釋放，產(chǎn)生增強的PEC 信號， 從而實現(xiàn)信號放大檢測目標物。

圖1 基于納米材料放大策略的PEC 生物傳感器示意圖Fig.1 Schematic diagram of PEC biosensor based on the amplification strategy of nanomaterials

2 酶催化放大技術(shù)

酶是一類極為重要的生物催化劑，在生物體中參與各種代謝反應。 在光致電化學生物傳感器中，酶通過催化底物發(fā)生反應，產(chǎn)生電子供受體促進電子傳遞增強光電流信號，或催化產(chǎn)生沉淀來阻礙電子的傳遞使光電流信號顯著降低，從而實現(xiàn)信號放大。常見的酶有葡萄糖氧化酶（GOx）、乙酰膽堿酯酶（AChE）、辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酯酶（ALP）等。 羅細亮課題組[11]利用GOx 和HRP 為生物催化劑構(gòu)建了一種將光陽極與光陰極集成的選擇性增強型PEC 傳感器。如圖2 所示， 過氧化氫通過GOx 催化葡萄糖而產(chǎn)生，在HRP 存在下，能將4-氯-1-萘酚（4-CN）催化氧化生成沉淀物，光電流信號能顯著降低從而達到目標物的靈敏檢測。

圖2 基于GOx 和HRP 生物酶催化放大的PEC 生物傳感器示意圖Fig.2 Schematic diagram of PEC biosensor based on the bio-enzymatic catalyzed amplification of GOx and HRP

梅麗萍團隊[12]合成了AgI/Ag/BiOI 異質(zhì)結(jié)陣列材料， 并在電極上固載HRP 修飾的氯霉素（CAP）適體（HRP-CAP 適體），能原位催化產(chǎn)生沉淀（BPC）（如圖3）。通過引入CAP，適體從電極上釋放出來，同時終止了BCP 反應，光電流信號能得到進一步的恢復從而實現(xiàn)對氯霉素的檢測。這項工作為設(shè)計PEC 適體傳感器開辟了一條新的途徑，對環(huán)境樣品的檢測具有較大的意義。

圖3 基于HRP 生物酶催化放大的PEC 生物傳感器示意圖Fig.3 Schematic diagram of PEC biosensor based on the HRP bio-enzyme catalytic amplification

李念兵課題組[13]基于ALP 催化的磷酸化反應構(gòu)建了“signal on”型光電化學（PEC）生物傳感器用于靈敏地檢測催化活性（如圖4）。 在此實驗中，ALP 可催化L-抗壞血酸2-磷酸三鈉鹽原位產(chǎn)生抗壞血酸，為二氧化鈦（TiO2）和石墨氮化碳（g-C3N4） 納米復合光敏材料提供了電子供體，有效地抑制了電子-空穴復合， 提高了光電轉(zhuǎn)換效率。ALP 活性的檢測限低至0.03 U/L，為血清蛋白的ALP 活性測定提供了新途徑。

圖4 基于ALP 催化的磷酸化反應的PEC 生物傳感器示意圖Fig.4 Schematic diagram of PEC biosensor based on the ALP catalyzed phosphorylation

3 核酸信號放大技術(shù)

核酸放大因能夠?qū)⑽⒘磕繕宋镛D(zhuǎn)化為大量輸出物，顯著提高傳感器靈敏度而受到廣泛的關(guān)注。 核酸放大策略主要包括滾環(huán)擴增 （RCA）放大、鏈置換反應（SDR）、雜交鏈式反應（HCR）、催化發(fā)夾組裝（CHA）放大和剪切循環(huán)放大策略。 一個目標物分子就可以輸出放大N 倍的信號，進而達到高靈敏的檢測目標物分子。 這些放大策略又可分為憑借聚合酶、 內(nèi)切酶、 外切酶、 連接酶、DNA 模擬酶和無酶參與的信號放大策略。

3.1 滾環(huán)擴增

滾環(huán)擴增是一種可以直接擴增DNA 和RNA的典型恒溫擴增技術(shù)。 在酶的催化作用下，能將引物DNA 短鏈復制成環(huán)狀DNA 模版互補的成百上千個重復單元組成的DNA 長鏈。 例如，周云雷課題組[14]利用滾環(huán)擴增技術(shù)提出了一個目標物指數(shù)級放大的策略。 如圖5， 目標物miRNA-319a 作為引物與掛鎖探針雜交，在T4-DNA 連接酶的作用下，形成環(huán)狀模板。 隨后，在DNA 聚合酶以dNTP 為原料的催化作用下啟動RCA 反應，從而得到重復核苷酸序列的DNA 長鏈。 在限制性內(nèi)切酶Nb.BsmI 的輔助剪切下，新一代引物能觸發(fā)新的RCA 反應，得到指數(shù)級擴增的DNA 用于固載大量標記有親和素的堿性磷酸脂酶（avidin-ALP），光電流信號因此明顯增強，靈敏度得到提高。 所設(shè)計的檢測系統(tǒng)具有良好的特異性和靈敏性，為生物分析提供了檢測模型并具有廣泛應用的巨大潛力。

圖5 基于指數(shù)級放大的滾環(huán)擴增策略的PEC 生物傳感器示意圖Fig.5 Schematic diagram of PEC biosensor based on the rolling circle amplification strategy

唐點平團隊[15]設(shè)計了一種基于硫代膽堿（TCh） 溶解的核殼MnO2復合的CdS 納米花（MnO2NF@CdS）和滾環(huán)擴增反應的光電化學傳感平臺用于檢測有機磷農(nóng)藥（如圖6）。 體系中引入目標物馬拉硫磷（malathion）后，適體從磁珠上分離，捕獲的cDNA（帶有引物片段）留在磁珠上，引物片段能觸發(fā)RCA 反應， 形成長鏈DNA（ssDNA）。 通過與S2-Au-BChE 探針雜交，大量的丁酰膽堿酯酶（BChE）被固載在ssDNA 上。 組裝上的BChE 能水解ATCh， 產(chǎn)生大量的TCh，核殼中的MnO2則被還原成Mn2+。與此同時，CdS 納米粒子從核殼中釋放出來，PEC 信號能夠顯著增強。 在最佳條件下，適體傳感器對馬拉硫磷的檢測限低至0.68 pg/mL。 該傳感器平臺表現(xiàn)出良好的特異性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，且該傳感平臺為農(nóng)藥的檢測提供了新的思路。

圖6 基于MnO2NF@CdS 和滾環(huán)擴增放大策略的PEC 生物傳感器示意圖Fig.6 Schematic diagram of PEC biosensor based on the rolling circle amplification strategy and MnO2NF@CdS nanomaterials

3.2 鏈置換反應

在外源物質(zhì)（如：DNA、金屬離子、酶、生物小分子等）作用下，DNA 雙鏈解旋成兩條單鏈，其中的單鏈DNA 與另外一條單鏈DNA 結(jié)合形成更穩(wěn)定的雙鏈DNA 過程為鏈置換反應(SDA)。 鏈置換反應不僅能程序化自組裝，還能建立動力學體系，用于固定軌道行走的DNA 步行器、自組裝的分子齒輪、運動的分子機器人和無外驅(qū)的分子馬達等DNA 器件的構(gòu)建。 最近，陳洪淵團隊[16]報道了一種基于商驅(qū)動裸露端介導的DNA 鏈置換反應， 構(gòu)建了檢測前列腺癌 （PCa） 生物標記物miRNA-141 的PEC 生物傳感器。 如圖7 所示，目標物miRNA-141 通過與三元體的邊緣裸露端互補，進行置換雜交反應，形成中心段裸露的中間體。 磁性分離后，在反應體系中加入足夠的燃料鏈(F)，導致標記金納米粒子（AuNPs）的DNA 鏈被釋放出來并被光敏聚合物點（Pdots）標記鏈所捕獲。 近距離的AuNPs 與Pdots 之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，促使信號降低用以目標物的檢測。 這種熵驅(qū)動裸露端介導的DNA 鏈置換反應為PEC 生物傳感器的無酶檢測開辟了新的方向。

圖7 基于熵驅(qū)動裸露端介導的DNA 鏈置換反應構(gòu)建的PEC 生物傳感器示意圖Fig.7 Schematic diagram of PEC biosensor based on entropy-driven toehold-mediated DNA strand displacement reaction

江婧婧課題組[17]利用β-環(huán)糊精功能化CdS納米棒(β-CD@CdS NR）/WS-2 納米片（NS）異質(zhì)結(jié)構(gòu)作為光電活性材料基底，然后在其表面負載生物素標記的發(fā)夾DNA（Bio-H2）。 如圖8 所示，當目標物microRNA-21 存在下，金剛烷標記的發(fā)夾DNA(ADA-H1)能夠被打開，在DNA 發(fā)夾H2的輔助下能觸發(fā)鏈置換循環(huán)反應（SDR），產(chǎn)生大量的雜交體裸露出標記的生物素。 通過結(jié)合標記有親和素的CuO 猝滅劑，光電流信號顯著降低。該生物傳感器的線性范圍為0.1 fmol/L 至10 pmol/L，檢測限低至25.1 amol/L,對某些癌癥的早期診斷具有非常大的潛力。

圖8 基于(β-CD@CdS NR）/WS-2 納米片（NS）異質(zhì)結(jié)構(gòu)和鏈置換循環(huán)反應（SDR）構(gòu)建的PEC生物傳感器示意圖Fig.8 Schematic diagram of the fabricated PEC biosensor based on the strand displacement reaction(SDR)and(β-CD@CdS NR）/WS-2 nanosheets

俞錦華團隊[18]報道了一種tohold 端介導的鏈置換反應 （TSDR） 用來檢測let-7a， 共軛的ALP@AuNPs-H2 （ALP 和AuNPs-H2 的結(jié)合物）與DNA 單鏈H1 相互雜交，ALP 能夠?qū)⒖箟难?-磷酸酯（AAP）轉(zhuǎn)化為抗壞血酸（AA），催化氧化提供電子，導致Bi2S3材料的光電流信號增強（如圖9 所示）。 引入let-7a 目標物，進行鏈置換反應（SDR）, 經(jīng)過fual DNA 鏈的輔助， 釋放的let-7a能夠參與下一個SDR 循環(huán)過程， 導致AAP 離開電極表面，用于目標物的超靈敏檢測。 傳感器表現(xiàn)出良好的線性度范圍 （0.01 nmol/L～1000 nmol/L），檢測限為6.7 pmol/L。

圖9 基于tohold 端介導的鏈置換反應（TSDR）用來檢測let-7a 的PEC 生物傳感器示意圖Fig.9 Schematic diagram of PEC biosensor based on tohold-medidate strand displacement reaction(TSDR)for the sensitive detection of let-7a

3.3 雜交鏈式反應

穩(wěn)定的發(fā)夾探針通過誘導，交替開環(huán)雜交形成自組裝線性長鏈DNA 的過程稱為雜交鏈式反應。 雜交鏈式反應是一種自助裝的等溫擴增技術(shù)，避免了額外輔助酶的需求，也無需復雜的變溫環(huán)境。 具有易控制、操作簡單、非特異性擴增少等優(yōu)勢，能廣泛應用于各種生物分析。 朱俊杰課題組[19]提出了一種基于超支化雜交鏈式反應的新型光致電化學生物傳感器。 如圖10，當目標物存在時，會觸發(fā)一個催化發(fā)夾自組裝反應并釋放trigger1 鏈，能進一步引發(fā)后續(xù)兩個超支化雜交鏈式反應(HCR1 和HCR2)， 最終形成樹枝狀DNA結(jié)構(gòu)用于結(jié)合hemin/G-四鏈體酶。hemin/G-四鏈體酶催化4-氯-1-萘酚（4-CN）產(chǎn)生沉淀，有效地抑制了光電流信號，可實現(xiàn)目標物RNA 的檢測。這項工作具有背景信號低、穩(wěn)定性好、重復性高、特異性強等優(yōu)點，在生物分析中有巨大的潛力。

圖10 基于超支化雜交鏈式反應的PEC 生物傳感器示意圖Fig.10 Schematic diagram of PEC biosensor based on hyperbranched hybridization chain reaction

3.4 催化發(fā)夾組裝

催化發(fā)夾組裝反應是一種低背景的無酶信號放大技術(shù)。 通過發(fā)夾之間的雜交反應來驅(qū)動DNA 的自組裝， 能啟動數(shù)百倍的催化放大反應。由于可編程性，基于催化發(fā)夾組裝反應構(gòu)建的傳感器在方便、快捷、靈敏的檢測方面具有極大的優(yōu)勢。 此外，催化發(fā)夾組裝可用于特定的信號轉(zhuǎn)換器。如圖11 所示，混旭團隊[20]結(jié)合堿基錯配的催化發(fā)夾組裝循環(huán)反應，以二硒化鎢-半胱氨酸-多巴胺（WSe2/Cys/DA）為納米探針，提出了一種背景信號低的PEC 檢測方法， 實現(xiàn)了檢測限為3.3 amol/L 的超靈敏miRNA-221 分析。

圖11 基于催化發(fā)夾組裝反應的PEC 生物傳感器示意圖Fig.11 Schematic diagram of PEC biosensor based on catalytic hairpin assembly reaction

鞠熀先課題組[21]設(shè)計了一種催化發(fā)夾自主裝（CHA）程序化的卟啉DNA 復合物來觸發(fā)化學發(fā)光作為光致電化學引發(fā)劑（如圖12）。 首先，兩個發(fā)夾H1 和H2 在目標DNA 的引發(fā)下自組裝形成雜交雙鏈H1:H2,然后，固定在修飾有CdS 量子點的捕獲DNA 鏈(C-DNA/CdS)上。 接下來，在DNA 雙鏈的溝壑中嵌入卟啉（FeTMPyP）組裝在雙鏈DNA 支架上形成配合物， 對魯米諾具有很強的催化活性，在不同溫度和堿性條件下氧化生成高穩(wěn)定性的化學發(fā)光。 結(jié)合CHA 的信號放大策略和FeTMPyP 介導的原位化學發(fā)光作為激發(fā)光， 提出了一種用于DNA 檢測的放大光電化學傳感平臺。 在優(yōu)化條件下，該傳感器的線性范圍為5 fmol/L～1000 fmol/L，檢測限為2.2 fmol/L。 此外， 構(gòu)建的光電化學傳感器具有優(yōu)良的選擇性、高穩(wěn)定性和重現(xiàn)性， 不僅拓展了光電化學的應用，而且為生物分析提供了一種新的方法。

圖12 基于催化發(fā)夾自主裝（CHA）程序化的卟啉DNA復合物的PEC 生物傳感器示意圖Fig.12 Schematic diagram of PEC biosensor based on catalytic hairpin assembly(CHA)programmed porphyrin DNA complex

3.5 剪切循環(huán)放大

剪切循環(huán)放大是一種依賴于剪切反應釋放出核酸鏈的循環(huán)過程，通過剪切反應，單鏈核酸從雜交體中分離出來用于后續(xù)的操作。 隨著反復剪切的進行，源源不斷地產(chǎn)生單鏈核酸，最終實現(xiàn)信號放大。 剪切循環(huán)放大主要包括酶剪切循環(huán)放大和無酶剪切循環(huán)放大方法。

3.5.1 酶剪切循環(huán)放大

典型的切割酶有限制性內(nèi)切酶、外切酶和雙鏈特異性核酸酶（DSN）等。其中，限制性內(nèi)切酶能識別特定核酸序列，對特異性位點進行切割。 外切酶是一類從核酸鏈末端開始進行水解消化的酶。 雙鏈特異性核酸酶（DSN） 則能選擇性消化DNA 雙鏈或DNA 與RNA 雜交體中的DNA 鏈。

殷煥順團隊[22]以雙鏈特異核酸酶（DSN）輔助的剪切循環(huán)放大技術(shù)為基礎(chǔ)， 耦合碳量子點（CQDs）與金納米粒子（AuNPs）之間的能量轉(zhuǎn)移（ET）， 研制了一種用于miRNA 超靈敏檢測的新型PEC 生物傳感器。 如圖13 所示，首先，通過發(fā)夾探針 H1的固載，AuNPs 被帶到靠近CQDs@Mo2C 修飾的電極上。 此時，由于CQDs 和AuNPs 之間的能量轉(zhuǎn)移，PEC 信號被猝滅。 在miRNA-159b 存在下， 形成DNA-RNA 雙鏈并解開H1的莖，使AuNPs 遠離電極表面，生物傳感器則切換到“信號開啟”模式。 隨后，只切割DNARNA 雙鏈中DNA 的DSN 酶誘發(fā)剪切循環(huán)，發(fā)夾H1部分堿基被切割， 導致miRNA-159b 的釋放。于此同時，溶液中的miRNA-166a 與發(fā)夾探針H2雜交形成DNA-RNA 雙鏈，經(jīng)過DSN 切割循環(huán)，產(chǎn)生AuNPs 標記的探針。 它能與CQDs@Mo2C 修飾電極上H1剩余的部分序列互補， 將AuNPs 標記的探針連接到電極上， 由于CQDs 和AuNPs之間存在能量轉(zhuǎn)移，PEC 信號再次被猝滅，能夠?qū)iRNA-159b 和miRNA-166a 進行高靈敏度檢測。

圖13 基于剪切循環(huán)放大的PEC 生物傳感器示意圖Fig.13 Schematic diagram of PEC biosensor based on cleavge cycle amplification

3.5.2 非酶剪切循環(huán)放大

某些金屬離子或特異性小分子具有與酶類似的功能，能夠特異性剪切核酸序列且比蛋白酶具有更強的穩(wěn)定性和耐熱性。林璋課題[23]組利用花狀氧化鋅（ZnO）納米材料，研制了一種基于離子剪切循環(huán)放大的光致電化學傳感器。 如圖14所示，采用水熱分解方法在氧化銦錫（ITO）電極上制備了ZnO 納米花， 然后， 用靜電吸附法在ITO/ZnO 電極上組裝DNAzyme。 在Pb2+存在下，DNAzyme 的切割活性被激活， 底物鏈被切割，導致DNA 上的光活性離子Ru（bpy）2（dppz）2+釋放出來，使光電流信號降低達到檢測目的。 結(jié)果表明該傳感器具有靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點。

圖14 基于金屬離子剪切循環(huán)放大的PEC 生物傳感器示意圖Fig.14 Schematic diagram of PEC biosensor based on metal ion-cleavge cycle amplification

4 總結(jié)與展望

目前，PEC 生物傳感器已應用于蛋白質(zhì)、核酸、細胞和微生物等相關(guān)檢測，對疾病的發(fā)現(xiàn)、預防和治療都有很大的幫助。 各種各樣的信號放大策略被引入到生物傳感器中，拓展了光致電化學檢測方法，同時也推動了高靈敏度的傳感器的發(fā)展。 盡管這些年光致電化學得到了蓬勃的發(fā)展，但檢測的靈敏度與準確性仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。 大多數(shù)情況下，信號得到放大的同時，傳感器的背景信號會增加。 因此，進一步開發(fā)新型的、穩(wěn)定的、靈敏度高的、準確性好的光致電化學傳感器吸引了研究者的廣泛關(guān)注。