核酸擴(kuò)增技術(shù)構(gòu)建目標(biāo)物轉(zhuǎn)換策略在電化學(xué)發(fā)光生物傳感器中的研究進(jìn)展

楊 芳， 姚佳爽， 補(bǔ)姝淳， 孟華穎， 卓 穎

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715）

0 引言

核酸擴(kuò)增技術(shù)是一種可使微量核酸高速擴(kuò)增的技術(shù)，自問(wèn)世以來(lái)，被廣泛應(yīng)用于分析生物學(xué)領(lǐng)域。 目前，核酸擴(kuò)增技術(shù)被研究者們不斷改進(jìn)， 在生物傳感領(lǐng)域的研究應(yīng)用不斷走向成熟，成為了一種有力的信號(hào)放大策略。 常見(jiàn)核酸擴(kuò)增技術(shù)主要有雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）、催化發(fā)夾自組裝（CHA）、滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和核酸剪切酶輔助的放大策略等。HCR 是一個(gè)由動(dòng)力學(xué)因素控制的反應(yīng)，具有較高的靈敏度和好的選擇性，并且整個(gè)過(guò)程操作簡(jiǎn)便，不需要酶的參與，可以消除精確控制pH 值、溫度和緩沖介質(zhì)的限制。 在2004 年，Dirks 和Pierce 首次報(bào)道HCR 是一種無(wú)酶的目標(biāo)物誘導(dǎo)的信號(hào)放大策略[1]。 CHA 是另一種無(wú)酶的核酸放大策略，其通過(guò)DNA 雜交（自組裝和去組裝）而不是鏈?zhǔn)椒磻?yīng)完成的。 具體地講，首先設(shè)計(jì)兩個(gè)在室溫下能穩(wěn)定共存的發(fā)夾結(jié)構(gòu)（H1 和H2），然后使用外加的催化分子打破二者的能量平衡形成H1/H2 雙鏈雜交結(jié)構(gòu)，同時(shí)釋放催化分子并進(jìn)行循環(huán)放大反應(yīng)[2]。 RCA 是一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，在環(huán)形模板、引物探針和聚合酶的輔助作用下能實(shí)現(xiàn)多個(gè)互補(bǔ)序列的拷貝，從而在引物探針上延伸并產(chǎn)生一個(gè)長(zhǎng)的單鏈DNA[3-4]。 一般情況下，線(xiàn)性RCA 可以在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)約103倍的擴(kuò)增， 并且隨著共反應(yīng)物的引入，其擴(kuò)增量還可以進(jìn)一步增加。 因此，RCA 被認(rèn)為是一種高靈敏度、 特異性的核酸放大技術(shù)，并且被廣泛應(yīng)用于各種核酸的檢測(cè)中[5-7]。在眾多的核酸信號(hào)放大策略中，PCR 是一種應(yīng)用最廣泛的DNA 體外擴(kuò)增技術(shù)。 其特點(diǎn)在于，PCR 可實(shí)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物的指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)[8-9]。 典型的PCR 過(guò)程由三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：（1） 高溫條件下模板DNA 的變性；（2） 模板DNA 與引物鏈的退火（復(fù)性）；（3）以dNTPs 為反應(yīng)原料，在聚合酶的作用下，引物沿模板延伸；上述三步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán)， 通過(guò)多次循環(huán)反應(yīng)，使目標(biāo)DNA 得以迅速擴(kuò)增。 近年來(lái)，核酸擴(kuò)增技術(shù)成功應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感器的研究工作已得到廣泛報(bào)道，所構(gòu)建的生物傳感器的靈敏度不斷提高，甚至達(dá)到單分子檢測(cè)水平。 核酸擴(kuò)增技術(shù)的成功應(yīng)用促進(jìn)了生物傳感的發(fā)展同時(shí)為更靈敏、高效的生物分子檢測(cè)提供了新的思路。

1 電化學(xué)發(fā)光生物傳感器

20 世紀(jì)60 年代，Clark和Lyon 首次對(duì)生物傳感器的基本概念進(jìn)行了定義[10]。 自此，生物傳感器進(jìn)入人們的視野并迅速發(fā)展起來(lái)。 進(jìn)入21世紀(jì)，微處理器技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)和信息處理技術(shù)的高速發(fā)展使融合了化學(xué)、生物、材料、計(jì)算機(jī)等多種學(xué)科知識(shí)與技術(shù)的生物傳感器滲透到了環(huán)境保護(hù)、生物工程、疾病診療和食品安全等各個(gè)鄰域。 從豌豆雜交理論的提出，到DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)， 生命科學(xué)一直在不斷地進(jìn)步與發(fā)展，科研工作者們對(duì)生物體系的探究深入到了分子水平，這對(duì)相關(guān)疾病的預(yù)防、診斷和治療具有重大意義。 然而疾病相關(guān)標(biāo)志物在癌癥早期表達(dá)極低， 人們對(duì)分析技術(shù)提出了更高的的要求，使得生物傳感器的發(fā)展面臨著巨大的挑戰(zhàn)。 電化學(xué)發(fā)光生物傳感器（Electrochemiluminescence biosensor） 是以生物活性物質(zhì)如蛋白質(zhì)、DNA/RNA、小分子、離子等作為檢測(cè)對(duì)象,將特異性識(shí)別過(guò)程中產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)換為電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物定量檢測(cè)的分析器件。 它融合了電化學(xué)發(fā)光和生物傳感技術(shù)，與其他傳感技術(shù)相比，ECL 傳感技術(shù)具有靈敏度高、背景信號(hào)低、可控性高和應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，是檢測(cè)一些低豐度的重要疾病標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)疾病早期診斷和治療的可靠平臺(tái)。

2 目標(biāo)物轉(zhuǎn)換策略概述

生物體中的核酸、蛋白質(zhì)、小分子以及離子在復(fù)雜的生命活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用，它們?cè)谏w中的表達(dá)水平與各種人類(lèi)疾?。ㄈ鐞盒阅[瘤、心腦血管疾?。┑陌l(fā)生密切相關(guān)，因此被廣泛用作相關(guān)疾病的標(biāo)志物[11-12]。 如何實(shí)現(xiàn)其高效靈敏的檢測(cè)成為了生物分析領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。 目標(biāo)物轉(zhuǎn)換策略是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)或分子間特異性識(shí)別作用將少量目標(biāo)物轉(zhuǎn)換成大量模擬目標(biāo)物的一種信號(hào)放大技術(shù)。 它的出現(xiàn)和應(yīng)用為疾病標(biāo)志物的分析提供了高靈敏檢測(cè)手段，在疾病標(biāo)志物痕量分析中占據(jù)重要地位[13-16]。

3 核酸目標(biāo)物轉(zhuǎn)換策略及其分析應(yīng)用

核酸是由許多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，為生命的最基本物質(zhì)之一,根據(jù)化學(xué)組成不同，核酸可分為脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。 目前，核酸檢測(cè)的主要方式是利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。 在目標(biāo)核酸存在時(shí)，其與相應(yīng)核酸經(jīng)過(guò)識(shí)別互補(bǔ)誘導(dǎo)核酸擴(kuò)增或DNA 自組裝，之后，少量靶標(biāo)核酸分子轉(zhuǎn)換成與ECL 信號(hào)相關(guān)聯(lián)的模擬目標(biāo)物，以此實(shí)現(xiàn)目標(biāo)核酸的檢測(cè)。

He 等[17]通過(guò)改善自組裝單鏈DNA 探針的位置分布和空間取向， 提高了超支化滾環(huán)擴(kuò)增（HRCA）的效率，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的高效轉(zhuǎn)換（圖1）。 當(dāng)靶DNA 存在時(shí)，HRCA 反應(yīng)啟動(dòng)并快速積累了大量的擴(kuò)增產(chǎn)物，這些擴(kuò)增產(chǎn)物含有不同長(zhǎng)度的雙鏈DNA（dsDNA）片段，然后大量的Ru(Phen)32+作為ECL 指示劑插入dsDNA 片段的溝槽中，輸出強(qiáng)的ECL 信號(hào)。因此，ECL 信號(hào)與擴(kuò)增產(chǎn)物的量呈正相關(guān)， 從而實(shí)現(xiàn)靶DNA 的靈敏檢測(cè)。 該傳感器的檢測(cè)線(xiàn)低至7.6 fmol/L。

圖1 檢測(cè)HPV16 DNA 的ECL 生物傳感器示意圖[17]Fig.1 Mechanism of the ECL biosensor for detecting HPV16 DNA.Coptright 2021 ACS

近年來(lái)，隨著DNA 納米技術(shù)的發(fā)展，DNA 步行器（walker）因其可自主運(yùn)行、方向性強(qiáng)、可編程性等特點(diǎn)成為了信號(hào)放大技術(shù)的寵兒。 Nie 等[18]以DNA walker 作為信號(hào)放大技術(shù)實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的高效轉(zhuǎn)換和檢測(cè)。 如圖2 所示，首先將封鎖的DNA walker 固定在電極表面， 當(dāng)目標(biāo)DNA 存在時(shí)，目標(biāo)物與封鎖鏈互補(bǔ)雜交，此時(shí)，目標(biāo)DNA轉(zhuǎn)化成了DNA walker， 隨后DNA walker 在電極表面行走促使ECL 指示劑離開(kāi)電極表面。檢測(cè)過(guò)程中，ECL 信號(hào)與目標(biāo)物的量呈負(fù)相關(guān)， 以此實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的轉(zhuǎn)換和檢測(cè)。 另外，Lv 等[19]使用目標(biāo)DNA 與兩條DNA 鏈（WD1 和WD2）雜交將目標(biāo)物轉(zhuǎn)換成雙足DNA walker，隨后雙足DNA walker行走在規(guī)則的DNA 軌道上， 它可以有效地提高DNA walker 的行走效率，從而快速取代猝滅探針點(diǎn)亮ECL 信號(hào)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的信號(hào)放大。 該傳感器檢測(cè)限低至0.18 fmol/L（圖3）。

圖2 基于DNA walker 檢測(cè)HPV16 DNA 的ECL 生物傳感器示意圖[18]Fig.2 Schematic diagram of DNA walker-based ECL biosensor for HPV16 DNA detection.Coptright 2020 Elsevier

圖3 基于雙足DNA walkerBCR/ABL 融合基因的ECL 生物傳感器示意圖[19]Fig.3 Schematic diagram of bipedal DNA walker-based ECL biosensor for BCR/ABL fusion gene detection.Coptright 2020 ACS

Micro RNA（miRNA）是一類(lèi)在多種真核生物中調(diào)控基因表達(dá)的小型非編碼RNA[20]。 研究表明,miRNA 參與多種生命活動(dòng)過(guò)程, 包括癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡等[21-22]，是現(xiàn)代分子生物學(xué)用于鑒定多種生物學(xué)和病理學(xué)過(guò)程的重要標(biāo)志物之一。 Jiang 等[23]設(shè)計(jì)了一種新型的DNA 納米機(jī)器用于高效的靶標(biāo)轉(zhuǎn)換并將其用于構(gòu)建miRNA-21 超靈敏檢測(cè)的ECL 生物傳感器。 如圖4 所示，在miRNA-21 存在下，由于局域效應(yīng)，它引發(fā)了定位DNA 級(jí)聯(lián)反應(yīng)（LDCR）并轉(zhuǎn)換成大量模擬目標(biāo)物（二茂鐵標(biāo)記的DNA，F(xiàn)c-DNA）。基于ECL材料與Fc 之間的能量和電子轉(zhuǎn)移，F(xiàn)c 可以有效地猝滅發(fā)光體的ECL 強(qiáng)度，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA-21 的靈敏檢測(cè)。該生物傳感器表現(xiàn)出寬的檢測(cè)范圍 （100 amol/L～1 nmol/L） 和低的檢測(cè)限（10.7 amol/L）。

圖4 （A）DNA 納米機(jī)器的組裝及目標(biāo)物的轉(zhuǎn)換，（B）ECL 傳感器的制備[23]Fig.4 (A)the assembly of DNA nanomachine and target conversion,(B)the preparation of ECL biosensor.Copyright 2019 ACS

Liu 等[24]以紅熒烯納米棒為發(fā)光試劑，以溶解氧為共反應(yīng)試劑構(gòu)建了microRNA-141 生物傳感器，具體過(guò)程如圖5 所示。 值得一提的是，該體系以少量的目標(biāo)物驅(qū)動(dòng)酶輔DNA 循環(huán)放大，輸出大量的鉑納米粒子修飾的DNA 短鏈（S1/PtNPs）作為模擬目標(biāo)物，構(gòu)建了“on-off-super on”的信號(hào)轉(zhuǎn)換模式，為ECL 生物傳感平臺(tái)開(kāi)辟了新的研究方向。

圖5 生物傳感器制備過(guò)程示意圖[24]Fig.5 Schematic illustration of fabrication of the biosensor

除此之外，Liao 等[25]設(shè)計(jì)了外切酶III（Exo III）輔助的級(jí)聯(lián)放大策略實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的雙重轉(zhuǎn)換。 在EXO Ⅲ的輔助下，少量的靶miRNA-21 觸發(fā)級(jí)聯(lián)信號(hào)放大并被轉(zhuǎn)換成大量的次級(jí)靶目標(biāo)物（T2）。 然后T2 能夠打開(kāi)修飾在電極表面的發(fā)夾DNA1 鏈。 隨后， 引入DNA2 和DNA3 觸發(fā)HCR 過(guò)程，形成大量富含AT 的dsDNA。 最后，將Cu2+與富含AT 的dsDNA 孵育后，由于A-Cu2+-T鍵的作用， 在dsDNA 上原位生成了dsDNA 固定的Cu NCs， 從而獲得強(qiáng)的ECL 信號(hào)， 實(shí)現(xiàn)miRNA-21 的靈敏檢測(cè) （圖6， 檢測(cè)限為19.05 amol/L）。

圖6 Exo III 輔助的目標(biāo)物雙重轉(zhuǎn)換[25]Fig.6 Exo III-assisted double conversion of target.Copyright 2018 Elsvier

4 非核酸目標(biāo)物轉(zhuǎn)換策略及其分析應(yīng)用

不同于核酸標(biāo)志物，蛋白質(zhì)、離子和小分子等非核酸標(biāo)志物無(wú)法通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行識(shí)別，進(jìn)而不能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的轉(zhuǎn)換便無(wú)法達(dá)到靈敏檢測(cè)的目的。 但研究者們通過(guò)不斷的探索，開(kāi)發(fā)了適用于非核酸標(biāo)志物的轉(zhuǎn)換策略以實(shí)現(xiàn)其靈敏檢測(cè)。 目前，主要通過(guò)特異性的生物識(shí)別（抗原抗體反應(yīng)和核酸適配體結(jié)合） 或物質(zhì)之間的化學(xué)反應(yīng)構(gòu)建非核酸目標(biāo)物的轉(zhuǎn)換策略。

Lei 等[26]設(shè)計(jì)了一種智能的環(huán)形肽-DNA 納米機(jī)器實(shí)現(xiàn)了抗體的轉(zhuǎn)換和信號(hào)放大。 首先，將特異性抗原肽核酸序列與DNA 鏈交聯(lián)形成捕獲探針（CP），在靶巨細(xì)胞病毒pp65 抗體（anti-CMV pp65） 存在時(shí)，CP 特異性識(shí)別抗體并通過(guò)DNA鄰位觸及作用形成一個(gè)智能的環(huán)形肽-DNA 納米機(jī)器。 然后，在聚合酶和剪切酶的輔助下，環(huán)形肽-DNA 納米機(jī)器可以引發(fā)后續(xù)的級(jí)聯(lián)放大，從而輸出大量的模擬目標(biāo)物。 最后，模擬目標(biāo)物與電極表面的猝滅探針雜交， 使體系的ECL 恢復(fù)。該傳感器的靈敏度低至0.33 fmol/L（圖7）。

圖7 巨細(xì)胞病毒pp65 抗體的轉(zhuǎn)換及檢測(cè)原理示意圖[26]Fig.7 Schematic of the conversion and detection principle of anti-CMV pp65.Copyright 2018 ACS

Jiang 等[27]通過(guò)核酸適體結(jié)合將靶蛋白MUC1轉(zhuǎn)換成MUC1-適體復(fù)合物 （MUC1-A）， 隨后MUC1-A 觸發(fā)催化發(fā)夾自組裝（CHA）反應(yīng)，使得標(biāo)記有發(fā)光體ABEI 的DNA 鏈固定在CoFe2O4材料表面。 最后，電極表面的S1 鏈捕獲S2 修飾的CoFe2O4產(chǎn)生強(qiáng)的ECL 信號(hào)。 該傳感器的檢測(cè)范圍為1 fg/mL～1 ng/mL， 檢測(cè)限低至0.62 fg/mL（圖8）。

圖8 （A）目標(biāo)物MUC1 的轉(zhuǎn)換策略，（B）ECL 生物傳感的構(gòu)建[27]Fig.8 (A)Target MUC1 conversion by protein-aptamer binding complex,(B)the construction of the ECL biosensor.Copyright 2017 ACS

Zhao 等[28]利用核酸適配體識(shí)別內(nèi)毒素（LPS）引起二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化， 然后觸發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）， 隨著RCA 的進(jìn)行，LPS 又被釋放出來(lái)觸發(fā)下一循環(huán)， 從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物循環(huán)同步RCA 信號(hào)放大策略。利用RCA 產(chǎn)生的富G 堿基DNA 序列與卟啉鐵， 形成卟啉鐵/G-四鏈體核脫氧核糖核酸酶（hemin/G-quadruplex DNAzymes）可以有效地猝滅MoS2量子點(diǎn)/TPrA 體系的ECL 信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)LPS 的高靈敏檢測(cè)（如圖9 所示）。由于目標(biāo)物循環(huán)與RCA 同步進(jìn)行， 簡(jiǎn)化了檢測(cè)操作的同時(shí)，還有效地提高了信號(hào)放大效率。 該ECL 適體傳感器展現(xiàn)出寬的檢測(cè)范圍0.1 fg/mL～50 ng/mL，檢測(cè)限低至0.07 fg/mL。

圖9 基于目標(biāo)物循環(huán)同步滾環(huán)擴(kuò)增的ECL 適體傳感器用于LPS 檢測(cè)的原理示意圖[28]Fig.9 (A)Schematic illustration of the ultrasensitive “onoff”ECL aptasensor for LPS Detection based on aptamer recognition-driven target-cycling synchronized RCA:(A)Preparation process of MoS2@Pd-Au.Copyright 2017 ACS

同樣，利用核酸適體結(jié)合，Lei 等[29]實(shí)現(xiàn)了Hg2+的特異性檢測(cè)。 目標(biāo)Hg2+的引入能夠使富含胸腺嘧啶（T 堿基）的柔性單鏈通過(guò)特異性的THg2+-T 作用折疊形成“duplicator-like”的DNA 機(jī)器， 隨后在酶的輔助下引發(fā)鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)將Hg2+轉(zhuǎn)換成大量的模擬目標(biāo)物。 產(chǎn)生的模擬目標(biāo)物進(jìn)一步在電極表面上引發(fā)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)得到富鳥(niǎo)嘌呤（C 堿基）的長(zhǎng)的DNA 片段，該片段能夠通過(guò)C-Ag+-C 作用富集Ag+。Ag+作為共反應(yīng)促進(jìn)劑能夠增強(qiáng)PTCA/S2O82-體系的ECL 信號(hào)強(qiáng)度，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+的靈敏檢測(cè)（圖10，檢測(cè)限低至0.33 fmol/L）。

圖10 Hg2+的轉(zhuǎn)換策略和ECL 傳感器的構(gòu)建[29]Fig.10 Target Hg2+conversion by SDA and the construction of the ECL biosensor.Copyright 2018 ACS

除了T-Hg2+-T、C-Ag+-C 這一類(lèi)固定堿基與金屬離子的特異性結(jié)合之外，一些特定核酸序列在存在相匹配的金屬離子時(shí)， 能夠激活酶活性，即所謂的核酶（ribozyme）/脫氧核酶（DNzyme）。利用這些酶的活性，可以將金屬離子的濃度信息轉(zhuǎn)化為核酸信號(hào)，并通過(guò)DNA 信號(hào)放大策略，實(shí)現(xiàn)金屬離子的高靈敏檢測(cè)。 Lei 等[30]利用Cu2+激活的DNzyme 剪切DNA 的活性， 構(gòu)建了ECL 生物傳感器實(shí)現(xiàn)Cu2+的超靈敏檢測(cè)。具體原理如圖11所示， 脫氧核酶DNA 與標(biāo)記有猝滅探針的底物DNA 的復(fù)合物通過(guò)自組裝修飾在電極界面，Cu2+的存在能夠激活DNA 剪切，將底物DNA 剪切為兩段DNA 片段，從而使猝滅探針離開(kāi)電極界面，而Cu2+能夠進(jìn)入下一循環(huán)繼續(xù)剪切其它底物DNA 并釋放猝滅探針，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Cu2+的信號(hào)放大。 最終， 大量的ECL 猝滅探針離開(kāi)電極界面，ECL 信號(hào)完成off-on 的轉(zhuǎn)換， 由于DNA 信號(hào)放大的作用，該ECL 生物傳感器對(duì)Cu2+檢測(cè)的靈敏度顯著提高，檢測(cè)限低至0.34 pmol/L。

圖11 PTCA-S2O82-體系應(yīng)用于ECL 生物傳感器用于Cu2+的原理示意圖[30]Fig.11 Schematic illustration of the preparation procedure of the Cu2+-specific DNAzyme‐based ECL biosensor for Cu2+detection

盡管核酸適配體展現(xiàn)了廣泛的應(yīng)用前景，但它的篩選過(guò)程復(fù)雜，人力、財(cái)力和時(shí)間耗費(fèi)大，篩選的成功率不盡如人意。 因此，目前有效可用的核酸適配體還非常有限，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足臨床及市場(chǎng)上的需要。 最近，研究者們提出了將特異識(shí)別位點(diǎn)標(biāo)記到核酸分子，基于此實(shí)現(xiàn)抗體蛋白的目標(biāo)物轉(zhuǎn)換與靈敏檢測(cè)。 如圖12 所示，Yang 等[31]報(bào)道了一個(gè)將抗地高辛球蛋白（anti-Dig）通過(guò)抗體驅(qū)動(dòng)的三聯(lián)DNA 納米機(jī)器轉(zhuǎn)換為DNA 鏈，從而進(jìn)一步參與酶驅(qū)動(dòng)的鏈置換循環(huán)反應(yīng)，以獲得傳感器的ECL 信號(hào)放大，成功地實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)蛋白anti-Dig 的檢測(cè)，其檢測(cè)限為6.7 pmol/L。

圖12 anti-Dig 檢測(cè)過(guò)程的示意圖[31]Fig.12 Schematic illustration of production process for sensitive detection of anti-Dig

如圖13 所示，Ge 等[32]基于谷胱甘肽（GSH）與MnO2之間的氧化還原反應(yīng)將GSH 轉(zhuǎn)換為Mn2+。 然后，Mn2+作為模擬目標(biāo)物觸發(fā)DNAzyme輔助的循環(huán)擴(kuò)增。 之后， 擴(kuò)增產(chǎn)物S3 激活DNA分子機(jī)器并在剪切酶的輔助下使H1 發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變形成了大量的鏈霉親和素（SA）適配體。 最后，SA 適配體與標(biāo)記有SA 的發(fā)光體特異性識(shí)別輸出強(qiáng)的ECL 信號(hào)。該生物傳感器表現(xiàn)出優(yōu)異的檢測(cè)性能 （檢測(cè)范圍為1～200 μmol/L， 檢測(cè)限為0.44 μmol/L）。

圖13 （A）GSH 的轉(zhuǎn)換策略，（B）模擬目標(biāo)物Mn2+觸發(fā)DNAzyme 輔助的循環(huán)擴(kuò)增，（C）傳感器的檢測(cè)原理[32]Fig.13 (A)The conversion of GSH,(B)Mn2+-Induced DNAzyme Recycling Amplification,(C)the work principle of biosensor.Copyright 2019 ACS

5 展望

ECL 生物傳感器在生物分子檢測(cè)領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)越性和廣闊的應(yīng)用前景，受到研究人員的廣泛關(guān)注，已逐漸成為當(dāng)前生命分析領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。 隨著更多核酸擴(kuò)增的目標(biāo)物轉(zhuǎn)換策略的提出和納米技術(shù)的發(fā)展，高靈敏和高特異性生物傳感器被逐漸開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。 雖然核酸擴(kuò)增技術(shù)推動(dòng)了ECL 生物傳感的發(fā)展和革新，但在大多數(shù)情況下，ECL 傳感檢測(cè)的對(duì)象僅限于體外樣品，無(wú)法靈敏準(zhǔn)確獲取細(xì)胞內(nèi)一些生物分子的信息。 今后，性能更穩(wěn)定、功能更多樣、普適性更高的核酸擴(kuò)增技術(shù)的設(shè)計(jì)以及微型化、 多通量的ECL 生物傳感器的開(kāi)發(fā)將會(huì)是傳感領(lǐng)域的研究發(fā)展方向。