膿毒癥致心肌損傷模型的研究進(jìn)展

杭成文 崔鳴

100191 北京大學(xué)第三醫(yī)院心內(nèi)科

膿毒癥是機(jī)體對感染的反應(yīng)失調(diào)而引起器官功能障礙的一種致命綜合征。膿毒癥所致心功能不全是膿毒癥患者死亡率上升的主要原因之一，膿毒癥導(dǎo)致心肌損傷(sepsis-induced myocardial injury，SIMI)是膿毒癥主要表現(xiàn)之一，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且不明確，臨床上亦無統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)和特異性療法。因此，建立SIMI模型來研究發(fā)病機(jī)制并開發(fā)治療藥物顯得格外重要。目前，已經(jīng)建立了多種SIMI的模型，在體動物模型研究已經(jīng)相對成熟；近年來，離體細(xì)胞模型，如原代剝離心肌、心肌細(xì)胞系、人多潛能干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞(cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells，hPSC-CMs)，也逐漸受到大家的關(guān)注。本文將對SIMI的機(jī)制、模型及其特點(diǎn)進(jìn)行綜述，為優(yōu)化和選擇SIMI模型提供參考依據(jù)。

1 SIMI的發(fā)病機(jī)制

1.1 炎性損傷

膿毒癥時，機(jī)體通過內(nèi)源性與外源性的炎癥反應(yīng)造成心肌損傷。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可以與心肌細(xì)胞表達(dá)的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR 4)結(jié)合，導(dǎo)致心肌細(xì)胞產(chǎn)生多種促炎因子，如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)等。同時，機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的大量炎性細(xì)胞因子，通過血液系統(tǒng)到達(dá)心臟，內(nèi)源與外源兩方面造成心肌過度炎性損傷[1](圖1)。

1.2 線粒體損傷

線粒體穩(wěn)態(tài)對于心肌細(xì)胞功能維持尤為重要，而膿毒癥發(fā)生時心肌細(xì)胞中線粒體分裂、融合失衡及線粒體氧化磷酸化受損，ATP合成減少[2]。另有研究發(fā)現(xiàn)，LPS可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞線粒體活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成，誘導(dǎo)肌漿網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，致使心臟功能下降[3]。

1.3 細(xì)胞凋亡

心肌細(xì)胞凋亡在SIMI中發(fā)揮著重要作用。膿毒癥時心肌細(xì)胞由于ROS、細(xì)胞因子等激活caspase9依賴的內(nèi)源性凋亡通路，同時TNF-α與相應(yīng)受體結(jié)合激活caspase8依賴的外源性凋亡通路，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡增多，而針對凋亡的干預(yù)可緩解膿毒癥心肌損傷[4]。

LPS：脂多糖；ROS：活性氧；RNS：活性氮；TNF：腫瘤壞死因子；IL：白細(xì)胞介素；LTCC：L型鈣通道；SERCA2a：鈣離子ATP酶2a；Disorder Ca2+ cycle：鈣循環(huán)紊亂；NCX：鈉鈣交換體；RYR：斯里蘭卡堿受體；TOLR：Toll樣受體；Myd88：髓樣分化因子88；NF-κB：核因子-κB；unbalanced fusion/fission：分裂融合失衡；Caspase：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶；FAS：死亡受體；FAS-L：死亡受體的配體；TNFR：腫瘤壞死因子受體；iNOS：誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；Apoptosis：凋亡圖1 SIMI的主要機(jī)制

1.4 鈣循環(huán)紊亂

Ca2+是興奮收縮偶聯(lián)的重要離子，心肌細(xì)胞 Ca2+活動受肌漿網(wǎng)斯里蘭卡堿受體(ryanodine receptor，RYR)、肌漿網(wǎng)鈣離子ATP酶2a(sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase，SERCA2a)和細(xì)胞膜L型鈣通道(L-type calcium channel，LTCC)及Na+/Ca2+交換的調(diào)節(jié)。膿毒癥中，由于LTCC過度的Ca2+內(nèi)流以及Na+/Ca2+交換的抑制，可觀察到心肌細(xì)胞鈣循環(huán)紊亂，細(xì)胞處于鈣超載的狀態(tài)[5]。研究也表明，鈣通道阻滯劑能改善膿毒癥預(yù)后[6]。

2 SIMI動物模型

目前，SIMI動物模型的研究與應(yīng)用已經(jīng)相對成熟。制備SIMI的動物模型主要有三種方法：宿主屏障破壞，毒素注射和病原體注射。

2.1 宿主屏障破壞模型

盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(cecal ligation and puncture，CLP)即通過人為的盲腸結(jié)扎和穿刺誘發(fā)多菌性腹膜炎，動物會出現(xiàn)典型膿毒癥癥狀。在此膿毒癥模型基礎(chǔ)上，通過超聲、血液學(xué)檢測等方法，篩選出心肌損傷的動物，用于SIMI研究。

2.2 毒血癥模型

2.2.1 LPS注射 LPS是G-菌細(xì)胞壁的主要成分。研究顯示，LPS可以激活心肌細(xì)胞炎癥通路，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，進(jìn)而造成心肌損傷[3，7]。研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射LPS后，小鼠心肌組織中炎性細(xì)胞浸潤，促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)升高，心臟收縮功能障礙[8]。使用藥物抑制炎癥相關(guān)通路，可改善LPS所致的心肌損傷和心肌功能障礙[7]。

2.2.2 外毒素注射 白喉毒素是一種多肽外毒素，通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用侵入細(xì)胞，抑制延伸因子2的活性，并導(dǎo)致DNA斷裂和細(xì)胞溶解[9]。中國學(xué)者給小白鼠尾靜脈注射白喉毒素，建立了白喉毒素誘導(dǎo)的心肌損傷模型，但此動物模型生存期僅約3 d[10]。M?nn等[11]向CD11c.DTR轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔注射白喉毒素，發(fā)現(xiàn)小鼠心臟組織大量炎性浸潤及心肌細(xì)胞溶解破壞，4～5 d內(nèi)發(fā)生爆發(fā)性心肌炎及致命性心律失常。因此，白喉毒素所致的小鼠心肌損傷多為急性重癥病變，實(shí)驗(yàn)動物生存時間短，故很大程度上限制其使用。

3 SIMI細(xì)胞模型

膿毒癥是一種系統(tǒng)性的疾病，涉及機(jī)體復(fù)雜的免疫網(wǎng)絡(luò)，目前在細(xì)胞水平上，難以構(gòu)建膿毒癥模型，只能復(fù)制膿毒癥某一階段的發(fā)展過程。LPS是目前普遍被認(rèn)可的膿毒癥細(xì)胞模型誘導(dǎo)劑，在構(gòu)建SIMI細(xì)胞模型時得到廣泛應(yīng)用。

3.1 原代心肌細(xì)胞模型

Hobai等[12]發(fā)現(xiàn)成年大鼠心室肌細(xì)胞(ARVM)長時間暴露于LPS，會通過影響Ca2+循環(huán)來抑制心肌細(xì)胞的收縮。同樣，也有研究表明LPS可以通過激活PKA通路來誘導(dǎo)新生大鼠原代心室肌細(xì)胞(NRCM)的凋亡[13]，提示原代心肌細(xì)胞是SIMI潛在的細(xì)胞模型。此后，Yang等[14]利用此模型研究發(fā)現(xiàn)SO2對LPS誘導(dǎo)的心肌損傷具有保護(hù)作用，為尋找SIMI的治療方法提供參考依據(jù)。

3.2 心肌細(xì)胞系模型

3.2.1 大鼠心室H9c2細(xì)胞株 1976年，Kimes等[15]從胚胎期BDIX大鼠心室組織中獲得可以體外培養(yǎng)增殖的H9c2心肌細(xì)胞株。H9c2心肌細(xì)胞可以傳代分化，在低血清培養(yǎng)基中向骨骼肌分化，而在維甲酸誘導(dǎo)下則呈現(xiàn)心肌細(xì)胞表型，但此株細(xì)胞即使分化，依然缺乏心肌細(xì)胞樣的節(jié)律性搏動。研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞在LPS處理下出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，為利用H9c2細(xì)胞建立SIMI模型提供基礎(chǔ)。此后研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖通過下調(diào)miR-127、大黃素通過下調(diào)miR-223的表達(dá)來改善LPS誘導(dǎo)的心肌損傷，提示microRNA可能是SIMI治療的一個重要靶點(diǎn)[16]。

3.2.2 小鼠心房HL-1細(xì)胞株 1998年，Claycomb等[17]從小鼠心房肌細(xì)胞腫瘤譜系中衍生出一株可以連續(xù)傳代增殖的HL-1細(xì)胞株，其具有心肌特異性表型，并在保持成年小鼠心房肌細(xì)胞特性的同時進(jìn)行分化。Yuan等[18]發(fā)現(xiàn)HL-1細(xì)胞暴露于LPS，可以通過ROS的產(chǎn)生激活心肌細(xì)胞的凋亡；同時，LPS還可以導(dǎo)致HL-1細(xì)胞動作電位時程延長，這些研究對于揭示SIMI的發(fā)病機(jī)制有重要意義。

3.2.3 人AC16細(xì)胞株 AC16心肌細(xì)胞是將人心室肌組織與SV40轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞進(jìn)行融合而獲得的永生化的人心室肌細(xì)胞系，可以反復(fù)凍融傳代，在特定培養(yǎng)基中可以進(jìn)行分化[19]。AC16細(xì)胞使用LPS處理后會使細(xì)胞稀疏腫脹，失去原紡錘體形態(tài)，線粒體異常[20]。Tan等[21]的研究也證實(shí)LPS可通過TLR4介導(dǎo)AC16凋亡，表明AC16細(xì)胞建立SIMI模型的可行性。

3.2.4 hPSC-CMs 2007年，Takahashi等[22]利用病毒載體將四個轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入人成體細(xì)胞，使其重編程而得到誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)。這些干細(xì)胞在特定微環(huán)境或小分子誘導(dǎo)劑的作用下[23]，可以向心肌細(xì)胞分化，即hPSC-CMs，這一突破為心血管疾病人源化細(xì)胞模型的建立奠定堅實(shí)基礎(chǔ)。Yücel等[24]用LPS處理hPSC-CMs，6 h后促炎因子和趨化因子產(chǎn)生顯著增多；而處理48 h后抗炎因子開始升高。同時還發(fā)現(xiàn)，LPS影響hPSC-CMs離子通道蛋白表達(dá)，延長動作電位時長，導(dǎo)致心肌細(xì)胞電生理功能異常，證實(shí)hPSC-CMs具有內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)系統(tǒng)，可以用來模擬某些膿毒癥或細(xì)菌感染誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

4 各模型優(yōu)缺點(diǎn)

兩種常用的SIMI動物模型為CLP模型和毒血癥模型。其中，CLP模型利用宿主內(nèi)源性細(xì)菌感染誘發(fā)SIMI的過程，與人類疾病進(jìn)程相似性最高，是目前應(yīng)用最為廣泛的模型。CLP模型和毒血癥模型各有優(yōu)缺點(diǎn)，具體如表1。

常用的SIMI心肌細(xì)胞模型，包括原代心肌細(xì)胞、大鼠H9c2、小鼠HL-1、AC16和hPSC-CMs。其中，人源性心肌細(xì)胞的開發(fā)，尤其是hPSC-CMs的發(fā)現(xiàn)，解決了心肌細(xì)胞來源困難的問題，同時克服種屬差異，其研究方興未艾。SIMI細(xì)胞模型各有優(yōu)缺點(diǎn)，具體如表2。

表1 兩種常用SIMI動物模型比較

表2 多種SIMI細(xì)胞模型比較

5 展望

雖然對SIMI進(jìn)行了廣泛的研究，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，人們對其認(rèn)知尚淺。目前已經(jīng)建立多種SIMI的在體和離體模型，在體動物模型的應(yīng)用和研究已趨于成熟；而隨著多種心肌細(xì)胞系的建立，SIMI細(xì)胞模型研究逐漸增多。尤其是人源心肌細(xì)胞(hPSC-CMs和AC16)的發(fā)現(xiàn)，突破人原代心肌細(xì)胞來源受限和動物種屬差異的缺點(diǎn)，為心血管疾病人源細(xì)胞模型的建立奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ)，而hPSC-CMs因?yàn)槠湓诩膊≡炷?，高通量藥篩和細(xì)胞替代治療方面的優(yōu)勢，將會成為未來研究的熱門。多年來，研究者通過這些模型的應(yīng)用，逐漸揭示SIMI的復(fù)雜機(jī)制，嘗試探究各類藥物，特別是傳統(tǒng)中藥對SIMI的治療作用。但是，這些模型不能完全模擬人體SIMI發(fā)生發(fā)展過程，還需要不斷的優(yōu)化，相信隨著基因編輯、組織工程和3D技術(shù)等的逐漸發(fā)展，將會有越來越多的模型被開發(fā)出來。

利益沖突：無