骨膜蛋白對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的作用研究

孫曉慧 烏宇亮 楊莉 賀靜

710201 西安，長慶油田職工醫(yī)院心血管內(nèi)科(孫曉慧、楊莉、賀靜)；710061 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科(烏宇亮)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病的一種獨(dú)立并發(fā)癥[1]。目前研究認(rèn)為，DCM的發(fā)病機(jī)制可能與代謝紊亂、心肌細(xì)胞肥大與凋亡、心肌纖維化和微血管病變等有關(guān)，其中細(xì)胞凋亡在DCM發(fā)病中起重要作用[2]。骨膜蛋白(periostin，POSTN)主要在成骨細(xì)胞和其衍生細(xì)胞中表達(dá)，刺激成骨細(xì)胞分化、增殖和粘附。POSTN在各種炎癥反應(yīng)、心血管系統(tǒng)疾病及腫瘤病理過程中表達(dá)顯著升高[3]。Guan等[4]報(bào)道，POSTN在糖尿病大鼠心肌組織中表達(dá)顯著上升，在DCM的病變進(jìn)程中發(fā)揮重要功能。但POSTN對(duì)DCM的心肌細(xì)胞凋亡有何影響仍未可知。在本研究中，我們通過高糖誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞，探討POSTN對(duì)其細(xì)胞活性和細(xì)胞凋亡的影響，并初步探討其作用機(jī)制，旨在為DCM的病因機(jī)制研究提供理論依據(jù)，尋求新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

H9c2細(xì)胞系由中國科學(xué)院細(xì)胞庫提供；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國HyClone公司；Lipofectamine 3000和TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒均購自日本TaKaRa公司；CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物有限公司；細(xì)胞裂解液、PMSF和BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物有限公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；兔源POSTN、Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3及GAPDH等一抗購自美國Abcam公司，羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自美國Promega公司。POSTN siRNAs及其陰性對(duì)照siRNA-NC、let-7c mimic及其陰性對(duì)照mimic-NC由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。pGL3-POSTN 3’-UTR、pGL3-POSTN 3’-UTR mut、pcDNA3.1-POSTN質(zhì)粒(pcDNA3.1空載質(zhì)粒作為陰性對(duì)照)由上海生工生物工程股份有限公司構(gòu)建。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 H9c2細(xì)胞置于含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于5%CO2、37℃的條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至約80%～90%的融合狀態(tài)時(shí)傳代或鋪孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。SiRNAs、質(zhì)粒及mimics的轉(zhuǎn)染根據(jù)Lipofectamine 3000的操作說明書進(jìn)行。高糖處理：用33 mmol/L葡萄糖作用于H9c2細(xì)胞24 h。

1.2.2 細(xì)胞分組 將H9c2細(xì)胞按系統(tǒng)隨機(jī)法分為control組(正常培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞)，HG組(33 mmol/L葡萄糖處理24 h的H9c2細(xì)胞)，si-POSTN+HG組(轉(zhuǎn)染si-POSTN 24 h后，33 mmol/L葡萄糖處理24 h的H9c2細(xì)胞)，si-NC+HG組(轉(zhuǎn)染si-NC 24 h后，33 mmol/L葡萄糖處理24 h的H9c2細(xì)胞)，pcDNA3.1-POSTN+HG組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-POSTN 24 h后，33 mmol/L葡萄糖處理24 h的H9c2細(xì)胞)和pcDNA3.1+HG組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 24 h后，33 mmol/L葡萄糖處理24 h的H9c2細(xì)胞)，pcDNA3.1-POSTN組(單獨(dú)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-POSTN質(zhì)粒48 h的H9c2細(xì)胞)和pcDNA3.1組(單獨(dú)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載質(zhì)粒48 h的H9c2細(xì)胞)，mimic-NC組(單獨(dú)轉(zhuǎn)染mimic-NC 48 h的H9c2細(xì)胞)和let-7c mimic組(單獨(dú)轉(zhuǎn)染let-7c mimic 48 h的H9c2細(xì)胞)。

1.2.3 RT-PCR Trizol試劑提取各孔細(xì)胞RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)為cDNA，然后用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)POSTN的mRNA或let-7c水平，分別以GAPDH或U6作為內(nèi)參。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃，10 min；變性95℃，30 s；退火58℃，30 s；延伸72℃，30 s；40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法比較POSTN mRNA或let-7c的相對(duì)變化。

1.2.4 Western blot 細(xì)胞裂解液與PMSF的混合液(100∶1)裂解細(xì)胞15 min，離心收集上清，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。將等量的蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入POSTN (1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、cleaved Caspase-3(1∶1 000)及GAPDH(1∶1 000)等一抗，4℃孵育過夜后加相應(yīng)二抗(1∶10 000)，室溫孵育1 h。用Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描，以GAPDH為內(nèi)參定量各條帶的灰度值。

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性 96孔培養(yǎng)板處理的細(xì)胞，棄去上清液，用PBS沖洗3次，于每孔中加入90 μl DMEM和10 μl CCK-8溶液，將培養(yǎng)板放置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，在酶標(biāo)儀上讀取450 nm處的吸光度(A)值。細(xì)胞存活率(%)=處理組(A)/對(duì)照組(A)×100%。

1.2.6 流式細(xì)胞儀術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 96孔培養(yǎng)板處理的細(xì)胞，棄去上清液，用不含EDTA的胰蛋白酶消化，經(jīng)PBS洗滌、離心后，棄上清液。每孔加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，之后加入10 μl Annexin V-FITC，5 μl PI，避光室溫孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.7 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 將pGL3-POSTN 3’-UTR和pGL3-POSTN 3’-UTR mut質(zhì)粒與let-7c mimic或mimic-NC，連同pRL-TK載體共轉(zhuǎn)染到H9c2細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 抑制POSTN表達(dá)提高H9c2心肌細(xì)胞活性

與HG組或si-NC+HG組比較，轉(zhuǎn)染si-POSTN顯著降低了高糖誘導(dǎo)的POSTN mRNA表達(dá)(1.56±0.21比4.52±0.51或4.95±0.58，均為P<0.05)；與HG組比較，si-POSTN+HG組的POSTN蛋白相對(duì)表達(dá)明顯降低(1.34±0.19比3.40±0.41，P<0.05)；與control組比較，HG組或si-NC+HG組的細(xì)胞活性顯著降低(58.25%±6.90%或53.64%±6.42%比105.79%±12.1%，均為P<0.05)；與HG組或si-NC+HG組比較，si-POSTN+HG組的細(xì)胞活性(77.34%±8.28%)顯著提高(均為P<0.05)，見圖1。

A：RT-PCR檢測(cè)POSTN mRNA水平；B：Western blot檢測(cè)POSTN蛋白表達(dá)；C：CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性。與control組比較，aP<0.05；與HG組或si-NC+HG組比較，bP<0.05圖1 抑制POSTN表達(dá)提高H9c2心肌細(xì)胞活性

2.2 抑制POSTN表達(dá)降低高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，與control組比較，HG組或si-NC+HG組的細(xì)胞凋亡率顯著上升(31.43%±3.98%或33.24%±4.01%比1.12%±0.11%，均為P<0.05)，與HG組或si-NC+HG組比較，si-POSTN+HG組的細(xì)胞凋亡率(17.95%±2.23%)顯著降低(均為P<0.05)。進(jìn)一步在H9c2細(xì)胞中單獨(dú)過表達(dá)POSTN，發(fā)現(xiàn)與control組或pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-POSTN組的細(xì)胞凋亡率顯著升高(10.24%±1.55%比1.23%±0.15%或2.56%±0.34%，均為P<0.05)，見圖2。

2.3 抑制POSTN影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，與control組比較，HG組或si-NC+HG組中Bcl-2蛋白表達(dá)降低(0.53±0.07或0.48±0.06比1.00±0.14)，Bax蛋白表達(dá)顯著升高(3.02±0.38或3.36±0.40比1.00±0.15)，cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)也顯著升高(3.57±0.44或3.68±0.45比1.00±0.14)(均為P<0.05)。與HG組或si-NC+HG組比較，si-POSTN+HG組中Bcl-2(0.81±0.10)蛋白表達(dá)升高，而Bax(1.82±0.21)和cleaved Caspase-3(1.95±0.24)蛋白表達(dá)下調(diào)(均為P<0.05)，見圖3。

2.4 抑制或過表達(dá)POSTN影響高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡

TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡，與control組(6.00%±1.32%)比較，HG組(42.54%±2.60%)、si-NC+HG組(45.43%±4.90%)和pcDNA3.1+HG組(39.23%±5.62%)的細(xì)胞凋亡率均顯著提高(均為P<0.05)，并且數(shù)值相近；與HG組或si-NC+HG組比較，si-POSTN+HG組(18.42%±2.15%)的細(xì)胞凋亡率顯著降低(均為P<0.05)；而與HG組或pcDNA3.1+HG組比較，pcDNA3.1-POSTN+HG組(66.33%±4.34%)的細(xì)胞凋亡率顯著上升(均為P<0.05)，見圖4。

2.5 POSTN是let-7c的一個(gè)靶基因

通過軟件預(yù)測(cè)，POSTN的3’-UTR區(qū)含有l(wèi)et-7c的結(jié)合位點(diǎn)。通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與mimic-NC轉(zhuǎn)染比較，let-7c mimic轉(zhuǎn)染顯著降低pGL3-POSTN 3’-UTR質(zhì)粒的熒光素酶活性(P<0.05)，而對(duì)pGL3-POSTN 3’-UTR mut質(zhì)粒的熒光素酶活性無顯著影響。與control組或mimic-NC組比較，let-7c mimic轉(zhuǎn)染顯著下調(diào)POSTN mRNA表達(dá)(0.33±0.05比1.00±0.14或1.05±0.16，均為P<0.05)，POSTN蛋白表達(dá)也顯著下降(0.40±0.08比1.00±0.13或0.99±0.14，均為P<0.05)。同時(shí)，與control組比較，高糖處理顯著降低了let-7c在H9c2細(xì)胞中的表達(dá)(0.32±0.05比1.05±0.12，P<0.05)，見圖5。

A、B：流式細(xì)胞儀術(shù)檢測(cè)H9c2細(xì)胞凋亡并行統(tǒng)計(jì)；C：RT-PCR檢測(cè)POSTN mRNA水平；D：Western blot檢測(cè)POSTN蛋白表達(dá)；E、F：流式細(xì)胞儀術(shù)檢測(cè)H9c2細(xì)胞凋亡并行統(tǒng)計(jì)。與control組比較，aP<0.05；與HG組或si-NC+HG組比較，bP<0.05；與control組或pcDNA3.1組比較，cP<0.05圖2 抑制POSTN表達(dá)降低高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡

與control組比較，aP<0.05；與HG組或si-NC+HG組比較，bP<0.05圖3 抑制POSTN影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

本研究通過建立高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷模型，發(fā)現(xiàn)33 mmol/L葡萄糖處理H9c2細(xì)胞24 h能夠顯著抑制細(xì)胞活性并增加細(xì)胞凋亡，與此前的報(bào)道[5]一致。而且還發(fā)現(xiàn)，高糖處理顯著上調(diào)了H9c2細(xì)胞中POSTN的表達(dá)，提示POSTN可能參與調(diào)控高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。因此，我們進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)染POSTN的siRNAs抑制其表達(dá)或轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-POSTN質(zhì)粒使其過表達(dá)，以明確POSTN對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞活性和細(xì)胞凋亡的生物學(xué)作用。

Shimoyama等[6]研究表明，POSTN在結(jié)腸炎相關(guān)的結(jié)腸癌中，能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來抑制腫瘤生長。袁東等[7]研究表明，POSTN在氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，而抑制POSTN后能夠降低ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。王雪麗等[8]研究表明，POSTN在瘢痕疙瘩間充質(zhì)干細(xì)胞(keloid mesenchymal stem cells，KMLSCs)中的表達(dá)明顯高于正常皮膚干細(xì)胞，而沉默其表達(dá)后可誘導(dǎo)KMLSCs凋亡并降低增殖能力。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)抑制POSTN表達(dá)后，顯著降低了高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡率，并提高了細(xì)胞活性，而過表達(dá)POSTN后，高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步上升，表明POSTN對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡調(diào)控也具有重要意義。

DCM中心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制比較復(fù)雜，其中線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑具有重要的意義。Bcl-2定位于線粒體外膜并參與調(diào)節(jié)線粒體膜完整性，能夠抑制促凋亡蛋白的作用。而當(dāng)促凋亡因子Bax激活時(shí)，刺激細(xì)胞色素C和其他凋亡線粒體蛋白釋放到細(xì)胞質(zhì)中以觸發(fā)細(xì)胞凋亡。Caspase-3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過程中的終末剪切酶，由細(xì)胞色素C激活的Caspase-9激活后直接引起細(xì)胞凋亡，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者。因此，我們檢測(cè)了Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-3的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)抑制POSTN表達(dá)后，顯著抑制了高糖誘導(dǎo)的Bcl-2下調(diào)，同時(shí)抑制了Bax和cleaved Caspase-3的上調(diào)，表明POSTN能夠通過線粒體凋亡途徑來調(diào)控高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

與control組比較，aP<0.05；與HG組或si-NC+HG組比較，bP<0.05；與HG組或pcDNA3.1+HG組比較，cP<0. 05圖4 抑制或過表達(dá)POSTN影響高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡(×200)

A：雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性；B：RT-PCR檢測(cè)POSTN mRNA水平；C：Western blot檢測(cè)POSTN蛋白表達(dá)；D：RT-PCR檢測(cè)let-7c水平。與mimic-NC比較，aP<0.05；與control組或mimic-NC組比較，bP<0.05；與control組比較，cP<0.05圖5 POSTN是let-7c的一個(gè)靶基因

我們進(jìn)一步探討了POSTN的可能調(diào)控分子。近年來的研究表明，微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一類重要的負(fù)向基因調(diào)控因子[9]。作為高度保守的單鏈非編碼RNAs，miRNAs通過與其靶基因mRNA的3’-UTR結(jié)合而抑制該基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，可調(diào)節(jié)多種疾病(包括DCM)中的細(xì)胞生長、分化和凋亡[10]。通過軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，let-7c與POSTN的3’-UTR之間具有互補(bǔ)序列。經(jīng)過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí)了二者之間的直接靶向關(guān)系，且let-7c過表達(dá)顯著抑制POSTN的表達(dá)，提示let-7c是POSTN的一個(gè)調(diào)控者。Let-7c屬于let-7家族，在癌癥[11]、心臟病[12]及糖尿病相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化[13]的發(fā)展進(jìn)程中均發(fā)揮重要作用，但在DCM中的作用還不清楚。我們檢測(cè)了let-7c在高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)高糖處理顯著降低了let-7c水平，與POSTN的高表達(dá)相反，提示在高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中l(wèi)et-7c可能通過調(diào)控POSTN的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞凋亡。但let-7c在DCM中的作用仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述，POSTN在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，抑制POSTN表達(dá)能夠降低高糖誘導(dǎo)的線粒體凋亡途徑依賴的細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞活性，而POSTN過表達(dá)能夠加劇高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，且POSTN的表達(dá)和功能與let-7c的調(diào)控有關(guān)。本研究為理解DCM中心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制提供了新的依據(jù)，但僅從細(xì)胞模型出發(fā)對(duì)POSTN的功能進(jìn)行了研究，在今后的研究中應(yīng)進(jìn)一步從動(dòng)物模型出發(fā)，以為DCM的臨床防治提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

利益沖突：無