芪歸方有效組分治療特發(fā)性肺纖維化的實驗研究

彭艷芳 張瑩雯 張亞兵

摘要 目的：基于Smurf2串話TGF-β1/Smad信號通路研究芪歸方有效組分對轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）誘導(dǎo)人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5的影響及機(jī)制。方法：體外予以10 ng/mL TGF-β1培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞，PCR儀檢測α-SMA的mRNA水平判斷模型是否成功。設(shè)立正常對照組、模型組（10 ng/mL TGF-β1處理）、潑尼松處理組、芪歸方有效組分高劑量組、中劑量組、低劑量組，采用CCK-8法檢測MRC-5的增殖情況，Western blot檢測各組細(xì)胞Smad7、SnoN蛋白的表達(dá)水平，RT-PCR檢測各組細(xì)胞Smurf2的mRNA水平。結(jié)果：與正常對照組比較，48 h模型組細(xì)胞增殖明顯，α-SMA的mRNA水平增加（P<0.01），造模成功。經(jīng)10 ng/mL TGF-β1處理細(xì)胞MRC-5，與正常對照組比較，Smad7、SnoN蛋白水平顯著降低，Smurf2蛋白mRNA水平升高（P<0.01或P<0.05）。不同濃度芪歸方有效成分處理組細(xì)胞增殖降低，可逆轉(zhuǎn)以上各指標(biāo)的改變，呈一定的量效關(guān)系。結(jié)論：芪歸方有效組分能抑制MRC-5細(xì)胞增殖，可通過減少MRC-5細(xì)胞中Smurf2所介導(dǎo)的Smad7、SnoN的泛素化，恢復(fù)Smad7、SnoN蛋白的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。

關(guān)鍵詞 芪歸方有效組分;Smad泛素化調(diào)節(jié)因子2;Smad蛋白;核轉(zhuǎn)錄共抑制因子;特發(fā)性肺纖維化

Abstract Objective：Based on Smurf2 crosstalk TGF-β1/Smad signaling pathway to study the effect and mechanism of Qigui Fomula active components on transforming growth factor β1 （TGF-β1）-induced human embryo lung fibroblast MRC-5. Methods：MRC-5 was cultured with 10 ng/mL TGF-β1 in vitro， mRNA level of α-SMA was detected by PCR instrument to judge whether the model was successfully made. Normal control group， model group （10 ng/mL TGF-β1 treatment）， prednisone treatment group， high-dose group， middle-dose group and low-dose group of effective components of Qigui Fomula were set， CCK-8 method was used to detect the proliferation of MRC-5， Western blot was used to detect the expression level of Smad7 and SnoN protein in each group， and RT-PCR was used to detect the mRNA level of Smurf2 in each group. Results：Compared with the normal control group， the 48 h model group had significant cell proliferation， and the mRNA level of α-SMA increased （P<0.01）， and the modeling was successful. Compared with the normal control group， MRC-5 treated with 10 ng/mL TGF-β1 showed that Smad7 and SnoN protein levels were significantly reduced and Smurf2 protein mRNA levels were increased （P<0.01 or P<0.05）. The cell proliferation of the Qigui Foluma group with different concentrations was reduced， which could reverse the changes of the above indicators and showed a certain dose-effect relationship. Conclusion：The effective components of Qigui Foluma can inhibit the proliferation of MRC-5 cells， and can reduce the ubiquitination of Smad7 and SnoN mediated by Smurf2 in MRC-5 cells， restore the expression of Smad7 and SnoN proteins， and thereby regulate the occurrence of pulmonary fibrosis development.

Keywords Effective Component of Qigui Foluma; Smad ubiquitination regulator 2; Smad protein;Nuclear transcription co-suppressor; Idiopathic pulmonary fibrosis

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.12.009

特發(fā)性肺纖維化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF）是一種病因不明，以肺泡間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤、成纖維細(xì)胞異常增殖和膠原蛋白沉積為特征的免疫介導(dǎo)的慢性進(jìn)行性纖維化性間質(zhì)性肺炎，好發(fā)于中老年男性，主要表現(xiàn)為干咳、進(jìn)行性加重的呼吸困難，伴限制性通氣功能障礙和氣體交換障礙，導(dǎo)致低氧血癥，患者最終因呼吸衰竭而死亡[1-2]。我國IPF發(fā)病率呈較快上升趨勢，盡管近年來我們對IPF發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識和治療有了一定的進(jìn)展，但目前除了肺移植及長期氧療，尚無療效確切的治療手段，該病給社會、家庭、患者帶來了嚴(yán)重的壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。中醫(yī)藥[3]在防治IPF上的研究亦日趨增多，積累了寶貴的經(jīng)驗，能起到緩解臨床癥狀和減輕患者服用激素等后出現(xiàn)的不良反應(yīng)，顯示了良好的應(yīng)用前景，日益受到國內(nèi)外學(xué)者的重視。

文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，氣虛血瘀是IPF常見的證候特征，益氣活血是該病的基本治法，采用中藥治療IPF的藥物多具有補(bǔ)氣益肺、化痰止咳、活血化瘀等功效，而黃芪、當(dāng)歸及其藥效成分則是相關(guān)研究的熱點，我們前期以芪歸方治療IPF進(jìn)行了臨床和實驗研究[4]，提示芪歸方聯(lián)合潑尼松治療特發(fā)性肺纖維化，可以明顯改善IPF患者癥狀，抑制TNF-α、轉(zhuǎn)化生長因子β1（Transforming Growth Factor β1，TGF-β1）等炎性反應(yīng)因子表達(dá);芪歸方可通過調(diào)控miRNA及其TGF-β1信號通路而改善特發(fā)性肺纖維化。但中藥復(fù)方成分復(fù)雜，不易進(jìn)行質(zhì)控，中藥有效單體成分的藥理作用更明確，故本研究在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)和研究方法的指導(dǎo)下，進(jìn)行體外實驗，以TGF-β1刺激人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5為研究對象，觀察芪歸方有效組分能否通過調(diào)節(jié)Smad泛素化調(diào)節(jié)因子2（Smad ubiquitin regulatory factor2，Smurf2）所介導(dǎo)的Smad7、核轉(zhuǎn)錄共抑制因子SnoN（Ski-related novel protein N）的泛素化，影響TGF-β1/Smad通路繼而發(fā)揮抗肺纖維化作用，為肺纖維化的治療提供新的方向。

1 材料

1.1 細(xì)胞與藥物 MRC-5人胚肺成纖維細(xì)胞使用1株，購自武大細(xì)胞庫。芪歸方有效組分（黃芪甲苷，含量>98%，分子式C41H68O14，分子量784.97;阿魏酸，含量>99%，分子式C10H10O4，分子量194.19）均購自上海哈靈生物科技有限公司，常溫避光防潮保存。

1.2 儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱（3111型，美國Thermo公司）;超凈工作臺（SW-CJ-1D型，蘇州凈化設(shè)備有限公司）;熒光定量PCR儀（CFX-Connect 96型，Bio-Rad公司）;高速冷凍離心機(jī)（Icen-24R型，杭州奧盛設(shè)備有限公司）;超微量分光光度計（Nano-300型，杭州奧盛設(shè)備有限公司）;酶標(biāo)儀（AMR-100型，杭州奧盛設(shè)備有限公司）;倒置熒光顯微鏡（DMIL LED型，Leica公司）;全自動化學(xué)發(fā)光分析儀（Tanon-5200型，上海天能設(shè)備有限公司）;電泳儀（mini protean 3 cell型，BIO-RAD公司）。

1.3 試劑 MEM（Gibco公司，批號：c11095500bt）;胎牛血清（Gibco公司，批號：10270-106）;CCK8（Solarbio公司，批號：CA1210）;TGF-β1（Abcam公司，批號：ab92486）;α-SMA（Bioswamp，批號：PAB35136）;Smad7（Bioswamp，批號：PAB30992）;SnoN（Bioswamp，批號：PAB41857）;Smurf2（Bioswamp，批號：PAB37109）;BCA蛋白濃度測定試劑盒（Solarbio，批號：PC0020）。

2 方法

2.1 TGF-β1誘導(dǎo)人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5肺纖維化模型的構(gòu)建

2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的MEM/EBSS培養(yǎng)基中，加入105 U/L的青霉素和100 g/L的鏈霉素，并置于37 ℃，5%CO2的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5～7 d傳代，以1∶2的比例進(jìn)行。

2.1.2 特發(fā)性肺纖維化模型的構(gòu)建 將MRC-5細(xì)胞以1×105/L的密度分于6孔板，每孔加入2 mL培養(yǎng)基，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞貼壁。正常組換正常培養(yǎng)基，模型組細(xì)胞培養(yǎng)基中加入終濃度為10 ng/mL的TGF-β1，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后收取細(xì)胞樣品。使用TRIzolTM Plus RNA Purification Kit進(jìn)行RNA抽提，測定RNA濃度及純度，并用反轉(zhuǎn)錄試劑Rever Tra Ace Qrcr RT Master Mix按照1 μg/10 μL體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄;之后以GAPDH為內(nèi)參，于qRT-PCR儀檢測α-平滑肌肌動蛋白（α-smoothmuscleactin，α-SMA）的mRNA表達(dá)水平，α-SMA引物：F：GGTGATGGTGGGAATGG，R：CAGGGTGGGATGCTCTT;產(chǎn)物長度187 bp。GAPDH引物：F：CCACTCCTCCACCTTTG，R：CACCACCCTGTTGCTGT;產(chǎn)物長度106 bp。PCR引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

2.2 藥物干預(yù)和分組 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，設(shè)立正常對照組、模型組即10 ng/mL TGF-β1處理組、芪歸方有效組分低劑量組即10 ng/mL TGF-β1聯(lián)合藥物（黃芪甲苷30 μmol/L+阿魏酸20 μmol/L）處理組、芪歸方有效組分中劑量組即10 ng/mL TGF-β1聯(lián)合藥物（黃芪甲苷60 μmol/L+阿魏酸40 μmol/L）處理組和芪歸方有效組分高劑量組即10 ng/mL TGF-β1聯(lián)合藥物（黃芪甲苷120 μmol/L+阿魏酸80 μmol/L）處理組、潑尼松對照組即10 ng/mL TGF-β1聯(lián)合潑尼松1 umol/L處理組。每組設(shè)3個復(fù)孔，加藥后充分混勻，培養(yǎng)48 h。

2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，分于96孔板，3×103個細(xì)胞/孔，每孔100 μL，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞貼壁。按照不同分組處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。取出細(xì)胞培養(yǎng)板，向每孔加入10 μL CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。在酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm處測量各孔的吸光值。同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、CCK8），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解遞質(zhì)、培養(yǎng)基、CCK8），每組設(shè)定3復(fù)孔。計算各組細(xì)胞的相對增殖率。

2.4 Western blot檢測各組細(xì)胞Smad7、SnoN蛋白的表達(dá)水平 將需要抽提的蛋白的細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，吸去培液，適量預(yù)冷的1×PBS洗滌2次，吸去PBS，低溫高速離心，提取上清總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒測定細(xì)胞蛋白濃度。取等量的總蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳，并轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉4 ℃過夜，分別加入1∶1 000稀釋的兔抗Smad7抗體、兔抗SnoN抗體;孵育一抗的膜用PBST洗滌3次，按照1∶10 000稀釋HRP標(biāo)記的二抗，與膜室溫孵育1 h。將膜放置在暗室中，根據(jù)用量取ECL發(fā)光液A和B等量混勻，加在膜的正面與之充分接觸。然后將膜置于全自動化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測，通過TANON GIS軟件讀取相關(guān)條帶灰度值。

2.5 RT-PCR檢測各組細(xì)胞Smurf2的mRNA水平 ?收集各組細(xì)胞，去除培養(yǎng)基;采用TRIzol法提取總RNA，按說明書操作并逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。并溶解于無RNase的水中，將制備好的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Smurf2引物：F：CTCGGTTGTGTTCGTCT，R：CTCCCATTGCGTAGTTC，擴(kuò)增片段大小為279bp;GAPDH引物：F：CCACTCCTCCACCTTTG，R：CACCACCCTGTTGCTGT，擴(kuò)增片段大小為106;擴(kuò)增條件為55 ℃ 2 min;95 ℃ 30 s;95 ℃ 30 s;60 ℃ 60 s，循環(huán)40次;根據(jù)公式2-△△CT計算各組不同目的基因表達(dá)量。實驗重復(fù)3次，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行軟件分析。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件和GraphPad5.0軟件進(jìn)行圖表制作，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 TGF-β1誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞纖維化模型檢測 ? 以10 ng/mL TGF-β1誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞纖維化模型，干預(yù)時間分別為24 h、48 h、72 h，通過實時定量PCR儀分別檢測α-SMA這個特異性纖維化指標(biāo)的mRNA相對表達(dá)水平，比較干預(yù)不同時間的效果差別，結(jié)果如圖1所示：α-SMA的mRNA相對表達(dá)水平在48 h出現(xiàn)顯著升高（P<0.01），在72 h較48 h稍有下降（P<0.01），可見MRC-5細(xì)胞在TGF-β1誘導(dǎo)下48 h時出現(xiàn)充分纖維化，說明48 h時此模型誘導(dǎo)成功。

3.2 各組細(xì)胞增殖情況比較 芪歸方有效組分可抑制TGF-β1刺激引起的MRC-5細(xì)胞增殖，與正常對照組比較，10 ng/mL TGF-β1處理組的細(xì)胞增殖活性明顯提高（P<0.01），表明TGF-β1能夠促進(jìn)MRC-5細(xì)胞增殖;而經(jīng)芪歸方有效組分干預(yù)，與模型組比較，隨藥物濃度增高，MRC-5細(xì)胞增殖活性明顯降低，以中高濃度芪歸方有效組分處理組抑制效果更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明芪歸方有效組分可抑制TGF-β1刺激引起的MRC-5細(xì)胞增殖。見圖2。

3.3 芪歸方有效組分對MRC-5細(xì)胞Smad7、SnoN蛋白表達(dá)的影響 與空白對照組比較，模型組中Smad7、SnoN蛋白表達(dá)明顯減少（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組Smad7、SnoN蛋白表達(dá)則相對增加，并隨芪歸方有效組分濃度的增大而升高，其中以芪歸方有效組分中劑量組改善Smad7及芪歸方有效組分高劑量組提高SnoN蛋白水平更顯著（P<0.01）。見表1、圖3。

3.4 各組細(xì)胞Smurf2的mRNA水平比較 與空白對照組比較，模型組Smurf2表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，芪歸方有效組分及潑尼松組Smurf2表達(dá)水平顯著下降（P<0.01）。與潑尼松1 μmol/L處理組比較，芪歸方有效組分中高劑量組Smurf2表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。見表2。

4 討論

近年來我國人口老齡化加速，加之空氣質(zhì)量變差，IPF在我國發(fā)生率呈上升趨勢。中醫(yī)學(xué)無IPF的病名，根據(jù)其發(fā)生發(fā)展過程所表現(xiàn)的證候特點，可歸屬于“肺痹”“肺痿”等病范疇[5]。肺痿從本虛而言，肺氣受損，津液耗傷;肺痹從邪實而言，痹阻不通，氣血失暢。肺為嬌臟，易感受外邪如風(fēng)寒濕邪氣，客于肺引發(fā)痰濁、瘀血停滯于內(nèi)，久則產(chǎn)生肺痹之征，邪氣膠著不解，損傷人體正氣，肺葉失于濡養(yǎng)，日久而痿。故臨證時當(dāng)把握住氣虛血瘀的核心病機(jī)，氣虛為本，血瘀為標(biāo)，從氣虛血瘀論治是治療IPF的重要方法。治療時在活血化瘀通絡(luò)同時，補(bǔ)虛扶正，黃芪味甘而薄，具補(bǔ)氣之功;當(dāng)歸味甘而重，故專能補(bǔ)血;其氣輕而辛，故又能行血，且近年來許多體內(nèi)和體外研究表明黃芪、當(dāng)歸單藥及其組合用藥等能治療和預(yù)防肺纖維化。而黃芪甲苷和阿魏酸為其主要有效活性成分之一，現(xiàn)代研究表明[6]，當(dāng)歸和黃芪配伍后，復(fù)方中的組分絕大部分來源于各單味藥的化學(xué)成分，阿魏酸和黃芪甲苷分別是中藥當(dāng)歸和黃芪的代表性成分，是芪歸方（當(dāng)歸補(bǔ)血湯）中的主要有效成份。Dong H等[7]取黃芪的有效成分黃芪甲苷和當(dāng)歸的活性成分阿魏酸，通過利用中效原理（Chou-Talalay聯(lián)合指數(shù)法）優(yōu)選了黃芪甲苷和阿魏酸配伍劑量，組成芪歸方有效組分方劑。有多項研究[8]對芪歸方的活性成分（黃芪甲苷和阿魏酸）的含量進(jìn)行了測定，在芪歸方（黃芪：當(dāng)歸5∶1，當(dāng)歸補(bǔ)血湯）制備和純化之后，黃芪甲苷和阿魏酸分別為2∶3。在肺纖維化發(fā)病中TGF-β1[9]是公認(rèn)的最關(guān)鍵最直接的多功能促纖維增生細(xì)胞因子，在纖維形成過程中起重要作用;其在受累器官中的表達(dá)持續(xù)升高，會導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的反復(fù)破壞、修復(fù)進(jìn)而引起肺纖維素的沉積，因此常用于構(gòu)建肺纖維化細(xì)胞模型。肌成纖維細(xì)胞以表達(dá)α-SMA為特征，在TGF-β1的刺激下合成增多，造成細(xì)胞外基質(zhì)的異常沉積，進(jìn)一步加速肺纖維化的發(fā)展。本實驗采用TGF-β1進(jìn)行細(xì)胞模型的構(gòu)建，實時定量PCR法檢測結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞增殖水平較正常對照組明顯增高，表達(dá)大量的α-SMA，分化明顯，提示造模成功。經(jīng)不同濃度的芪歸方有效組分處理，MRC-5細(xì)胞增殖降低，以芪歸方有效組分中高濃度組作用更為明顯，提示芪歸方有效組分可通過抑制MRC-5的增殖，減緩肺纖維化進(jìn)展，可能與其抑制ECM異常蓄積有關(guān)。

Smad蛋白[10]是TGF-β信號傳導(dǎo)通路中最關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，是其目的轉(zhuǎn)錄基因的主要信號傳導(dǎo)蛋白，從而建立起胞膜與胞核之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，TGF-β1信號傳導(dǎo)通路發(fā)揮效應(yīng)時大部分需要下游Smad蛋白參與。Smad7[11]可與TGF-βⅠ類受體緊密結(jié)合，在TGF-β1刺激后阻止Smads蛋白（Smad2/3）發(fā)生磷酸化，是TGF-β信號傳遞的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子，共同調(diào)節(jié)α-SMA的表達(dá)。SnoN是[12]TGF-β1信號通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，在組織細(xì)胞存活中，SnoN表達(dá)的調(diào)節(jié)有重要作用，與Smad蛋白相互作用，在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均可抑制TGF-β1信號通路的激活、負(fù)向調(diào)控TGF-β1信號通路，而TGF-β1通過多種方式調(diào)節(jié)SnoN的表達(dá)，利用SnoN靶向調(diào)控TGF-β1/Smad信號通路，可抑制組織纖維化的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)[13]，SnoN過表達(dá)的模型可抑制組織細(xì)胞纖維化，而減少SnoN的表達(dá)則有促進(jìn)組織纖維化功能。本研究通過Western blot檢測各組細(xì)胞Smad7、SnoN檢測發(fā)現(xiàn)，TGF-β1處理組Smad7、SnoN蛋白表達(dá)水平下降，不同濃度芪歸方有效組分處理TGF-β1誘導(dǎo)的MRC-5后，上調(diào)Smad7、SnoN的表達(dá)，有效地阻止下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，提示芪歸方有效組分可阻斷TGF-β1/Smads在纖維化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低細(xì)胞對TGF-β1的反應(yīng)性，而起抗肺纖維化的作用。

泛素-蛋白酶體途徑（Ubiquitin Proteasome Pathway，UPP）是真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)選擇性降解的重要途徑，在TGF-β1/Smad信號傳導(dǎo)通路中，E3泛素連接酶通過選擇性介導(dǎo)Smads蛋白、TGF-β受體等的泛素化降解，在TGF-β1/Smad信號活性的調(diào)節(jié)中起樞紐作用。Smurf2是泛素連接酶E3的一種，在多種纖維化疾病中表達(dá)異常，可選擇性通過泛素化降解Smad7、SnoN、Ski（Sloan-Kettering Institute proto-oncogene）等影響了TGF-β1信號傳導(dǎo)通路，其功能失調(diào)會導(dǎo)致TGF-β1/Smad信號傳導(dǎo)異常，參與了纖維化疾病的發(fā)生、發(fā)展[14]。研究發(fā)現(xiàn)，Smurf2與ECM積聚形成IPF密切相關(guān)。在TGF-β誘導(dǎo)人肺成纖維細(xì)胞活化實驗中，Smurf2[14]促進(jìn)了TGF-β1/Smad信號通路重要分子TGF-β1的上調(diào)表達(dá);而通過RNA干擾技術(shù)沉默Smurf2表達(dá)，則可見MRC-5細(xì)胞α-SMA和CollagenI（I型膠原蛋白）表達(dá)下降，Smad7蛋白則可見表達(dá)升高，TGF-β1的表達(dá)被抑制，推測Smurf2可能通過泛素化降解Smad7和SonN蛋白分子，調(diào)控TGF-β1/Smad信號通路;而用泛素蛋白酶體抑制劑MG132可阻止Smad7和SnoN泛素化降解，抑制TGF-β1誘導(dǎo)人肺成纖維細(xì)胞活化。本研究顯示，與正?？瞻捉M比較，模型組Smurf2蛋白增加，促進(jìn)Smurf2介導(dǎo)的Smad7、SnoN蛋白發(fā)生泛素化降解過程，使Smad7、SnoN蛋白水平降低，不能發(fā)揮其負(fù)調(diào)控IPF的作用，加速IPF進(jìn)程。既往研究提示Smurf2通過調(diào)節(jié)Smad信號通路上的負(fù)調(diào)節(jié)因子SnoN和Smad7蛋白的降解，這和以往的研究相符[15]。經(jīng)芪歸方有效組分干預(yù)后，與模型組比較，Smurf2蛋白mRNA水平有下調(diào)，阻止Smad7和SnoN進(jìn)一步泛素化降解，SnoN、Smad7蛋白水平增加，從而上調(diào)恢復(fù)SnoN、Smad7蛋白水平，延緩IPF。

綜上所述，本研究提示TGF-β1誘導(dǎo)人肺成纖維細(xì)胞活化后出現(xiàn)增殖能力下降，并伴SnoN、Smad7蛋白減少，Smurf2升高，芪歸方有效組分能有效抑制體外培養(yǎng)的人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5生長，通過阻止Smurf2介導(dǎo)的SnoN、Smad7泛素化，恢復(fù)其表達(dá)，調(diào)控TGF-β1/Smad信號途徑，從而發(fā)揮對肺纖維化治療效果，這從新的視角闡明了芪歸方有效組分抑制肺纖維化發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，為進(jìn)一步深入研究芪歸方抗肺纖維化的作用機(jī)制提供了一定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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（2020-04-25收稿 責(zé)任編輯：王楊）